CN105412944A

CN105412944A - miR-451a细胞在非小细胞肺癌中的作用

Info

Publication number: CN105412944A
Application number: CN201510904332.7A
Authority: CN
Inventors: 金由辛; 金言; 王强; 党启; 李雪
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明涉及miR-451a细胞在非小细胞肺癌中的作用。miR-451a在A549细胞中过表达miR-451a能够显著地抑制A549细胞迁移。利用生物信息学分析手段，预测到miR-451a通过与靶基因CAB39？mRNA的3′-UTR区域互补，从而抑制了靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA，经过双萤光素酶报告基因系统分析和Western？Blot实验验证，确定CAB39基因为miR-451a的靶基因。最终，借助Transwell？Assay和Flow？Cytometry？Assay实验手段，证实了miR-451a在A549细胞中通过下调CAB39基因发挥抑制细胞迁移的功能，提供一种新颖的精准治疗研究及治疗方案。该发明在临床上，为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，寻找药物靶点以及在肿瘤免疫治疗等领域提供了重要的研究指导和应用价值。

Description

miR-451a细胞在非小细胞肺癌中的作用

技术领域

本发明涉及一种miR-451a细胞在非小细胞肺癌中的应用。

背景技术

肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。其中约80%的肺癌为非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC），由于缺乏有效的针对肺癌的早期诊断手段，且NSCLC具有较强的转移能力，其5年存活率仅为15%-30%。对于NSCLC患者及时采取治疗将极大地提高病人的生存率，并改善病人的健康状况。因而，针对NSCLC早期诊断与肿瘤转移机制的相关研究刻不容缓。

微RNA（microRNA，miRNA）功能调控是当前生命科学的重要前沿。miRNA是一类长约22nt的内源性非编码小分子RNA，其通过特异的靶向作用于编码RNA（mRNA），在转录后水平上调控基因表达。miRNA广泛的存在于真核生物中，且大多具有较高的保守性，在哺乳动物中，约30%的蛋白质编码基因受到miRNA的调控。同时，miRNA在诸多生物进程中发挥至关重要的作用，例如控制发育，胚胎生成、细胞分化增殖以及凋亡等。针对miRNA的相关功能和机制研究，将是解决人类癌症的发病机理与个性化治疗等问题的关键。

经过对已报导文献的总结，以及在小鼠诱导肿瘤模型、人类转移性肺癌组织样品、常见非小细胞肺癌细胞系中的含量检测，发现miR-451a的表达量相较于正常肺部组织细胞明显降低，显示了其潜在的抑癌作用。miR-451a在抑制肺癌细胞迁移的过程中发挥重要的调控作用，同时还参与到多功能转录因子调控网络，成为NSCLC细胞中重要的调控因子。针对miR-451a作用机制的相关研究，不仅有助于肺癌的早期诊断与治疗策略，并且在控制NSCLC转移方面具有极大的临床应用价值,为非小细胞肺癌的精准治疗提供新颖的研究方向和应用指导。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种miR-451a基因在制备抑制非小细胞肺癌癌细胞迁移药物中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种miR-451a基因在制备下调A549细胞系中CAB39基因表达水平药物中的应用。

本发明的实施步骤如下所述：

1.首先，通过Solexa测序技术，获得miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中的表达差异。然后，利用qRT-PCR技术，检测了41组人肺癌组织临床样本与相应的癌旁组织，并将这些样品按照TNM分期进行分类。研究发现，在NOM1分组中，miR-451a表达水平相较于癌旁组织下降到30.64%，同时显著性较好P<0.01（PValue=0.0036）。最后，在正常的肺组织细胞系Beas-2B和常见的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、Spca-1、Hcc827、95-D中通过qRT-PCR技术，检测miR-451a表达量的变化。发现miR-451a在各个细胞系中的表达量均显著下降，并且相较于正常的肺组织细胞系Beas-2B，A549细胞中miR-451a表达量下降最多（下降了约42%）。

2.过表达miR-451a后，检测其对于A549细胞迁移的变化。在A549细胞中转染miR-451amimics与mimicsNegativeControl（NC），通过细胞划痕实验发现，miR-451a能够显著地抑制A549细胞的迁移。

3.通过在线预测软件starBase（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测到CAB39mRNA的3′-UTR中含有miR-451a序列的结合位点。将CAB39野生型3′-UTR以及含有种子序列突变的3′-UTR构建到pGL-3报告基因的下游，通过双荧光素酶报告基因系统，分析发现带有CAB3野生型3′-UTR报告基因受到miR-451a调控，而突变型则不受miR-451a调节。最后，在A549细胞中过表达miR-451a，WesternBlot结果证明CAB39受到miR-451a的调控。上述结果证实，CAB39确为miR-451a的靶基因。

4.通过TranswellAssay检测到，在A549细胞中过表达miR-451a将引起细胞迁移能力的下降，而过表达CAB39则会显著地促进细胞迁移。最终，在A549细胞中同时过表达miR-451a与CAB39，通过TranswellAssay检测到细胞迁移能力下降。以上结果证实，miR-451a能够有效地回复由CAB39引起的细胞迁移能力增强，其在调节A549细胞迁移的过程中发挥重要作用。

综上所述，miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型、人类转移性肺癌组织样品以及常见的非小细胞肺癌细胞系中均特异性低表达,为非小细胞肺癌远端迁移的判断提供重要的实验依据。实验证明，过表达miR-451a能够显著地抑制细胞迁移。同时，通过双荧光素酶报告基因系统、WesternBlot等实验验证了CAB39基因为miR-451a的靶基因。本实验首次证实了miR-451a通过下调CAB39基因进而发挥抑制肿瘤细胞迁移的功能，该发现对于肺癌的扩散、转移与发生、发展机制研究做出一定贡献。

本发明的其它方面将在下文有详细的描述。需要指出的是，上述以及下文的各具体特征的任意组合也在本发明范围之内。

附图说明

图1miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型、人类转移性肺癌组织样品以及常见的非小细胞肺癌细胞系中的表达量

(A)miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中的表达量。其中L822T1是基因型KRAS^+/+的良性肿瘤，L703T2是基因型LKB1^-/-/KRAS^+/+的恶性肿瘤，L903T1为P53^-/-/KRAS^+/+的恶性肿瘤。

(B)miR-451a在41对肺癌组织临床样本中的表达量，临床样本已按照TNM分期进行分类。

(C)miR-451a在Beas-2B、A549、H1299、Spca-1、Hcc827、95-D细胞中的表达量。

上述结果显示miR-451a在人类转移性肺癌组织及常见肺癌细胞系中的表达量均明显降低。

图2miR-451a对A549细胞迁移的影响

在A549细胞中分别转染NC与miR-451amimics，通过细胞划痕实验检测miR-451a对于细胞迁移的作用。

结果表明，miR-451a能够显著地抑制A549细胞的迁移。

图3miR-451a靶向作用于CAB393′-UTR

(A)miR-451a与CAB39野生型和突变型3′-UTR结合序列示意图。

(B)通过双萤光素酶报告基因系统分析，miR-451a能够下调含有野生型CAB393′-UTR的报告基因表达，而对于含有突变型CAB393′-UTR的报告基因表达没有影响。

(C)在A549细胞中过表达miR-451a，将引起CAB39蛋白水平的下降。分别转染NC与miR-451amimics，通过WesternBlot检测CAB39的蛋白含量。

上述结果证实，CAB39确为miR-451a的靶基因。

图4miR-451a通过CAB39发挥抑制细胞迁移的作用

(A)通过TranswellAssay检测，在A549细胞中过表达miR-451a对于细胞迁移能力的影响。

(B)通过TranswellAssay检测，在A549细胞中过表达CAB39对于细胞迁移能力的影响。

(C)通过TranswellAssay检测，同时过表达miR-451a与CAB39后A549细胞迁移能力的变化情况。

以上结果证实，miR-451a能够有效地回复由CAB39引起的细胞迁移能力增强，并且在调节细胞迁移中发挥重要作用。

具体实施方式

下面将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆（MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：根据Solexa测序结果，确定miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中低表达

本发明所用到的KRAS基因突变小鼠肺癌模型(L822T1、L703T2、L903T1)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。其中L822T1是基因型KRAS^+/+的良性肿瘤，L703T2是基因型LKB1^-/-/KRAS^+/+的恶性肿瘤，L903T1为P53^-/-/KRAS^+/+的恶性肿瘤。

对正常小鼠的肺组织和诱导癌变的小鼠肺组织分别取样，使用Trizol法提取组织内总RNA。具体步骤为：以Trizol裂解组织，室温放置5分钟，使组织充分裂解，获得裂解液；加入氯仿，漩涡震荡15秒，以12000g/4℃离心10分钟；离心之后吸取上层水相并加入等量异丙醇颠倒混匀，室温放置20分钟；再次以12000g/4℃离心10分钟，可见白色沉淀，弃去上清，白色沉淀即RNA；加入75%乙醇洗涤沉淀，2000g/4℃离心3分钟；弃去上清液，室温干燥沉淀5-10分钟。晾干后以DEPC水溶解沉淀即获得总RNA。

随后，对于上述方法获得的总RNA产物，本发明使用Takara公司的OneStepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit（CodeNo.D350A）进行逆转录，构建上述组织的cDNA文库，以oligodt为引物进行逆转录，通过变性反应和逆转录2步获得后续实验所需的miRNAcDNA文库。本试剂盒可对样品中的miRNA及其它微小非编码RNA进行Poly(A)加尾反应，从而引入Uni-miRqPCRPrimer结合位点，可对样品中的任意miRNA进行定量PCR反应。具体操作过程如下：

（1）配置如下体系：

（2）按上表配置的相应体系，放置于Bio-RadPCR仪上，以37℃-60min，85℃-5s条件进行逆转录。

（3）用RNasefreeH₂O稀释逆转录产物至800μl，储存于-20℃，用于后续实验。

miRNA检测使用Takara公司的SYBRPrimeSciptmiRNART-PCRKit（CodeNo.RR716）进行，本试剂中含有TaqDNA聚合酶、dNTPmix以及SYBRGreendye。该方法使用的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统。具体操作为：

（1）配置如下体系：

（2）上机检测：按照下列步骤设定仪器，检测。

①95℃,0:30s;预变性

②95℃,0:10s;变性

③53℃,0:30s;退火

④Plateread读取数据

⑤Goto2,42X回到步骤2.循环42次

⑥55℃,0:30s;

⑦55℃,0:05s+0.5℃/cycleRamp0.5℃/s;

⑧Plateread;读取数据

⑨Goto7,80X.回到步骤7.循环80次

以癌旁为正常参照，以U6为内参基因，使用ΔΔCt法分析检测数据，检测miR-451a在人类非小细胞肺癌组织临床样本中的表达情况。

本实验检测所用的引物：miR-451aForward：5'-AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3'，Reverse：Uni-miRqPCRprimer；

实验使用U6作为内参基因，U6Forward：5'-TACCCTGTAGATCCGAATTTGTG-3'，Reverse：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

在每个样品中分别检测U6及miR-451a的Ct值。结果处理方法如下：

（1）计算每个样品的ΔCt值。

ΔCt=Ct_miR-451a-Ct_U6

（2）用肿瘤组织的ΔCt值减去癌旁组织的ΔCt值，得到ΔΔCt。

ΔΔCt=ΔCt_肿瘤-ΔCt_癌旁

（3）计算2^-ΔΔCt值，判断候选miR-451a在肿瘤组织中的表达情况。

对样品进行Solexa法测序（Solexa测序由华大基因公司完成），测序结果显示，miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中的表达量显著降低。（图1A）

实施例二：检测miR-451a在人类非小细胞肺癌组织临床样本中的表达情况

本实例涉及的41对肺癌及癌旁组织皆来自于上海市胸科医院。

本实例使用实施例一中的Trizol法提取组织的总RNA，并以Takara公司的OneStepPrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit（CodeNo.D350A）进行逆转录，构建上述组织的cDNA文库，以oligodt为引物进行逆转录，通过变性反应和逆转录2步获得后续实验所需的miRNAcDNA文库。

研究发现，将41例病例组织按照TNM分期进行分类，在NOM1分组中，miR-451a表达水平相较于癌旁组织下降到30.64%，并且显著性较好P<0.01（PValue=0.0036）。（图1B）

实施例三：检测常见肺癌细胞系中miRNA的表达差异

常见肺癌细胞系包括：A549、H1299、Spca-1、Hcc827、95-D等，其中，A549、Hcc827为人非小细胞肺癌细胞，Spca-1为人肺腺癌细胞，H1299为非小细胞肺癌上皮样细胞，95-D为人高转移性肺癌细胞。本实例以正常肺上皮细胞Beas-2B为参照，同时培养上述5种肺癌细胞系。细胞培养按照ATCC标准流程进行，分别培养于含10%胎牛血清的对应培养基中。细胞培养箱保持湿润，维持5%CO₂的培养状态，以37℃培养细胞。

当细胞在6cm培养皿中达到约80%密度时，使用实施例一中的Trizol法抽提细胞RNA，并使用实例一中的cDNA逆转录方法与qRT-PCR检测法检测miR-451a在常见人类非小细胞肺癌细胞系中的表达情况。

研究结果显示，以Beas-2B为参照，miR-451a在A549、H1299、Spca-1、Hcc827、95-D细胞系中表达量均有所下降（图1C）。

实施例四：miR-451a对A549细胞迁移的影响

将A549细胞均匀地铺在6孔板中，使用的培养基为DMEM。细胞培养24hours后使用lipo2000转染试剂，将NC、miR-451amimics通过无血清培养液的共孵育后转入A549细胞中。

转染步骤具体如下：（1）转染前一天，接种适当数量的细胞至培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%。（2）准备mimic-lipo2000混合液：a.稀释miRNAmimic：用50μl不含血清培养基DMEM稀释miRNAmimics，使加入细胞中的终浓度为60nmol/L轻轻混匀，室温孵育5min；b.稀释lipo2000：用50μl不含血清的DMEM稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min。（3）将miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有细胞及培养液的培养孔中，轻轻混匀；（4）将培养板置于37℃的CO₂培养箱中。培养6h后，将孔里含有mimics-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基。

转染后，待细胞密度达到100%时，使用灭菌的枪头比着直尺均匀划痕，并做好相应的标记。然后，用PBS洗去漂浮的细胞，加入新的培养基。随后，放入37℃5%CO₂培养箱中继续培养。24hours后取出样品，使用倒置显微镜观察同一区域细胞的生长状态，检测miR-451a对于细胞迁移的影响。进行三组重复试验。

实验结果显示，相较于对照组，过表达miR-451a显著地抑制了A549细胞的迁移（图2）。

实施例五：双荧光素酶报告基因系统分析

将CAB39mRNA的3′-UTR（482bp）克隆到pGL-3质粒上，该质粒含有SV40的启动子，CAB39的3′-UTR区域包含了miR-451a与之结合的位点。使用lipo2000转染试剂将miR-451amimics与构建好的质粒共转入HEK-293T细胞中，并同时转入pRL质粒作为背景信号，转染6hours后更换新鲜培养液。转染48hours后，采用Promega公司的双荧光素酶报告基因系统分析试剂盒检测pGL和pRL的荧光表达情况。转染质粒的终浓度为400nmol/L，miRNAmimics的终浓度为20nmol/L。实验结果显示，转染了miR-451a的HEK-293T细胞中，双荧光素酶的表达显著低于对照组。随后，利用突变试剂盒构建CAB393′-UTR的点突变，用lipo2000转染试剂将miR-451amimics与构建好的点突变质粒共转入HEK-293T细胞中。转染48hours后，采用Promega公司的双荧光素酶报告基因系统分析试剂盒检测，结果发现转染了miR-451a的HEK-293T细胞中，双荧光素酶的表达量较对照组没有显著变化。

上述实验结果都证明了CAB39为miR-451a的靶基因（图3B）。

实施例六：WesternBlot验证miR-451a对于A549细胞内源CAB39基因的抑制作用

将A549细胞均匀地铺在6孔板中，每个样品三次重复。细胞培养24hours后，分别转染miR-451amimics和NC。48hours后收集、裂解细胞，并定量各样品中的蛋白含量。定量蛋白采用Lowry法，使用CAB39的多抗进行检测，该抗体由ABclonal公司生产。本实验采用12%SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。转膜缓冲液和膜清洗液的配制均参照分子克隆。CAB39蛋白的抗体按照1:800稀释，GAPDH蛋白的抗体按照1:1000稀释。所采用的二抗带有HRP标记，按照1:10000稀释。采用Milipore的化学发光剂显色。

WesternBlot实验结果表明，miR-451a对于A549细胞内源CAB39基因有抑制作用（图3C）。

实施例七：检测单转miR-451a、单转CAB39，以及共转miR-451a与CAB39对于A549细胞迁移作用

使用Corning公司生产的8.0um孔径Transwell小室（CodeNo.3422），检测miR-451a和CAB39对于细胞纵向迁移能力的影响。Transwell小室的底层是一张具有通透性的聚碳酸酯膜，在上室中接种肿瘤细胞，而在下室加入胎牛血清或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室迁移，通过计数进入下室的细胞量即可反映肿瘤细胞的迁移能力。

实验的具体操作步骤为：（1）将A549细胞均匀地铺在6孔板中，每个样品三次重复。细胞培养24hours后，分别共转miR-451a-pEGFP（绿光）和CAB39-pmCherry（红光），以及pEGFP、pmCherryNegativeControl。转染24hours后，使用Bio-Rad细胞计数仪计数细胞，每个Transwell小室中初始接种5×10⁴个细胞，上室中使用0.5%FBS浓度的DMEM培养基，下室则使用10%FBS浓度的DMEM培养基。（2）继续培养24hours后，收集Transwell小室内培养基放入离心管A；取出Transwell小室，用PBS清洗小室外侧，清洗液和下层培养基一起收集到离心管B。（3）用胰酶消化附着于24孔板上的细胞，合并收集到离心管B；同时胰酶消化膜上层细胞，合并收集到离心管A。（4）通过Bio-Rad细胞计数仪计数离心管A、B中的细胞，其中离心管A为全部的上层细胞，离心管B为全部的下层细胞。（5）通过流式细胞仪检测离心管A、B中的细胞：获得单转miR-451a-pEGFP、单转CAB39-pmCherry，以及共转miR-451a-pEGFP与CAB39-pmCherry的细胞占总细胞量的比例。

该实验操作最大限度的避免了细胞增殖对于迁移的潜在影响，因而提供了更加真实可信的细胞迁移实验结果。TranswellAssay实验结果表明，miR-451a能够有效地回复由CAB39引起的细胞迁移能力增强，并且在调节细胞迁移中发挥重要作用（图4A、B、C）。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims

1.一种miR-451a制备调控下游靶基因CAB39表达药物中的应用。

2.一种miR-451a基因在制备抑制非小细胞肺癌迁移药物中的应用。

3.一种miR-451a基因在制备非小细胞肺癌靶标药物的应用。

4.一种miR-451a基因在制备治疗或预防CAB39基因异常表达的非小细胞肺癌药物中的应用。

5.如权利要求4所述的用途，一种miR-451a基因在制备治疗或预防CAB39基因异常表达的非小细胞肺癌的组合物或试剂盒中的用途。

6.miR-451a抑制剂为miR-451a的反义核酸,在制备治疗或预防CAB39基因异常表达的非小细胞肺癌药物中的应用。

7.如权利要求6所述的用途，miR-451a抑制剂在制备治疗或预防CAB39基因异常表达的非小细胞肺癌的组合物或试剂盒中的用途。