CN103703142A

CN103703142A - 检测肺癌的方法

Info

Publication number: CN103703142A
Application number: CN201280014870.3A
Authority: CN
Inventors: 伯恩哈德·米绍; 奥利维耶·德尔富尔
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 2011-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2014-04-02
Also published as: EP2668295A2; EP2668295A4; US9365903B2; JP2014513521A; WO2012103355A3; US20140349869A1; CA2825522A1; US20120244530A1; WO2012103355A2; AU2012211272A1

Abstract

本文提供了检测肺癌，例如非小细胞肺癌，包括鳞状细胞癌和腺癌的方法。本文还提供了检测与肺癌相关的一种或多种小RNA水平变化的方法。本文还提供了组合物和试剂盒。

Description

检测肺癌的方法

本申请要求2011年1月26日提交的美国临时申请号61/397,729；2011年1月26日提交的美国临时申请号61/436,399；和2011年8月18日提交的美国临时申请号61/525,008的优先权，所述美国临时申请通过引用整体并入本文用于任何目的。

1.背景

肺癌是男性和女性中最常见的癌症死亡原因。肺癌分为两个类别，小细胞肺癌(“SCLC”)和非小细胞肺癌(“NSCLC”)。约85%的肺癌病例被归类为NSCLC，其包括腺癌、鳞状细胞癌和腺鳞状细胞癌。

肺癌在早期难以诊断，因为肺癌可能不表现出外在症状。当症状出现时，它们可根据癌症的类别、位置和扩散模式而不同，并且因此不容易与癌症联系起来。常常，只有当肺癌已经转移时才确诊。

用于诊断肺癌的当前技术包括胸部x射线和/或计算机断层(“CT”)扫描。通常通过更具侵入性的操作，例如经胸穿刺活检或经支气管活检确认通过这些技术之一的诊断，这仍可导致对肺癌的误诊。(Butnor(2008)Arch.Pathol.Lab.Med.132:1118-1132.)

尽管治疗上有进展(例如，通过手术、化疗、放射或组合)，对肺癌的预后仍然很差，从诊出时起，仅15%的患者活过5年。在最常见的NSCLC中，腺癌发展更为迅速并且因此预后比鳞状细胞癌更差，鳞状细胞癌需要几年时间发展，并且因此更有可能在早期诊断出。

降低肺癌死亡率和发病率的一个建议是制定对高危个体(例如，吸烟或已经大量吸烟一定时间的人)的定期筛查，，以便检测并治疗无症状个体的肺癌。这样，可通过被认为是治愈的唯一现实选择的手术切除根除早期肺癌。(Field等(2008)Br.J.Cancer 99:557-562)。

仍然需要肺癌的分子标记，包括早期肺癌的标记。

2.发明概述

在一些实施方案中，提供了用于检测受试者中肺癌的存在的方法。在一些实施方案中，方法包括检测来自所述受试者的样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括将所述样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平与所述RNA的正常水平作比较。在一些实施方案中，检测到小U2的水平高于各RNA的正常水平表明受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，检测到选自13207、miR-720、miR-451和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。

在一些实施方案中，提供了一种促进受试者中肺癌的诊断的方法。在一些实施方案中，方法包括检测来自所述受试者的样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括将所述检测结果传达给执业医生以便确定所述受试者是否患有肺癌。

在一些实施方案中，方法包括检测小U2的水平。在一些实施方案中，方法包括检测13750的水平。在一些实施方案中，方法包括检测miR-720的水平。在一些实施方案中，方法包括检测miR-451的水平。在一些实施方案中，方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少两种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2和13750的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2和miR-451的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2和miR-720的水平。在一些实施方案中，方法包括检测13750和miR-451的水平。在一些实施方案中，方法包括检测13750和miR-720的水平。在一些实施方案中，方法包括检测miR-451和miR-720的水平。在一些实施方案中，方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少三种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2、miR-720和13750的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2、miR-720和miR-451的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2、miR-451和13750的水平。在一些实施方案中，方法包括检测miR-720、miR-451和13750的水平。在一些实施方案中，方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少四种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2、miR-720、miR-451和13750的水平。

在一些实施方案中，用于检测受试者中肺癌的存在的方法包括检测来自所述受试者的样本中小U2的水平，其中检测到小U2的水平高于小U2的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，方法进一步包括检测选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，其中检测到选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者肺癌的存在。在一些实施方案中，一种用于检测受试者中肺癌的存在的方法包括检测来自所述受试者的样本中13750的水平，其中检测到13750的水平低于13750的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，方法进一步包括检测选自小U2、miR-720、miR-451和13207的至少一种RNA的水平，其中检测到小U2的水平高于各RNA的正常水平，或检测到选自miR-720、miR-451和13207的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者中肺癌的存在。

在一些实施方案中，用于检测受试者中肺癌的存在的方法包括从所述受试者获得样本并将所述样本提供给实验室以检测所述样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括从所述实验室接收表明所述至少一种RNA的水平的讯息。在一些实施方案中，检测到小U2的水平高于各RNA的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，检测到选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。

在一些实施方案中，检测包括使包含选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个相邻核苷酸的至少一个多核苷酸与来自所述样本的RNA或由来自所述样本的RNA反转录的cDNA杂交，并且检测包含多核苷酸和选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA或cDNA的复合体。在一些实施方案中，小U2选自成熟小U2、成熟小U2异构体(isomir)、小U2前体及其组合。在一些实施方案中，miR-720选自成熟miR-720、成熟miR-720异构体、miR-720前体及其组合。在一些实施方案中，miR-451选自成熟miR-451、成熟miR-451异构体、miR-451前体及其组合。在一些实施方案中，13207选自成熟13207、成熟13207异构体、13207前体及其组合。在一些实施方案中，13750选自成熟13750、成熟13750异构体、13750前体及其组合。在一些实施方案中，小U2具有选自SEQ ID NO:2至20的序列。在一些实施方案中，miR-720具有选自SEQ ID NO:21和23的序列。在一些实施方案中，miR-451具有选自SEQ ID NO:24和28至30的序列。在一些实施方案中，13207具有SEQ ID NO:34的序列。在一些实施方案中，13750具有选自SEQ ID NO:35和38至41的序列。

在一些实施方案中，所述样本选自组织样本和体液。在一些实施方案中，组织样本为肺组织样本。在一些实施方案中，所述肺组织样本包括肺癌细胞。在一些实施方案中，所述体液选自血液、尿液、痰、唾液、粘液和精液。在一些实施方案中，所述样本为血液样本。在一些实施方案中，所述血液样本为血清样本。在一些实施方案中，所述血液样本为血浆样本。在一些实施方案中，所述肺癌为早期肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌为I期肺癌。在一些实施方案中，所述检测包括定量RT-PCR。

在一些实施方案中，提供了选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA用于检测受试者中肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2用于检测受试者中肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了13750用于检测受试者中肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2和13750用于检测受试者中肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2、miR-720、miR-451和13750用于检测受试者中肺癌的存在的用途。

在一些实施方案中，提供了选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA用于监测肺癌患者对治疗的反应的用途。在一些实施方案中，提供了小U2用于监测肺癌患者对治疗的反应的用途。在一些实施方案中，提供了13750用于监测肺癌患者对治疗的反应的用途。在一些实施方案中，提供了小U2和13750用于监测肺癌患者对治疗的反应的用途。在一些实施方案中，提供了小U2、miR-720和13750用于监测肺癌患者对治疗的反应的用途。在一些实施方案中，提供了小U2、miR-720、miR-451和13750用于监测肺癌患者对治疗的反应的用途。在对治疗的监测中，优选使用血液样本，例如血清。在治疗的监测中，可针对在治疗开始时测定的基线水平评估单独或共同测量的小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的水平。在一些实施方案中，在对于特定RNA而言，水平保持相同，或对于小U2而言，水平降低，或对于miR-720、miR-451、13207或13750而言，水平升高的情况中，从基线水平的变化表明对治疗有反应。在一些实施方案中，在对于小U2而言，水平升高，或对于miR-720、miR-451、13207或13750而言，水平降低的情况中，从基线水平的变化表明对治疗有抗性。

在一些实施方案中，提供了选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种RNA用于检测受试者中肺癌(任何阶段)、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了13750用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2和13750用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2和miR-720用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2和miR-451用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了13750和miR-720用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了13750和miR-451用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。在一些实施方案中，提供了小U2、miR-720、miR-451和13750用于检测受试者中肺癌、早期肺癌或I期肺癌的存在的用途。

在一些实施方案中，提供了组合物。在一些实施方案中，组合物包含至少一种靶特异性探针。在一些实施方案中，组合物包含至少一种靶特异性引物。在一些实施方案中，靶标选自U2、miR-720、miR-451、13207和13750。在一些实施方案中，组合物包含含有至少8个与选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA互补的相邻核苷酸的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个寡核苷酸。在一些实施方案中，每个寡核苷酸包含至少8个与不同RNA互补的相邻核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含含有至少8个与由选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA反转录的cDNA互补的相邻核苷酸的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个寡核苷酸。在一些实施方案中，每个寡核苷酸包含至少8个与不同cDNA互补的相邻核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一个寡核苷酸包含8至50个核苷酸、8至45个核苷酸、8至40个核苷酸、8至35个核苷酸、8至30个核苷酸或8至25个核苷酸。在一些实施方案中，提供了试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种另外组分。在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种选自酶、dNTP和缓冲液的另外组分。在一些实施方案中，酶选自逆转录酶和热稳定聚合酶。

在本文所述任何实施方案中，miR-720可为成熟miR-720，miR-451可为成熟miR-451，13207可为成熟13207，并且13750可为成熟13750。

以下描述了本发明的另外实施方案和详情。

3.附图简述

图1示出如实施例2中所述，通过qRT-PCR或微阵列测定的各种肺部原发性肿瘤中的小U2水平的图。

图2示出如实施例3中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清样本中小U2的qRT-PCR Ct值的图。

图3示出如实施例3中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中miR-451的qRT-PCR Ct值的图。

图4示出如实施例3中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中miR-720的qRT-PCR Ct值的图。

图5示出如实施例3中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中13207的qRT-PCR Ct值的图。

图6示出如实施例3中所述，图2所示数据的接收操作特征(ROC)图。

图7示出如实施例4中所述，在来自患有各种类型的癌症的癌症患者的血清中小U2的qRT-PCR Ct值的图。

图8示出如实施例4中所述，图7所示数据的ROC图。

图9示出如实施例5中所述，根据吸烟史的小U2的qRT-PCR Ct值的ROC图。

图10示出如实施例6中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中小U2和miR-451的qRT-PCR Ct值的总和的图。

图11示出如实施例6中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中小U2和miR-720的qRT-PCR Ct值的总和的图。

图12示出如实施例6中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中小U2和miR-720的qRT-PCR Ct值的总和减去13207的qRT-PCRCt值的图。

图13示出如实施例6中所述，将特异性设为100%时，用于检测肺癌的某些RNA的敏感性的图。

图14示出如实施例6中所述，(A)小U2和miR-720的组合和(B)小U2、miR-720和13207的组合的标准化Ct的图。

图15示出如实施例7中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中，小U2相对于CelmiR-39的qRT-PCRΔCt值的图。

图16示出如实施例7中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中，miR-720相对于CelmiR-39的qRT-PCRΔCt值的图。

图17示出如实施例7中所述，在来自肺癌患者和健康个体的血清中，小U2和miR-720各自相对于CelmiR039的qRT-PCRΔCt值的总和的图。

图18示出了如实施例9中所述，在来自更大群体的不同个体的血清中13750的平均Ct值的图。

图19示出如实施例9中所述，对于来自更大群体的不同个体的血清中的小U2、miR-451、miR-720和13750而言，使用Ct计算的Canon LDA-1公式的结果的图。

图20示出了如实施例10中所述，使用来自所述群体的9个“验证”个体的血清中的小U2、miR-720、miR-451和13750的组合测定的预测肺癌状态的图。

图21示出了如实施例11中所述，根据肺癌期的小U2的ΔCt值的图。

4.发明详述

4.1.检测肺癌

4.1.1.一般方法

提供了用于检测人肺癌的方法。在一些实施方案中，提供了用于检测早期肺癌的方法。在一些实施方案中，提供了检测I期肺癌的方法。在一些实施方案中，提供了用于检测很有可能进展的早期肺癌的方法。

在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451和13750的至少一种、至少两种或至少三种RNA。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2和选自miR-720、miR-451和13750的至少一种另外RNA。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2和miR-451。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2和miR-720。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2和13750。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2和选自miR-720、miR-451和13750的至少两种另外RNA。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测13750。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测13750和选自miR-720、miR-451和小U2的至少一种另外RNA。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测13750和miR-451。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测13750和miR-720。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小13750和选自miR-720、miR-451和小U2的至少两种另外RNA。在一些实施方案中，检测肺癌的方法包括检测小U2、miR-720、miR-451和13750。

在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的选自miR-720、miR-451和13750的至少一种、至少两种或至少三种RNA。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的miR-720。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的miR-451。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的13750。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的miR-720和miR-451。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的miR-720和13750。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的miR-451和13750。在一些实施方案中，所述方法包括检测高于正常水平的小U2和低于正常水平的miR-720、miR-451和13750。

在一些实施方案中，所述方法包括检测低于正常水平的13750。在一些实施方案中，所述方法包括检测低于正常水平的13750和低于正常水平的选自miR-720、miR-451和13207的至少一种、至少两种或至少三种RNA。在一些实施方案中，所述方法包括检测低于正常水平的13750和低于正常水平的选自miR-720和miR-451的至少一种或至少两种RNA。在一些实施方案中，所述方法包括检测低于正常水平的13750和miR-720。在一些实施方案中，所述方法包括检测低于正常水平的13750和miR-451。在一些实施方案中，所述方法包括检测低于正常水平的13750、miR-451和miR-720。

在一些实施方案中，测定血清中一种或多种RNA的水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测高于正常水平的至少一种另外靶RNA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测低于正常水平的至少一种另外靶RNA。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测成熟微RNA和微RNA前体。在一些实施方案中，所述方法包括检测成熟微RNA。

在一些实施方案中，在本文所述任何方法中，miR-720为成熟miR-720。在一些实施方案中，在本文所述任何方法中，miR-451为成熟miR-451。在一些实施方案中，在本文所述任何方法中，13207为成熟13207。在一些实施方案中，在本文所述任何方法中，13750为成熟13750。

发明人最初致力于鉴定来自肺癌患者的血清中存在的相对于来自健康个体的血清水平更高或更低的微RNA。对来自肺癌患者血清的小RNA测序后，发现以较高水平存在的其中一种小RNA具有与U2 snRNA中发现的序列相同的序列，并且与微RNA miR-1290有一个核苷酸不同。为方便起见，在2011年1月26日提交的美国临时申请号61/397,729中将这些小U2 RNA包括在“miR-1290种类”的定义中。为了更精确地鉴定这些小RNA的起源，在本申请中已经将它们更名为“小U2 RNA”。虽然本文已将小RNA更名，但是从美国临时申请号61/397,729显而易见，在提交申请时发明人意识到这些不同于miR-1290的特殊RNA在来自肺癌患者的血清中以增加的水平存在。此外，在来自肺癌患者的原发肺癌组织或血清中miR-1290似乎不会升高。因此，miR-1290似乎并非是肺癌的标记。

在本文的序列中，“U”和“T”可交换使用，以致两个字母均表示该位置的尿嘧啶或胸腺嘧啶。本领域的技术人员将从上下文和/或预期用途理解意指尿嘧啶还是胸腺嘧啶和/或在序列中的该位置应使用尿嘧啶还是胸腺嘧啶。例如，本领域的技术人员将理解天然RNA分子通常包括尿嘧啶，而天然DNA分子通常包括胸腺嘧啶。因此，在微RNA序列包括“T”的情况下，本领域的技术人员将理解，在天然微RNA的该位置很可能是尿嘧啶。

如本文所使用，术语“小U2”和“小U2 RNA”可交换使用并且指具有全长U2 snRNA序列的介于12和40个之间的相邻核苷酸的多核苷酸。

5′-AUCGCUUCUC GGCCUUUUGG CUAAGAUCAA GUGUAGUAUC UGUUCUUAUCAGUUUAAUAU CUGAUACGUC CUCUAUCCGA GGACAAUAUA UUAAAUGGAU UUUUGGAGCAGGGAGAUGGA AUAGGAGCUU GCUCCGUCCA CUCCACGCAU CGACCUGGUA UUGCAGUACCUCCAGGAACG GUGCACCC-3′(SEQ ID NO：1)

在一些实施方案中，小U2具有全长U2 snRNA序列的介于15和35个之间的相邻核苷酸。在一些实施方案中，小U2具有全长U2snRNA序列的介于18和30个之间的相邻核苷酸。在一些实施方案中，通过U2 snRNA多核苷酸的加工形成小U2 RNA。术语“小U2”还包括最终转录后修饰或编辑后的U2 snRNA的任何小U2产物。

在一些实施方案中，小U2RNA包含核心序列：

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：2)

其中在5’端有0至3个来自U2 snRNA序列的另外相邻核苷酸，而在3’端有0至9个来自U2 snRNA序列的另外相邻核苷酸。

非限制示例性小U2 RNA具有序列：

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAUGGAAU-3′(SEQ ID NO：3)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAU-3′(SEQ ID NO：4)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：5)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：6)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：7)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：8)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAU-3′(SEQ ID NO：9)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：10)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：11)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：12)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAU-3′(SEQ ID NO：13)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：14)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：15)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：16)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：17)

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：18)

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：19)

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：20)

如实施例中证明，使用微阵列和定量RT-PCT，在某些肺癌患者中检测到小U2水平升高。

如本文所使用，术语“miR-720”包括miR-720前体、成熟miR-720、成熟miR-720异构体、miR-720^*和通过miR-720前体的加工形成的任何其它RNA，以及最终转录后修饰或编辑后的miR-720前体的任何产物。成熟miR-720具有序列：

5′-UCUCGCUGGGGCCUCCA-3′(SEQ ID NO：21)

为miR-720的微RNA前体形式的miR-720前体具有序列：

5′-CCGGAUCUCA CACGGUGGUG UUAAUAUCUC GCUGGGGCCU CCAAAAUGUUGUGCCCAGGG GUGUUAGAGA AAACACCACA CUUUGAGAUG AAUUAAGAGUCCUUUAUUAG-3′(SEQ ID NO：22)。

miR-720前体具有以下结构，其中成熟miR-720序列用粗体显示。

miR-720^*形式源自miR-720前体上与成熟miR-720相对的链。另一示例性miR-720具有序列：

5′-AUCUCGCUGGGGCCUCCA-3′(SEQ ID NO：23)。

如实施例中证明，使用(例如)定量RT-PCT，在一大群肺癌患者中检测到至少一种成熟miR-720水平降低。

如本文所使用，术语“miR-451”包括miR-451前体、成熟miR-451、成熟miR-451异构体、miR-451^*和通过miR-451前体的加工形成的任何其它RNA，以及最终转录后修饰或编辑后的miR-451前体的任何产物。成熟miR-451具有序列：

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3′(SEQ ID NO：24)。

为miR-451的微RNA前体形式的miR-451前体具有序列：

5′-CUUGGGAAUG GCAAGGAAAC CGUUACCAUU ACUGAGUUUA GUAAUGGUAAUGGUUCUCUU GCUAUACCCA GA-3′(SEQ ID NO：25)。

miR-451前体具有以下结构，其中成熟miR-451序列用粗体显示。

miR-451^*形式源自miR-451前体上与成熟miR-451相对的链，例如：

5′-UAAUGGUAAUGGUUCUCUUG-3′(SEQ ID NO：26)；和

5′-UUUAGUAAUGGUAAUGGUUCU-3′(SEQ ID NO：27)。

其它示例性miR-451RNA具有序列：

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU-3′(SEQ ID NO：28)；

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGU-3′(SEQ ID NO：29)；和

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAG-3′(SEQ ID NO：30)。

如实施例中证明，使用(例如)定量RT-PCR，检测到至少一种成熟miR-451在来自某些肺癌患者的初生组织中水平降低，并且在一大群肺癌患者中水平降低。

如本文所使用，术语“13207”包括13207前体、成熟13207、成熟13207异构体、13207^*和通过13207前体的加工形成的任何其它RNA，以及最终转录后修饰或编辑后的13207前体的任何产物。成熟13207(也称为“13207-R”)具有序列：

5′-UGUCUUUCCUUGUUGGAGCAGG-3′(SEQ ID NO：31)。

为13207的微RNA前体形式的13207前体具有序列：

5′-GCCCCCCAAA AUGCUUCUGU ACCCCUGCCC CAACAAGGAA GGACAAGAGGUGUGAGCCAC ACACACGCCU GGCCUCCUGU CUUUCCUUGU UGGAGCAGGGAUGUAGAAGC ACUUGCCGCA G-3′(SEQ ID NO：32)。

13207^*形式源自13207前体上与成熟13207相对的链，例如：

5′-TGCCCCAACAAGGAAGGACAAG-3′(SEQ ID NO：33)；和

5′-TGCCCCAACAAGGAAGGACAAGA-3′(SEQ ID NO：34)。

另一示例13207具有序列：

5′-UCCUGUCUUUCCUUGUUGGAGC-3′(SEQ ID NO：80)

用SEO ID NO：80表示的13207作为miR-5699存放在MirBase中。如实施例中证明，使用(例如)定量RT-PCT，检测到至少一种成熟13207在某些肺癌患者中水平降低。

如本文所使用，术语“13750”包括13750前体、成熟13750、成熟13750异构体、13750^*和通过13750前体的加工形成的任何其它RNA，以及最终转录后修饰或编辑后的13750前体的任何产物。成熟13750(也称为“13750-L”)具有序列：

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGCT-3′(SEQ ID NO：35)。

为13750的微RNA前体形式的13750前体具有序列：

5′-GGCCTGCGAGGGAGCTGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGCTGTGTGTGTCCAGCCCTGACCTGTCCTGTTCTGCCCCCAGCCCCTCACAGTGCT-3′(SEQID NO：36)。

13750^*形式(也称为“13750-R”)源自13750前体上与成熟13750相对的链，例如：

5′-GCCCTGACCTGTCCTGTTCTG-3′(SEQ ID NO：37)；和

5′-GCCCTGACCTGTCCTGTTCT-3′(SEQ ID NO：79)。

其它示例性成熟13750RNA具有序列：

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGC-3′(SEQ ID NO：38)；

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAG-3′(SEQ ID NO：39)；

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAA-3′(SEQ ID NO：40)；和

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGA-3′(SEQ ID NO：41)。

用SEQ ID NO：35表示的13750-L作为miR-4732-5p存放在MirBase中而用SEQ ID NO：37表示的13750-R作为miR-4732-3p存放在MirBase中。如实施例中证明，使用(例如)定量RT-PCT，检测到至少一种成熟13750在某些肺癌患者中水平降低。

在本公开中，“选自……的序列”涵盖“选自……的一个序列”和“选自……的一个或多个序列”。因此，当使用“选自……的序列”时，应理解，可选择一个或一个以上的所列序列。

如此处所使用，列表例如“选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA”旨在涵盖“选自以下的至少一种RNA：至少一种小U2、至少一种miR-720、至少一种miR-451、至少一种13207和至少一种13750”，其中小U2、miR-720、miR-451、13207和13750如以上所定义。因此，在一些实施方案中，选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA可包括(例如)成熟miR-720和miR-720前体；或可包括(例如)成熟miR-720、miR-720前体和成熟miR-451等。

在本公开中，为了方便用术语“靶RNA”指小U2、miR-720、miR-451、13207和13750并且也指其它靶RNA。因此，应理解，当在靶RNA方面提出讨论时，该讨论特别旨在涵盖小U2、miR-720、miR-451、13207、13750和/或其它靶RNA。

在一些实施方案中，检测到靶RNA的水平高于靶RNA的正常水平表明样本中肺癌的存在。在一些实施方案中，检测到靶RNA的水平低于靶RNA的正常水平表明样本中肺癌的存在。在一些实施方案中，定量地进行检测。在其它实施方案中，定性地进行检测。在一些实施方案中，检测靶RNA包括形成包含多核苷酸和选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA的互补体的核酸的复合体。在一些实施方案中，然后检测复合体的水平并且与相同复合体的正常水平作比较。

“非小细胞肺癌”或“NSCLC”是在人中发现的两类肺癌之一。约80%诊断有肺癌的患者患有非小细胞肺癌。根据其起源的细胞将NSCLC进一步分为3个亚类：(i)腺癌，其起源于内衬于肺泡并构成粘液等物质的细胞；(ii)鳞状细胞癌或表皮样癌，其起源于鳞状细胞；和(iii)大细胞癌，其可能起源于几种不同类型的大细胞。超过50%的NSCLC患者患有腺癌或鳞状细胞癌。组织学分类非鳞状细胞癌包括腺癌和大细胞癌。

癌症可分为临床期和病理期。临床期基于关于肿瘤的所有可用信息，例如通过身体检查、放射学检查、内窥镜检查等搜集的信息。病理期基于肿瘤的微观病理学。

TNM(肿瘤、结节、转移)系统按3个参数为癌症分类—肿瘤的尺寸及其是否已经入侵邻近组织，有无累及淋巴结和转移。根据原发性肿瘤的尺寸和范围为T(肿瘤)赋值1至4的数字。为N(结节)赋值0至3的数字，其中0指未扩散至淋巴结，1为扩散至最近的淋巴结，而3为扩散至最远且数量最大的淋巴结，并且2是介于1和3之间的中间状态。对于无远处转移M(转移)赋值0，或对于超出区域淋巴结的远处转移赋值1。

对于肺癌而言，总体时期分组根据时期为癌症赋值罗马数字0、I、II、III和IV和字母A或B。0期为原位癌，其通常不形成肿瘤。IA(T1N0M0)和IB(T2N0M0)期是局部化于身体一个部位的癌症。IIA(T1N1M0)和IIB(T2N1M0和T3N0M0)期是局部化，但是更为晚期的癌症。IIIA(T1-3N2M0或T3N1M0)和IIIB(任何T4或任何N3M0)期癌症也为局部晚期。IV(任何M1)期是已经转移的癌症。如本文所使用，术语“早期癌症”指IA和IB期以及IIA和IIB期癌症。

成熟人微RNA通常由17-27个相邻核糖核苷酸构成，并且长度常常为21或22个核苷酸。虽然不欲受理论约束，但是哺乳动物微RNA如本文所述。转录编码微RNA的基因，导致生成称为“pri-微RNA”或“pri-miRNA”的微RNA前体。pri-miRNA可为包含多个pri-miRNA的多顺反子RNA的一部分。在一些情况下，pri-miRNA与茎和环形成发夹，其可能包含错配碱基。pri-miRNA的发夹结构被为RNA酶III核酸内切酶蛋白的Drosha识别。Drosha可识别pri-miRNA中的末端环并且将大约2个螺旋转角裂解为茎以生成称为“微RNA前体”或“miRNA前体”的60-70个核苷酸的前体。Drosha可用RNA酶III核酸内切酶特有的交错切口裂解pri-miRNA，产生具有5′磷酸和大约2个核苷酸的3′突出的miRNA前体茎环。茎伸出Drosha裂解位点的大约1个螺旋转角(约10个核苷酸)可能对有效加工不可或缺。随后由Ran-GTP和输出受体输出蛋白-5(Exportin-5)从细胞核将miRNA前体主动运输至细胞质。

miRNA前体可被另一种RNA酶III核酸内切酶Dicer识别。在一些情况下，Dicer识别miRNA前体的双链茎。Dicer也可识别茎环碱基处的5′磷酸和3′突出。Dicer可将末端环两个螺旋转角从茎环碱基上裂解掉，留下另一5′磷酸和大约2个核苷酸的3′突出。可能包含错配的所得siRNA样双链体包含成熟微RNA和称为微RNA^*的类似尺寸片段。微RNA和微RNA^*可源自pri-miRNA和miRNA前体的相对臂。然后将成熟微RNA载至RNA诱导的沉默复合体(“RISC”)，核糖核蛋白复合体上。在一些情况下，微RNA^*也具有基因沉默或其它活性。

除微RNA外，非限制示例性小细胞RNA包括小核RNA、tRNA、核糖体RNA、snoRNA、piRNA、siRNA和通过加工那些RNA的任一种形成的小RNA。在一些实施方案中，靶RNA为小细胞RNA。

在一些实施方案中，可测量一次或多次从患者收集的样本中的靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA，以监测患者中肺癌的状态或进展。

在一些实施方案中，使用常用于收集肺部组织的一种或多种技术，例如支气管镜检查、支气管冲洗、刷检或经支气管针吸活检获得待试样本。在一些实施方案中，通过支气管肺泡灌洗，即，用盐水冲洗气道以获得细胞，无损伤地从患者获得样本。在一些实施方案中，通过活检，例如计算机断层扫描(CT)辅助的针吸活检获得样本。

在一些实施方案中，待试样本为体液，例如血液、痰、粘液、唾液、尿液、精液等。在一些实施方案中，待试样本为血液样本。在一些实施方案中，血液样本为全血。在一些实施方案中，血液样本为血细胞样本。在一些实施方案中，血液样本为血浆。在一些实施方案中，血液样本为血清。

在一些实施方案中，获得新鲜的待试临床样本。在其它实施方案中，样本为新鲜冷冻标本。在一些实施方案中，样本为组织样本，例如福尔马林固定的石蜡包埋样本。在一些实施方案中，样本为液体细胞学样本。

在一些实施方案中，本文所述方法用于肺部细胞样本，例如通过常规支气管镜检查获得的肺部细胞样本中肺癌的早期检测。在一些实施方案中，本文所述方法用于血液或血清样本中肺癌的早期检测。

在一些实施方案中，从具有下列一个或多个风险因素的个体获得待试临床样本：吸烟史、超过45岁、接触氡气、二手烟或职业性致癌物(例如，石棉、辐射、砷、铬酸盐、镍、氯甲醚、芥子气或焦炉排气)或肺部受先前疾病(例如肺结核)损伤。在一些实施方案中，从具有诊断体征或可能与肺癌相关的临床症状，例如胸部x射线和/或计算机断层(“CT”)扫描异常、咳嗽、胸部局部疼痛或声音嘶哑的个体获得临床样本。

因此，在一些实施方案中，本文所述方法可用于对无风险因素的健康个体的常规筛查。在一些实施方案中，使用本文所述方法筛查具有一个或多个上述风险因素的无症状个体。

在一些实施方案中，本文所述方法可用于检测早期肺癌。在一些实施方案中，本文所述方法可用于检测I期肺癌。在一些实施方案中，本文所述方法可用于检测I期或II期肺癌。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451和13750的至少一种、至少两种或至少三种RNA。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2和选自miR-720、miR-451和13750的至少一种另外RNA。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2和miR-451。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2和miR-720。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2和13750。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2和选自miR-720、miR-451和13750的至少两种另外RNA。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测13750。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测13750和选自miR-720、miR-451和小U2的至少一种另外RNA。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测13750和miR-451。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测13750和miR-720。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小13750和选自miR-720、miR-451和小U2的至少两种另外RNA。在一些实施方案中，检测早期肺癌的方法包括检测小U2、miR-720、miR-451和13750。

在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451和13750的至少一种、至少两种或至少三种RNA。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2和选自miR-720、miR-451和13750的至少一种另外RNA。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2和miR-451。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2和miR-720。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2和13750。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2和选自miR-720、miR-451和13750的至少两种另外RNA。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测13750。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测13750和选自miR-720、miR-451和小U2的至少一种另外RNA。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测13750和miR-451。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测13750和miR-720。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测13750和选自miR-720、miR-451和小U2的至少两种另外RNA。在一些实施方案中，检测I期肺癌的方法包括检测小U2、miR-720、miR-451和13750。

在一些实施方案中，本文所述方法可用于评估对患者中肺癌治疗的有效性。在一些实施方案中，在治疗期间的不同时间测定靶RNA水平，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA，并且与来自表现任何肺癌体征之前或开始治疗之前取自患者的存档样本的靶RNA水平作比较。在一些实施方案中，将靶RNA水平与来自通过活检取自患者的正常组织的存档样本或取自患者肺部的无肿瘤部位的组织样本的靶RNA水平作比较。理想地，正常样本中的靶RNA水平证明在靶RNA水平上无异常变化。因此，在此类实施方案中，可通过与来自健康的或开始治疗之前的相同个体的样本作比较，或通过与来自相同个体的健康肺部细胞样本作比较来评估患有肺癌的个体的治疗进展。

在一些实施方案中，方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA。在一些实施方案中，方法包括检测小U2。在一些此类实施方案中，方法进一步包括检测选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA。在一些实施方案中，结合检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA，方法进一步包括检测至少一种另外靶RNA。此类另外靶RNA包括但不限于其它微RNA、小细胞RNA和mRNA。

在所述方法包括检测至少两种RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少两种RNA的水平的实施方案中，可在相同测定反应中共同或同时检测多种RNA的水平。在一些实施方案中，在单独测定反应中共同或同时检测RNA水平。在一些实施方案中，在不同时间，例如在连续测定反应中检测RNA水平。

在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样本中小U2的水平，其中检测到小U2的水平高于所述RNA的正常水平表明受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样本中miR-720的水平，其中检测到miR-720的水平低于所述RNA的正常水平表明受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样本中miR-451的水平，其中检测到miR-451的水平低于所述RNA的正常水平表明受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样本中13207的水平，其中检测到13207的水平低于所述RNA的正常水平表明受试者中肺癌的存在。在一些实施方案中，方法包括检测来自受试者的样本中13750的水平，其中检测到13750的水平低于所述RNA的正常水平表明受试者中肺癌的存在。进一步地，还考虑了包括检测前述RNA的1、2、3、4或5种的任何组合的检测受试者中肺癌的方法。

在一些实施方案中，提供了促进受试者中肺癌的诊断的方法。此类方法包括检测来自受试者的样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，将关于选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平的信息传达给执业医生。如本文所使用，“执业医生”指诊断和/或治疗患者的个人或团体，例如医院、门诊部、医生办公室、医生、护士或前述任何团体和个人的代理。在一些实施方案中，检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平在已经从执业医生或执业医生代理接收了受试者的样本的实验室进行。实验室通过任何方法进行检测，包括本文所述方法，然后将结果传达给执业医生。如本文所使用，当通过任何方式将结果提供给执业医生时，“传达”结果。在一些实施方案中，这种传达可为口头或书面传达，可通过电话、人、电子邮件、邮件或其它信使，或通过将信息直接存放在(例如)执业医生可访问的数据库中进行传达，包括不受执业医生管辖的数据库。在一些实施方案中，以电子形式保存信息。在一些实施方案中，可将信息存储在存储器或其它计算机可读介质中，例如RAM、ROM、EEPROM、闪存、计算机芯片、数字视频光盘(DVD)、光盘(CD)、硬盘驱动器(HDD)、磁带等。

在一些实施方案中，提供了检测肺癌存在的方法。在一些实施方案中，提供了诊断肺癌的方法。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者获得样本并且将样本提供给实验室以检测样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从实验室接收表明样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平的讯息。在一些实施方案中，如果样本中小U2的水平高于小U2的正常水平，则存在肺癌。在一些实施方案中，如果样本中选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，则存在肺癌。如本文所使用，“实验室”是通过任何方法，包括本文所述方法，检测样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，并且将所述水平传达给执业医生的任何机构。在一些实施方案中，实验室受执业医生管辖。在一些实施方案中，实验室不受执业医生管辖。

当实验室将选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平传达给执业医生时，在一些实施方案中，实验室传达表示样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平的数值，其中提供或不提供正常水平的数值。在一些实施方案中，实验室通过提供定性值，例如“高”、“低”、“升高”、“降低”等，传达选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。

如本文所使用，当方法涉及检测肺癌，确定肺癌的存在和/或诊断肺癌时，所述方法包括其中进行所述方法的步骤的活动，但是结果对于肺癌的存在是阴性的。即，检测、确定和诊断肺癌包括进行产生阳性或阴性结果的方法的情况(例如，小U2水平是正常还是高于正常，或miR-451、miR-720、13207和/或13750水平是正常还是低于正常)。

如本文所使用，术语“受试者”指人。在一些实施方案中，本文所述方法可用在来自非人类动物的样本上。

基因组中物理上相互靠近的靶RNA的共同或协调表达允许在本文的方法中信息式使用此类染色体近端靶RNA。

小U2的编码序列位于染色体17上的17q21.31处，并且似乎以多个拷贝存在。miR-720的编码序列位于染色体3上：164,059,029-164,059,238(Ensembl发布65–2011年12月；染色体3q26.1)。miR-451的编码序列位于染色体17上：27,188,387-27,188,458(Ensembl发布65–2011年12月；染色体17q11.2)。13207的编码序列位于染色体10上：687,614-687,734(Ensembl发布65–2011年12月；染色体10p15.3)。13750的编码序列位于染色体17上：27,188,673-27,188,748(Ensembl发布65–2011年12月；染色体17q11.2)。在一些实施方案中，在本文所述方法中代替或除测量各靶RNA的表达外，检测位于小U2、miR-720、miR-451或13207的染色体位置的约1千个碱基(kb)内、约2kb内、约5kb内、约10kb内、约20kb内、约30kb内、约40kb内和甚至约50kb内的一种或多种靶RNA表达水平。参见Baskerville,S.和Bartel D.P.(2005)RNA11:241-247。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测样本中非常靠近染色体特征区域，例如癌症相关的基因组区域、脆性位点和人乳头瘤病毒整合位点定位的至少一种靶RNA基因的表达。

在一些实施方案中，在单个反应中同时检测一种以上的RNA。在一些实施方案中，在单个反应中同时检测至少2种、至少3种、至少5种或至少10种RNA。在一些实施方案中，在单个反应中同时检测所有RNA。

4.1.2.示例性对照

在一些实施方案中，可根据正常肺部细胞或其它参考物质所特有的平均水平或范围测定靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA的正常水平(“对照”)，将样本中测量的水平与之比较。正常受试者体内测定的靶RNA的平均值或范围可用作检测表明肺癌的高于正常水平的靶RNA的基准。在一些实施方案中，可使用来自一个或多个个体，例如来自接受I、II或IIIA非小细胞肺癌手术切除的患者的正常肺部组织的含单独或混合RNA的样本测定靶RNA的正常水平。

在一些实施方案中，测定靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的正常水平包括检测包含与选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA互补体的核酸杂交的检测用多核苷酸的复合体。即，在一些实施方案中，可通过检测靶RNA的DNA扩增子或靶RNA互补体，而非靶RNA本身，测定正常水平。在一些实施方案中，测定此类复合体的正常水平并且用作对照。在一些实施方案中，复合体的正常水平与靶RNA的正常水平相关联。因此，当本文讨论靶标的正常水平时，在一些实施方案中，可通过检测此类复合体测定该水平。

在一些实施方案中，对照包含来自单个个体的细胞，例如，来自接受I、II或IIIA肺癌手术切除的患者的正常组织的RNA。在一些实施方案中，对照包含来自单个个体的血液，例如全血或血清的RNA。在一些实施方案中，对照包含来自多个个体的混合细胞的RNA。在一些实施方案中，对照包含来自多个个体的混合血液，例如全血或血清的RNA。在一些实施方案中，对照包含可购买获得的人RNA，例如人肺总RNA(Ambion；AM7968)。在一些实施方案中，在测试样本的水平升高之前，已经预先测定正常水平或正常范围。

在一些实施方案中，可由一个或多个连续细胞系测定靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的正常水平，通常先前证实细胞系的RNA水平接近正常肺部细胞中的水平。

在一些实施方案中，方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，除检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平外，方法包括检测至少一种另外靶RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括检测小U2的水平。在一些此类实施方案中，方法进一步包括检测选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，方法包括检测13750的水平。在一些此类实施方案中，方法进一步包括检测选自miR-720、miR-451、13207和小U2的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，方法进一步包括检测至少一种另外靶RNA的水平。在一些实施方案中，方法进一步包括将选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平与所述至少一种RNA的正常水平作比较。在一些实施方案中，方法进一步包括将至少一种靶RNA的水平与所述至少一种靶RNA的对照水平作比较。在一些实施方案中，靶RNA的对照水平为正常细胞中靶RNA的水平。在一些实施方案中，靶RNA的对照水平为来自健康个体的血清中靶RNA的水平。在一些此类实施方案中，对照水平可称为正常水平。

在一些实施方案中，样本中小U2的水平相对于正常细胞或正常血清中小U2的水平更高，和/或选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种RNA的水平相对于正常细胞或正常血清中各RNA的水平降低表明肺癌。在一些实施方案中，样本中小U2的水平相对于正常细胞或正常血清中小U2的水平更高表明肺癌。在一些实施方案中，样本中miR-720的水平相对于正常细胞或正常血清中miR-720的水平降低表明肺癌。在一些实施方案中，样本中miR-451的水平相对于正常细胞或正常血清中miR-451的水平降低表明肺癌。在一些实施方案中，样本中13207的水平相对于正常细胞或正常血清中13207的水平降低表明肺癌。在一些实施方案中，样本中13750的水平相对于正常细胞或正常血清中13750的水平降低表明肺癌。

在一些实施方案中，至少一种另外靶RNA的水平相对于正常细胞中所述至少一种另外靶RNA的水平更高表明肺癌。在一些实施方案中，至少一种另外靶RNA的水平相对于正常细胞中所述至少一种另外靶RNA的水平更低表明肺癌。

在一些实施方案中，将靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平与(例如)来自确认肺癌的参考水平作比较。在一些此类实施方案中，靶RNA的水平相对于参考样本相似表明肺癌。

在一些实施方案中，靶RNA，例如小U2的水平比各靶RNA的正常水平高至少约2倍表明肺癌。在一些实施方案中，靶RNA，例如小U2的水平比对照样本中各靶RNA的水平高至少约2倍表明肺癌的存在。在不同实施方案中，靶RNA，例如小U2的水平比对照样本中各靶RNA的水平高至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍表明肺癌的存在。在不同实施方案中，靶RNA，例如小U2的水平比各靶RNA的正常水平高至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍表明肺癌的存在。

在一些实施方案中，至少一种靶RNA，例如miR-720、miR-451、13207和/或13750的水平比各靶RNA的正常水平低至少约2倍表明肺癌的存在。在一些实施方案中，至少一种靶RNA，例如miR-720、miR-451、13207和/或13750的水平比对照样本中各靶RNA的水平低至少约2倍表明肺癌的存在。在不同实施方案中，至少一种靶RNA，例如miR-720、miR-451、13207和/或13750的水平比对照样本中各靶RNA的水平低至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍表明肺癌的存在。在不同实施方案中，至少一种靶RNA，例如miR-720、miR-451、13207和/或13750的水平比各靶RNA的正常水平低至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍表明肺癌的存在。

在一些实施方案中，与样本中靶RNA的水平一样，例如在相同测定或批量测定中同时测定靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的对照水平。在一些实施方案中，与样本中靶RNA的水平一样不同时测定靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的对照水平。在一些此类实施方案中，先前已经测定了对照水平。

在一些实施方案中，例如当已知正常细胞中靶RNA以非常低的水平存在或完全不存在时，靶RNA的水平不与对照水平作比较。在此类实施方案中，检测到样本中高水平的靶RNA表明肺癌。类似地，在一些实施方案中，如果在正常细胞或正常血清中靶RNA以高水平存在，检测到样本中的水平非常低则表明肺癌。

4.1.3.制备RNA的示例性方法

可通过任何适当方法制备靶RNA。可通过任何方法，包括但不限于Wilkinson,M.(1988)Nucl.Acids Res.16(22):10,933；和Wilkinson,M.(1988)Nucl.Acids Res.16(22):10934中提出的方案，或通过使用可购买获得的试剂盒或试剂，例如TRIzol

试剂(Invitrogen^TM)、总RNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology)、总RNA纯化试剂盒(NorgenBiotek Corp.)、RNAqueous^TM(Ambion)、MagMAX^TM(Ambion)、RecoverAll^TM(Ambion)、RNeasy(Qiagen)等分离总RNA。

在一些实施方案中，分离或富集小RNA。在一些实施方案中“小RNA”指长度小于200个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，“小RNA”指小于约100nt、小于约90nt、小于约80nt、小于约70nt、小于约60nt、小于约50nt或小于约40nt的RNA分子。

可通过一种方法实现小RNA的富集。此类方法包括但不限于涉及有机萃取，接着使用专用粘合和洗涤溶液将核酸分子吸附至玻璃纤维过滤器上的方法和使用离心柱纯化的方法。可使用可购买获得的试剂盒，例如mirVana^TM分离试剂盒(Ambion)、mirPremier^TM微RNA分离试剂盒(Sigma-Aldrich)、PureLink^TMmiRNA分离试剂盒(Invitrogen)、miRCURY^TMRNA分离试剂盒(Exiqon)、微RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek Corp.)、miRNeasy试剂盒(Qiagen)等实现小RNA的富集。在一些实施方案中，可通过TRIzol

(Invitrogen)方法实现纯化，所述方法采用向其中添加了氯仿的苯酚/异硫氰酸酯溶液分离含RNA的水相。随后通过用异丙醇沉淀从水相回收小RNA。在一些实施方案中，可使用色谱法，例如使用可从Applied Biosystems获得的flashPAGE^TM分馏器进行凝胶电泳来纯化小RNA。

在一些实施方案中，将小RNA与其它RNA分子分离开以富集靶RNA，以致小RNA成分(例如，含有长度为200个核苷酸或更少，例如长度小于100个核苷酸，例如长度小于50个核苷酸，例如长度为约10至约40个核苷酸的RNA分子)大体上纯净，意思是相对于较大RNA分子，小RNA成分至少约80%、85%、90%、95%纯净或更高，但是低于100%纯净。或者，可根据富集倍数表示小RNA的富集。在一些实施方案中，相对于样本中RNA分离物或总RNA中较大RNA的浓度，使小RNA富集约、至少约或至多约5X、10X、20X、30X、40X、50X、60X、70X、80X、90X、100X、110X、120X、130X、140X、150X、160X、170X、180X、190X、200X、210X、220X、230X、240X、250X、260X、270X、280X、290X、300X、310X、320X、330X、340X、350X、360X、370X、380X、390X、400X、410X、420X、430X、440X、450X、460X、470X、480X、490X、500X、600X、700X、800X、900X、1000X、1100X、1200X、1300X、1400X、1500X、1600X、1700X、1800X、1900X、2000X、3000X、4000X、5000X、6000X、7000X、8000X、9000X、10,000X或更高或其中可导的任何范围。

在一些实施方案中，测量未先从细胞中纯化RNA的样本中的RNA水平。在一些实施方案中，测量已经分离RNA，但是未富集小RNA的样本中的RNA水平。

在一些实施方案中，在检测靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA之前修饰RNA。在一些实施方案中，经修饰的RNA为总RNA。在其它实施方案中，经修饰的RNA为已经从总RNA或细胞溶解产物中纯化的小RNA，例如长度小于200个核苷酸，例如长度小于100个核苷酸，例如长度小于50个核苷酸，例如长度为约10至约40个核苷酸的RNA。在本文所述方法中可利用的RNA修饰包括但不限于添加聚dA或聚dT尾，可通过化学或酶促法实现，和/或添加小分子，例如生物素。

在一些实施方案中，反转录靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA。在一些实施方案中，反转录时，在反转录期间(例如)通过添加聚dA或聚dT尾修饰cDNA。在其它实施方案中，RNA在反转录之前经修饰。在一些实施方案中，反转录总RNA。在其它实施方案中，在反转录RNA之前分离或富集小RNA。

当反转录靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA时，形成靶RNA的互补体。在一些实施方案中，检测靶RNA的互补体而非靶RNA本身(或其DNA拷贝)。因此，当本文讨论的方法指出检测靶RNA，或测定靶RNA的水平时，代替或除靶RNA本身外，可对靶RNA的互补体进行此类检测或测定。在一些实施方案中，当检测靶RNA的互补体而非靶RNA时，使用与靶RNA的互补体互补的检测用多核苷酸。在此类实施方案中，虽然其可能含有代替尿苷的胸苷，和/或包含其它经修饰的核苷酸，但是检测用多核苷酸包含至少一个在序列上与靶RNA相同的部分。

在一些实施方案中，检测靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的方法包括扩增与靶RNA互补的cDNA。可通过任何方法实现此类修饰。示例性方法包括但不限于实时PCR、终点PCR和使用T7聚合酶由与cDNA退火的T7启动子扩增，例如由在Implen,Germany可获得的SenseAmp Plus^TM试剂盒提供。

当扩增靶RNA或与靶RNA互补的cDNA时，在一些实施方案中，形成靶RNA的DNA扩增子。DNA扩增子可为单链或双链。在一些实施方案中，当DNA扩增子为单链时，DNA扩增子的序列在有义或反义方向与靶RNA相关。在一些实施方案中，检测靶RNA的DNA扩增子而非靶RNA本身。因此，当本文讨论的方法指出检测靶RNA，或测定靶RNA的水平时，代替或除靶RNA本身外，可对靶RNA的DNA扩增子进行此类检测或测定。在一些实施方案中，当检测靶RNA的DNA扩增子而非靶RNA时，使用与靶RNA的互补体互补的检测用多核苷酸。在一些实施方案中，当检测靶RNA的DNA扩增子而非靶RNA时，使用与靶RNA互补的检测用多核苷酸。进一步地，在一些实施方案中，可使用多个检测用多核苷酸，并且一些多核苷酸可能与靶RNA互补而一些多核苷酸可能与靶RNA的互补体互补。

在一些实施方案中，检测一种或多种靶RNA，包括小U2、miR-720、miR-451、13207和/或13750的方法包括如下所述的RT-PCR。在一些实施方案中，检测一种或多种靶RNA包括RT-PCR反应的实时监测，其可通过任何方法实现。此类方法包括但不限于使用TaqMan

、分子信标或蝎型探针(Scorpion probe)(即，FRET探针)和使用插入染料，例如SYBR green、EvaGreen、噻唑橙(thiazoleorange)、YO-PRO、TO-PRO等。

4.1.4.示例性分析方法

如上所述，提出了检测肺癌的方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测至少一种另外靶RNA的水平。

在一些实施方案中，方法包括检测靶RNA，例如小U2的水平，所述水平在样本中比对照样本，例如源自正常肺部细胞的样本或正常血清样本中靶RNA的正常水平高。在一些实施方案中，方法包括检测靶RNA，例如miR-720、miR-451、13207和/或13750的水平，所述水平在样本中比对照样本，例如源自正常肺部细胞或正常血清的样本中靶RNA的正常水平低。

在一些实施方案中，miR-720为成熟miR-720。在一些实施方案中，miR-451为成熟miR-451。在一些实施方案中，13207为成熟13207。在一些实施方案中，13750为成熟13750。在一些实施方案中，呈成熟形式的靶RNA包含少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA为微RNA。在一些实施方案中，靶RNA为小细胞RNA。

在一些实施方案中，除检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平外，方法进一步包括检测人miRNome的至少一种靶RNA的水平。如本文所使用，术语“人miRNome”指人细胞中的所有微RNA基因及由其生成的成熟微RNA。

能够容许特异性且可量化(或可半量化)检测靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的任何分析程序均可用于本文提出的方法中。此类分析程序包括但不限于实施例中提出的微阵列法和RT-PCR法及本领域技术人员已知的方法。

在一些实施方案中，检测靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA包括形成包含与靶RNA或其互补体互补的多核苷酸和选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子和靶RNA互补体的核酸的复合体。因此，在一些实施方案中，多核苷酸与靶RNA形成复合体。在一些实施方案中，多核苷酸与靶RNA的互补体，例如已经由靶RNA反转录的cDNA形成复合体。在一些实施方案中，多核苷酸与靶RNA的DNA扩增子形成复合体。当双链DNA扩增子为复合体的一部分时，如本文所使用，复合体可包含DNA扩增子的一条或两条链。因此，在一些实施方案中，复合体仅包含DNA扩增子的一条链。在一些实施方案中，复合体为三链体并且包含多核苷酸和DNA扩增子的两条链。在一些实施方案中，通过多核苷酸与靶RNA、靶RNA互补体或靶RNA的DNA扩增子之间的杂交形成复合体。在一些实施方案中，多核苷酸为引物或探针。

在一些实施方案中，方法包括检测复合体。在一些实施方案中，在检测时复合体不必缔合。即，在一些实施方案中，形成复合体，然后以某种方式解离或破坏复合体，并检测来自复合体的组分。此类系统的实例为TaqMan

测定。在一些实施方案中，当多核苷酸为引物时，复合体的检测包括扩增靶RNA、靶RNA的互补体或靶RNA的DNA扩增子。

在一些实施方案中，在本文提出的方法中用于检测至少一种靶RNA，包括选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的分析方法包括实时定量RT-PCR。参见Chen,C.等(2005)Nucl.Acids Res.33:e179和PCT公布号WO 2007/117256，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，用于检测至少一种靶RNA的分析方法包括美国公布号US2009/0123912A1中描述的方法，其以引用的方式整体并入本文。在该公布中描述的示例性方法中，使用包含第一部分和第二部分的延伸引物反转录小RNA以制备cDNA，其中第一部分与特定小RNA的3’端选择性杂交而第二部分包含通用引物的序列。然后在定量PCR反应中使用与小RNA的5’端选择性杂交的反向引物和通用引物扩增cDNA。

在一些实施方案中，用于检测至少一种靶RNA，包括选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的分析方法包括使用TaqMan

探针。在一些实施方案中，用于检测至少一种靶RNA的分析方法包括TaqMan

测定，例如Applied Biosystems,Inc.销售的TaqMan

微RNA测定。在示例性TaqMan

测定中，从样本中分离总RNA。在一些实施方案中，所述测定可用于分析约10ng的总RNA输入样本，例如含小RNA的约9ng输入样本，例如约8ng输入样本，例如约7ng输入样本，例如约6ng输入样本，例如约5ng输入样本，例如约4ng输入样本，例如约3ng输入样本，例如约2ng输入样本和甚至少至约1ng的输入样本。

TaqMan

测定利用与靶RNA的3’端特异性互补的茎环引物。在示例性TaqMan

测定法中，使茎环引物与靶RNA杂交后，反转录靶RNA模板，导致引物的3’端延伸。反转录的产物为嵌合(DNA)扩增子，在扩增子的5’端具有茎环引物序列而在3’端具有靶RNA的cDNA。使用序列与所有茎环靶RNA引物的5’端序列互补的通用反向引物，靶RNA特异性正向引物和靶RNA序列特异性TaqMan

探针，通过实时RT-PCR实现靶RNA的定量。

所述测定使用荧光共振能量转移(“FRET”)检测并定量合成的PCR产物。通常，TaqMan

探针包含与5’端偶联的荧光染料分子和与3’端偶联的猝灭剂分子，以致染料和猝灭剂很靠近，允许猝灭剂通过FRET抑制染料的荧光信号。当聚合酶复制与TaqMan探针结合的嵌合扩增子模板时，聚合酶的5’-核酸酶裂解探针，使染料和猝灭剂去偶联，以消除FRET并产生荧光信号。荧光随着每个RT-PCR循环与裂解的探针的量呈正比增加。

例如，在美国公布号US 2007/0077570(Lao等)、PCT公布号WO2007/025281(Tan等)、美国公布号US2007/0054287(Bloch)、PCT公布号WO2006/0130761(Bloch)和PCT公布号WO 2007/011903(Lao等)中描述了另外的用于RNA检测和/或量化的示例性方法，所述PCT公布以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，通过由已知浓度的核酸构造标准曲线，然后推断未知浓度的靶RNA的定量信息进行实时RT-PCR测定的结果的定量。在一些实施方案中，用于生成标准曲线的核酸为已知浓度的RNA(例如，微RNA或其它小RNA)。在一些实施方案中，用于生成标准曲线的核酸是纯化的双链质粒DNA或体外生成的单链DNA。

在一些实施方案中，在靶核酸和内源参考的扩增效率近似相等的情况中，通过比较Ct(循环阈值，例如，荧光信号上升至高于本底所需的PCR循环的数目)方法实现定量。Ct值与样本中核酸靶标的数量成反比。在一些实施方案中，靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的Ct值可与对照或校准器比较，所述对照或校准器例如来自正常组织的RNA(例如，微RNA或其它小RNA)。在一些实施方案中，将校准器和靶RNA的Ct值标准化为适当的内源管家基因。在一些实施方案中，先前已经测定了靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的阈值Ct(或“截断Ct”)值，低于所述值表明肺癌。在此类实施方案中，可与测试样本一起同时测定对照样本。

除TaqMan测定外，在本文提出的方法中用于检测并定量PCR产物的其它实时RT-PCR化学方法包括但不限于分子信标、蝎型探针和插入染料，例如以下讨论的SYBR Green、EvaGreen、噻唑橙、YO-PRO、TO-PRO等。

在一些实施方案中，特别进行实时RT-PCR检测以检测并量化单个靶RNA的水平。在一些实施方案中，靶RNA是选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA。

如上所述，在一些实施方案中，除检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平外，还检测至少一种另外靶RNA的水平。

在各个其它实施方案中，在单个多重反应中利用实时RT-PCR检测来检测至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8种靶RNA，包括选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA。

在一些多重实施方案中，使用多种探针，例如TaqMan探针，各自对不同RNA靶标有特异性。在一些实施方案中，每种靶RNA特异性探针与相同多重反应中使用的其它探针在光谱上可区别。

在一些实施方案中，使用与双链DNA产物结合的染料，例如SYBR Green、EvaGreen、噻唑橙、YO-PRO、TO-PRO等完成实时RT PCR产物的定量。在一些实施方案中，所述测定是来自Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR测定。这种测定中，首先从样本中分离总RNA。随后使总RNA在3’端聚腺苷酸化并且使用在5’端具有聚-dT的通用引物反转录。在一些实施方案中，单个反转录反应足以测定多种靶RNA。然后使用靶RNA特异性引物和在5’端包含聚-dT序列的miScript通用引物完成实时RT-PCR。SYBR Green染料与双链DNA非特异性结合并且在激发后发光。在一些实施方案中，可使用促进引物与PCR模板高度特异性退火的缓冲条件(例如，在来自Qiagen的QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒中可获得)以避免形成将结合SYBR Green并且负面影响定量的非特异性DNA双链体和引物二聚体。因此，当PCR产物积聚时，来自SYBR Green的信号增加，从而允许定量特异性产物。

使用本领域可获得的任何RT-PCR仪器进行实时RT-PCR。通常，在实时RT-PCR数据收集和分析中使用的仪器包括热循环仪、用于荧光激发和发射收集的光学装置和任选计算机和数据采集与分析软件。

在一些实施方案中，本文所述方法中使用的分析方法为DASL

(cDNA介导的退火、选择、延伸和连接)测定，例如可从Illumina,Inc.获得的微RNA表达谱测定(参见http://www.illumina.com/downloads/MicroRNAAssayWorkflow.pdf)。在一些实施方案中，通过任何方法从待分析样本中分离总RNA。另外，在一些实施方案中，通过任何方法从待分析样本中分离小RNA。然后可使总RNA或分离的小RNA聚腺苷酸化(向反应混合物中RNA的3’端添加>18个A残基)。使用从5’端到3’端，包含包括PCR引物位点和与样本RNA的聚-dA尾结合的聚-dT区域的序列的生物素标记的DNA引物反转录RNA。然后使所得生物素化cDNA转录物经由生物素-链霉亲和素相互作用与固体支撑物杂交并且与一个或多个靶RNA特异性多核苷酸接触。靶RNA特异性多核苷酸从5’端到3’端包含含有PCR引物位点的区域、含地址序列的区域和靶RNA特异性序列。

在一些DASL

实施方案中，靶RNA特异性序列包含序列与选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个相邻核苷酸互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个相邻核苷酸。在一些DASL

实施方案中，靶RNA特异性序列包含序列与另一种靶RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸。

杂交后，靶RNA特异性多核苷酸延伸，然后从固定cDNA阵列上洗脱延伸产物。使用荧光标记的通用引物的第二PCR反应生成包含靶RNA特异性序列的荧光标记的DNA。然后使标记的PCR产物与微珠阵列杂交以便检测和定量。

在一些实施方案中，在本文所述方法中用于检测并量化所述至少一种靶RNA，包括选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平的分析方法为基于珠粒的流式细胞测定。参见Lu J.等(2005)Nature 435:834-838，其以引用的方式整体并入本文。基于珠粒的流式细胞测定的实例为Luminex,Inc.的xMAP

技术(参见http://www.luminexcorp.com/technology/index.html)。在一些实施方案中，从样本中分离总RNA，然后用生物素标记。然后使标记的RNA和与微珠共价结合的靶RNA特异性捕获探针(例如，Luminex,Inc.在http://www.luminexcorp.com/products/assays/index.html出售的FlexmiR^TM产物)杂交，每个微珠经具有不同荧光强度的2种染料标记。链霉亲和素结合的报告分子(例如，链霉亲和素-藻红蛋白，也称为“SAPE”)与捕获的靶RNA连接并且使用流式细胞术读取每个珠粒的独特信号。在一些实施方案中，首先使RNA样本(总RNA或富集的小RNA)聚腺苷酸化，随后用生物素化3DNA^TM树枝状聚合物(即，有许多生物素分子与之结合的多臂DNA)使用与样本RNA的聚dA尾的3’端和连接至生物素化树枝状聚合物的多核苷酸的5’端互补的桥接多核苷酸标记，所述3DNA^TM树枝状聚合物例如MarligenBiosciences作为Vantage^TM微RNA标记试剂盒出售的那些。然后在用流式细胞术分析之前，使链霉亲和素结合的报告分子与生物素化树枝状聚合物连接。参见http://www.marligen.com/vantage-microrna-labeling-kit.html。在一些实施方案中，首先将生物素标记的RNA暴露于SAPE，随后使RNA/SAPE复合体暴露于和可与多达900个生物素分子结合的DNA树枝状聚合物连接的抗藻红蛋白抗体。这样允许多个SAPE分子通过生物素-链霉亲和素相互作用与生物素化树枝状聚合物结合，从而增加了来自所述测定的信号。

在一些实施方案中，在本文所述方法中用于检测并量化所述至少一种靶RNA，包括选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平的分析方法是通过用标记的探针(例如，经放射性或化学发光标记标记的探针)进行凝胶电泳和检测，例如RNA印迹法(Northern blotting)。在一些实施方案中，从样本中分离总RNA，然后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大小分离。然后使分离的RNA印迹到膜上并且与放射性标记的互补探针杂交。在一些实施方案中，示例性探针含有以下讨论的一种或多种亲和力增强核苷酸类似物，例如含有代替脱氧核糖或核糖的二环糖部分的锁核酸(“LNA”)类似物。参见，例如Várallyay,E.等(2008)Nature Protocols3(2):190-196，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，可进一步纯化总RNA样本以富集小RNA。在一些实施方案中，可通过(例如)使用与靶RNA两端互补的长探针(“锁式探针(padlockedprobe)”)的滚环扩增，连接以环化探针，接着使用与环化探针杂交的靶RNA作为引物进行滚环扩增来扩增靶RNA。参见，例如Jonstrup,S.P.等(2006)RNA12:1-6，其以引用的方式整体并入本文。然后使用(例如)凝胶电泳和RNA印迹法检测并量化扩增产物。

在替代实施方案中，使标记的探针与溶液中分离的总RNA杂交，之后使RNA经受单链RNA的快速核糖核酸酶消化，所述单链RNA例如，探针的未杂交部分或未杂交的靶RNA。在这些实施方案中，然后通过SDS-PAGE并且通过(例如)RNA印迹法检测放射性标记的探针来分析经核糖核酸酶处理的样本。参见http：//www．ambion．com/catalog/CatNum．php?1552上AppliedBiosystems，Inc．出售的mirVana^TM miRNA检测试剂盒产品资料。

在一些实施方案中，在本文所述方法中用于检测并量化所述至少一种靶RNA，包括选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的分析方法是通过与微阵列杂交。参见，例如各自以引用的方式整体并入本文的Liu，C．G等(2004)Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 101：9740-9744；Lim，L．P等(2005)Nature 433：769-773和实施例1。

在一些实施方案中，可通过表面等离子体共振实现使用微阵列检测并量化靶RNA。参见，例如Nanotech News(2006)，可访问http：//nano．cancer．gov/news_center/nanotech_news_2006-10-30b．asp。在这些实施方案中，从测试样本中分离总RNA。任选地，进一步纯化RNA样本以富集小RNA群体。纯化后，RNA样本与微阵列上限定位置的含有探针的可寻址微阵列结合。在一些实施方案中，RNA反转录为cDNA，并且cDNA与可寻址微阵列结合。在一些此类实施方案中，微阵列包含具有与cDNA序列互补的区域的探针(即，探针包含具有与待检测RNA相同的序列的区域)。非限制示例性捕获探针包含含有选自以下的序列的区域(对于每个探针，指出了探针是与“有义”成熟RNA还是与“反义”成熟RNA杂交(即，与由RNA反转录的cDNA杂交))：

对于小U2，5′-CCCTGCTCCAAAAATCCA-3′(SEQ ID NO：42)，有义；

对于小U2，5′-TGGATTTTTGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：43)，反义；

对于miR-720，5′-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3′(SEQ ID NO：44)，有义；

对于miR-720，5′-TCTCGCTGGGGCCTCCA-3′(SEQ ID NO：45)，反义；

对于miR-451，5′-AACTCAGTAATGGTAACGGTTT-3′(SEQ ID NO：46)，有义；

对于miR-451，5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT-3′(SEQ ID NO：47)，反义；

对于13207，5′-CCTGCTCCAACAAGGAAAGACA-3′(SEQ ID NO：48)，有义；

对于13207，5′-TGTCTTTCCTTGTTGGAGCAGG-3′(SEQ ID NO：49)，反义；

对于13207，5′-GCTCCAACAAGGAAAGACAGGA-3′(SEQ ID NO：81)，有义；

对于13207，5′-TCCTGTCTTTCCTTGTTGGAGC-3′(SEQ ID NO：82)，反义；

对于13750，5′-AGCTTCCTGCTCCCTGCTCTACA-3′(SEQ ID NO：50)，有义；

对于13750，5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGCT-3′(SEQ ID NO：51)，反义。

更多非限制示例性探针包含具有选自SEQ ID NO：42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个相邻核苷酸的区域。探针可进一步包含至少一个第二区域，其不包含与选自SEQ ID NO：42至51、81和82的序列的至少8个相邻核苷酸相同的序列。

非限制示例性探针包含具有选自以下的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的区域(对于每个探针，指出了探针是与“有义”RNA还是与“反义”RNA杂交(即，与由RNA反转录的cDNA杂交))：

对于小U2，5′-GGGTGCACCG TTCCTGGAGG TACTGCAATA CCAGGTCGAT GCGTGGAGTGGACGGAGCAA GCTCCTATTC CATCTCCCTG CTCCAAAAAT CCATTTAATA TATTGTCCTCGGATAGAGGA CGTATCAGAT ATTAAACTGA TAAGAACAGA TACTACACTT GATCTTAGCCAAAAGGCCGA GAAGCGAT-3′(SEQ ID NO：52)，有义；

对于小U2，5′-ATCGCTTCTC GGCCTTTTGG CTAAGATCAA GTGTAGTATC TGTTCTTATCAGTTTAATAT CTGATACGTC CTCTATCCGA GGACAATATA TTAAATGGAT TTTTGGAGCAGGGAGATGGA ATAGGAGCTT GCTCCGTCCA CTCCACGCAT CGACCTGGTA TTGCAGTACCTCCAGGAACG GTGCACCC-3’(SEQ ID NO：53)，反义；

对于miR-720，5′-CTAATAAAGG ACTCTTAATT CATCTCAAAG TGTGGTGTTT TCTCTAACACCCCTGGGCAC AACATTTTGG AGGCCCCAGC GAGATATTAA CACCACCGTGTGAGATCCGG-3′(SEQ ID NO：54)，有义；

对于miR-720，5′-CCGGATCTCA CACGGTGGTG TTAATATCTC GCTGGGGCCT CCAAAATGTTGTGCCCAGGG GTGTTAGAGA AAACACCACA CTTTGAGATG AATTAAGAGTCCTTTATTAG-3′(SEQ ID NO：55)，反义；

对于miR-451，5′-TCTGGGTATA GCAAGAGAAC CATTACCATT ACTAAACTCA GTAATGGTAACGGTTTCCTT GCCATTCCCA AG-3′(SEQ ID NO：56)，有义；

对于miR-451，5′-CTTGGGAATG GCAAGGAAAC CGTTACCATT ACTGAGTTTA GTAATGGTAATGGTTCTCTT GCTATACCCA GA-3′(SEQ ID NO：57)，反义；

对于13207，5′-CTGCGGCAAG TGCTTCTACA TCCCTGCTCC AACAAGGAAA GACAGGAGGCCAGGCGTGTG TGTGGCTCAC ACCTCTTGTC CTTCCTTGTT GGGGCAGGGG TACAGAAGCATTTTGGGGGG C-3′(SEQ ID NO：58)，有义；

对于13207，5′-GCCCCCCAAA ATGCTTCTGT ACCCCTGCCC CAACAAGGAA GGACAAGAGGTGTGAGCCAC ACACACGCCT GGCCTCCTGT CTTTCCTTGT TGGAGCAGGG ATGTAGAAGCACTTGCCGCA G-3′(SEQ ID NO：59)，反义；

对于13750，5′-AGCACTGTGA GGGGCTGGGG GCAGAACAGG ACAGGTCAGG GCTGGACACA CACAGCTTCC TGCTCCCTGC TCTACAGCTC CCTCGCAGGC C-3′(SEQ ID NO：60)，有义；

以及

对于13750，5′-GGCCTGCGAG GGAGCTGTAG AGCAGGGAGC AGGAAGCTGT GTGTGTCCAGCCCTGACCTG TCCTGTTCTG CCCCCAGCCC CTCACAGTGC T-3′(SEQ ID NO：61)，反义。

在一些实施方案中，探针含有一种或多种如以下讨论的亲和力增强核苷酸类似物，例如锁核酸(“LNA”)核苷酸类似物。与微阵列杂交后，首先使与阵列杂交的RNA聚腺苷酸化，然后将阵列暴露于有聚dT与之结合的金颗粒。使用表面等离子体共振定量结合的靶RNA的量。

在一些实施方案中，在以RNA引发的、基于阵列的Klenow酶(“RAKE”)测定中利用微阵列。参见Nelson，PT．等(2004)NatureMethods 1(2)：1-7；Nelson，PT．等(2006)RNA 12(2)：1-5，各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，从样本中分离总RNA。在一些实施方案中，从样本中分离小RNA。然后使RNA样本与固定在可寻址阵列上的5’端的DNA探针杂交。在一些实施方案中，DNA探针从5’端到3’端包含含有对于所有探针相同的“间隔”序列的第一区域，包含3个含胸苷的核苷的第二区域和包含与目标靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA互补的序列的第三区域。

样本与阵列杂交后，将其暴露于核酸外切酶I以消化任何未杂交的探针。然后沿着生物素化dATP涂覆DNA聚合酶I的Klenow片段，从而允许杂交靶RNA作为酶的引物，以DNA探针作为模板。然后洗涤载玻片并且涂覆链霉亲和素缀合的荧光团以检测并定量含有来自样本的杂交且Klenow延伸靶RNA的阵列上的斑点。

在一些实施方案中，反转录RNA样本。在一些实施方案中，使用生物素/聚dA随机八聚体引物反转录RNA样本。当使用所述引物时，消化RNA模板并且使含生物素的cDNA与有允许特异性检测靶RNA的结合探针的可寻址微阵列杂交。在典型实施方案中，微阵列包括至少一个探针，其包含靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的区域中同样存在或与之互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸。cDNA与微阵列杂交后，将微阵列暴露于链霉亲和素结合的可检测标志，例如荧光染料，并检测结合的cDNA。参见Liu C.G.等(2008)Methods 44:22-30，其以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，在ELISA样测定中，使用微量滴定板的孔中结合的探针检测并量化靶RNA，包括小U2、miR-720、miR-451、13207和13750。参见Mora J.R.和Getts R.C.(2006)BioTechniques41:420-424及BioTechniques 41(4):1-5中的补充材料；Getts等的美国专利公布号2006/0094025，其各自以引用的方式整体并入本文。在这些实施方案中，使富集小RNA的RNA样本聚腺苷酸化或反转录，并且使cDNA聚腺苷酸化。使RNA或cDNA与固定在微量滴定板孔中的探针杂交，其中每个探针包含靶RNA，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的区域中同样存在或与之互补的序列。在一些实施方案中，使用捕获序列标记杂交RNA，所述捕获序列例如经多个生物素分子或多个辣根过氧化物酶分子标记的DNA树枝状聚合物(例如可从Genisphere,Inc.获得的DNA树枝状聚合物，http://www.genisphere.com/about_3dna.html)，和在5’端含有与捕获核酸的聚dA尾结合的聚dT序列和在3’端与捕获序列的一个区域互补的序列的桥接多核苷酸。如果使捕获序列生物素化，则将微阵列暴露于链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶。可通过添加辣根过氧化物酶底物，例如四甲基联苯胺(TMB)并测量450nM下溶液的吸光度来检测靶RNA的杂交。

在其它实施方案中，使用可寻址微阵列以使用量子点检测靶RNA。参见Liang,R.Q.等(2005)Nucl.Acids Res.33(2):e17，可访问http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=548377，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，从样本中分离总RNA。在一些实施方案中，从样本中分离小RNA。使用生物素-X-酰肼使靶RNA的3’端生物素化。将生物素化的靶RNA捕获在包含固定探针的微阵列上，所述探针包含靶RNA，包括小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的一个区域中同样存在或与之互补的序列。然后用量子点，经生物素-链霉亲和素结合标记杂交的靶RNA。共聚焦激光引起量子点发荧光并且信号可量化。在替代实施方案中，可使用比色测定检测小RNA。在这些实施方案中，用链霉亲和素缀合金标记小RNA，接着进行银增强。与杂交靶RNA结合的金纳米颗粒催化银离子还原为金属银，然后可用CCD相机对金属银进行比色检测。

在一些实施方案中，使用微流体装置和单分子检测实现一种或多种靶RNA的检测和量化。在一些实施方案中，使分离的总RNA样本中的靶RNA与两种探针杂交，一种与靶RNA的5’端的核酸互补而第二种与靶RNA的3’端互补。在一些实施方案中，每种探针包含一种或多种亲和力增强核苷酸类似物，例如LNA核苷酸类似物并且各自经具有不同荧光发射光谱的不同荧光染料标记。然后使样本流过其中多种激光激发荧光探针的微流体毛细管，以致独特的同时爆发的光子识别特定靶RNA，并且可计数特定的独特同时爆发光子的数量以量化样本中靶RNA的量。参见Neely等的美国专利公布号2006/0292616，其据此以引用的方式整体并入。在一些替代实施方案中，可用选自(例如)荧光团、电子自旋标记等的3个或更多个不同标记来标记靶RNA特异性探针，然后与RNA样本杂交，所述RNA样本例如总RNA或富集小RNA的样本。非限制示例性靶RNA特异性探针包括包含以下序列的探针：选自SEQ ID NO:42至61、81和82的序列；具有选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个相邻核苷酸的序列；和具有选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的序列。

任选地，样本RNA在杂交之前经修饰。然后使靶RNA/探针双链体通过微流体装置中的通道并且微流体装置包括记录3种标记的独特信号的检测器。这样，可通过其独特信号检测单个分子并计数。参见Fuchs等，U.S.Genomics,Inc.的美国专利号7,402,422和7,351,538，其各自以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可通过基于溶液的测定，例如经改良的侵入测定实现一种或多种靶RNA的检测和量化。参见Allawi H.T.等(2004)RNA10:1153-1161，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，可对宫颈细胞的未分离洗涤剂溶解产物进行经改良的侵入测定。在其它实施方案中，可对从细胞分离的总RNA或对富集小RNA的样本进行经改良的侵入测定。使样本中的靶RNA与形成发夹结构的两个探针退火。第一个探针在5’端具有发夹结构而在3’端具有序列与靶RNA的5’端区域的序列互补的区域。第一个探针的3’端为“侵入性多核苷酸”。第二个探针从5’端到3’端具有与靶RNA不互补的第一“瓣”区域，序列与靶RNA的3’端互补的第二区域和形成发夹结构的第三区域。当两个探针与靶RNA靶标结合时，它们在靶RNA模板上产生探针的重叠构造，其由裂解酶识别，向溶液中释放第二探针的瓣。然后瓣区域与二次反应模板(“SRT”)3’端的互补区域结合。FRET多核苷酸(具有与5’端结合的荧光染料和猝灭与3’端更近结合的染料的猝灭剂)与SRT的5’端的互补区域结合，结果产生瓣的3’端和FRET多核苷酸的5’端重叠构造。裂解酶识别重叠构造并裂解FRET多核苷酸的5’端，将染料释放至溶液中时产生荧光信号。

4.1.5.示例性多核苷酸

在一些实施方案中，提供了多核苷酸。在一些实施方案中，提供了合成多核苷酸。如本文所使用，合成多核苷酸指已经在体外化学或酶促合成的多核苷酸。多核苷酸的化学合成包括但不限于使用多核苷酸合成器合成，多核苷酸合成器例如OligoPilot(GE Healthcare)、ABI3900DNA合成器(Applied Biosystems)等。酶促合成包括但不限于通过酶扩增，例如PCR生成多核苷酸。

在一些实施方案中，提供了包含选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个相邻核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的多核苷酸。

在不同实施方案中，多核苷酸包含少于500个、少于300个、少于200个、少于150个、少于100个、少于75个、少于50个、少于40个或少于30个核苷酸。在不同实施方案中，多核苷酸长度介于8个至200个、介于8个至150个、介于8个至100个、介于8个至75个、介于8个至50个、介于8个至40个或介于8个至30个核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸为引物。在一些实施方案中，引物经可检测部分标记。在一些实施方案中，引物未经标记。如本文所使用，引物是能够与靶RNA或由靶RNA反转录的cDNA或已经由靶RNA或cDNA扩增的扩增子(统称为“模板”)特异性杂交的多核苷酸，并且在模板存在下，聚合酶及适合的缓冲液和试剂可延伸以形成引物延伸产物。

在一些实施方案中，多核苷酸为探针。探针经可检测部分标记。如本文所使用，可检测部分包括直接可检测部分(例如荧光染料)和间接可检测部分(例如结合对的成员)。在一些实施方案中，当可检测部分为结合对的成员时，可通过将探针和与结合对的第二个成员结合的可检测标记孵育来检测探针。在一些实施方案中，例如当探针是(例如)微阵列或珠粒上的捕获探针时，探针未经标记。在一些实施方案中，不可用(例如)聚合酶延伸探针。在其它实施方案中，探针可延伸。

在一些实施方案中，多核苷酸是一些实施方案中在5’端经荧光染料(供体)和在3’端经猝灭剂(受体)标记的FRET探针，猝灭剂是当靠近(即，与相同探针连接)时从染料吸收(即，抑制)荧光发射的化学基团。在其它实施方案中，供体和受体不在FRET探针的末端。因此，在一些实施方案中，供体部分的发射光谱应与受体部分的吸收光谱有相当大的重叠。

4.1.5.1.示例性多核苷酸修饰

在一些实施方案中，检测本文所述至少一种靶RNA的方法采用一种或多种已经修饰的多核苷酸，例如包含一种或多种亲和力增强核苷酸类似物的多核苷酸。在本文所述方法中有用的经修饰多核苷酸包括用于反转录的引物、PCR扩增引物和探针。在一些实施方案中，与仅含脱氧核糖核苷酸的多核苷酸相比，并入亲和力增强核苷酸增强了多核苷酸对其靶核酸的结合亲和力，并且允许使用更短的多核苷酸或多核苷酸与靶核酸之间更短的互补区域。

在一些实施方案中，亲和力增强核苷酸类似物包括包含一种或多种碱基修饰、糖修饰和/或骨架修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，用于亲和力增强核苷酸类似物中的经修饰碱基包括5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤。

在一些实施方案中，亲和力增强核苷酸类似物包括具有经修饰糖的核苷酸，例如2’-取代的糖，例如2’-O-烷基-核糖、2’-氨基-脱氧核糖、2’-氟-脱氧核糖、2’-氟-阿拉伯糖和2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’MOE)。在一些实施方案中，经修饰的糖为阿拉伯糖或d-阿拉伯糖-己糖醇糖。

在一些实施方案中，亲和力增强核苷酸类似物包括骨架修饰，例如使用肽核酸(PNA；例如，包括通过氨基酸骨架连在一起的核碱基的寡聚体)。其它骨架修饰包括硫代磷酸酯连键、磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基及其组合。

在一些实施方案中，多核苷酸包括至少一个具有经修饰碱基的亲和力增强核苷酸类似物、至少一个具有经修饰糖的核苷酸(可为相同核苷酸)和/或至少一个非天然存在的核苷酸间连键。

在一些实施方案中，亲和力增强核苷酸类似物含有为二环糖的锁核酸(“LNA”)糖。在一些实施方案中，用于本文所述方法中的多核苷酸包含具有LNA糖的一种或多种核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸含有一个或多个由具有LNA糖的核苷酸组成的区域。在其它实施方案中，多核苷酸含有具有点缀有脱氧核苷酸的LNA糖的核苷酸。参见，例如，Frieden,M.等(2008)Curr.Pharm.Des.14(11):1138-1142。

4.1.5.2.示例性引物

在一些实施方案中，提供了引物。在一些实施方案中，引物与靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207或13750的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸相同或互补。在一些实施方案中，引物也可包含与靶RNA不相同或互补的部分或区域。在一些实施方案中，引物与靶RNA相同或互补的区域相邻，以致引物与靶RNA不相同或互补的任何区域未破坏相同或互补区域。

在一些实施方案中，引物包含靶RNA中，例如选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA同样存在的部分。在一些此类实施方案中，包含靶RNA中同样存在的区域的引物能够与已经由RNA反转录的cDNA或已经通过扩增靶RNA或cDNA生成的扩增子选择性杂交。在一些实施方案中，引物与cDNA或扩增子的足够部分互补，以致其在使用的特殊测定的条件下与cDNA或扩增子选择性杂交。

如本文所使用，“选择性杂交”指多核苷酸，例如引物或探针，将与样本中的特定核酸杂交，其中亲和力比它与相同样本中存在的杂交区域中具有不同核苷酸序列的另一核酸杂交强至少5倍。例如，在实施例1中讨论了示例性杂交条件。在一些实施方案中，多核苷酸将与样本中的特定核酸杂交，其中亲和力比它与相同样本中存在的杂交区域中具有不同核苷酸序列的另一核酸杂交强至少10倍。

非限制示例性引物包括含选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA或另一种靶RNA的一个区域中同样存在或与之互补的序列的引物。非限制示例性引物包括含以下序列的多核苷酸：选自SEQ ID NO:42至61、81和82的序列；具有选自SEQ IDNO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个相邻核苷酸的序列；和具有选自SEQ IDNO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的序列。

在一些实施方案中，引物用于反转录(例如)本文讨论的靶RNA。在一些实施方案中，引物用于扩增靶RNA或由其反转录的cDNA。在一些实施方案中，此类扩增为(例如)本文讨论的定量PCR。在一些实施方案中，引物包含可检测部分。

4.1.5.3.示例性探针

在不同实施方案中，检测肺癌的存在的方法包括使样本的核酸与探针杂交。在一些实施方案中，探针包含与靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207和13750互补的部分。在一些实施方案中，探针包含靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207和13750中同样存在的部分。在一些此类实施方案中，与靶RNA互补的探针与靶RNA的足够部分互补，以致其在使用的特殊测定的条件下与靶RNA选择性杂交。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针与靶RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸互补。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针包含与靶RNA的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸互补的区域。即，与靶RNA互补的探针也可包含与靶RNA不互补的部分或区域。在一些实施方案中，探针与靶RNA互补的区域连续，以致探针与靶RNA不互补的任何区域未破坏互补区域。

在一些实施方案中，探针包含靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207和13750中同样存在的部分。在一些此类实施方案中，包含靶RNA中同样存在的区域的探针能够与已经由RNA反转录的cDNA或已经通过扩增靶RNA或cDNA生成的扩增子选择性杂交。在一些实施方案中，探针与cDNA或扩增子的足够部分互补，以致其在使用的特殊测定的条件下与cDNA或扩增子选择性杂交。在一些实施方案中，与cDNA或扩增子互补的探针与cDNA或扩增子的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸互补。在一些实施方案中，与靶RNA互补的探针包含与cDNA或扩增子的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸互补的区域。即，与cDNA或扩增子互补的探针也可包含与cDNA或扩增子不互补的部分或区域。在一些实施方案中，探针与cDNA或扩增子互补的区域连续，以致探针与cDNA或扩增子不互补的任何区域未破坏互补区域。

非限制示例性探针包括包含SEQ ID NO:42至61中提出的序列的探针和包含选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个相邻核苷酸的探针。非限制示例性探针包括包含SEQ ID NO:52至61中提出的序列的探针和包含选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的探针。

在一些实施方案中，可检测地量化一种或多种靶RNA的方法包括：(a)分离总RNA；(b)反转录靶RNA以生成与靶RNA互补的cDNA；(c)由(b)扩增cDNA；以及(d)使用实时RT-PCR和检测探针检测靶RNA的量。

如上所述，在一些实施方案中，使用FRET探针进行实时RT-PCR检测，FRET探针包括但不限于TaqMan

探针、分子信标探针和蝎型探针。在一些实施方案中，用TaqMan

探针，即通常具有在DNA的一端共价结合的荧光染料和在DNA的另一端共价结合的猝灭剂分子的线性探针，进行实时RT-PCR检测和量化。FRET探针包含与cDNA的区域互补的序列，以致当FRET探针与cDNA杂交时，猝灭染料荧光，并且当cDNA扩增期间消化探针时，染料从探针释放并且产生荧光信号。在此类实施方案中，样本中靶RNA的量与cDNA扩增期间测量的荧光的量成正比。

TaqMan

探针通常包含具有与靶RNA或由靶RNA模板反转录的其互补cDNA的区域互补的序列(即，与待检靶RNA互补或同样存在于其中的探针区域的序列)的相邻核苷酸区域，以致探针可与所得PCR扩增子特异性杂交。在一些实施方案中，探针包含具有与由靶RNA模板反转录的cDNA区域完全互补或同样存在于其中的序列的至少6个相邻核苷酸的区域，例如包含具有与由待检靶RNA反转录的cDNA区域互补或同样存在于其中的序列的至少8个相邻核苷酸、至少10个相邻核苷酸、至少12个相邻核苷酸、至少14个相邻核苷酸或至少16个相邻核苷酸的区域。

在一些实施方案中，具有与TaqMan探针序列互补的序列的cDNA区域在或接近cDNA分子的中心。在一些实施方案中，在互补区域的5’端和3’端各自存在cDNA的至少2个核苷酸，例如至少3个核苷酸，例如至少4个核苷酸，例如至少5个核苷酸。

在一些实施方案中，分子信标可用于检测并定量PCR产物。与TaqMan

探针一样，分子信标使用FRET，经由具有连接在探针末端的荧光染料和猝灭剂探针检测并定量PCR产物。与TaqMan

探针不同，在PCR循环期间分子信标保持完好。当游离于溶液中时，分子信标探针形成茎-环结构，从而使染料和猝灭剂足够靠近以引起荧光猝灭。当分子信标与靶标杂交时，破坏茎-环结构，以致染料和猝灭剂在空间上变得分离并且染料发荧光。例如，可从Gene Link^TM获得分子信标(参见http://www.genelink.com/newsite/products/mbintro.asp)。

在一些实施方案中，可使用蝎型探针作为序列特异性引物并且用于PCR产物检测和定量。与分子信标一样，当未与靶核酸杂交时蝎型探针形成茎-环结构。然而，与分子信标不同，蝎型探针实现了序列特异性引发和PCR产物检测。将荧光染料分子连接至蝎型探针的5’端，而将猝灭剂连接至3’端。探针的3’部分与PCR引物的延伸产物互补，并且该互补部分通过不可扩增部分与探针的5’端连接。蝎子引物延伸后，探针的靶特异性序列与延伸扩增子中它的互补体结合，从而打开茎-环结构并且使5’端的染料发荧光并产生信号。例如，可从Premier Biosoft International获得蝎型探针(参见http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/Scorpion.html)。

在一些实施方案中，可用于FRET探针上的标记包括比色和荧光标记，例如Alexa Fluor染料、BODIPY染料，例如BODIPY FL；CascadeBlue；Cascade Yellow；香豆素及其衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素、氨基香豆素和羟基香豆素；菁染料，例如Cy3和Cy5；伊红和赤藓红；荧光素及其衍生物，例如异硫氰酸荧光素；镧系元素离子的大环螯合物，例如Quantum Dye^TM；Marina Blue；俄勒冈绿(OregonGreen)；若丹明染料，例如若丹明红、四甲基若丹明和若丹明6G；德州红(Texas Red)；荧光能量转移染料，例如噻唑橙-乙锭杂二聚体；和TOTAB。

染料的具体实例包括但不限于以上鉴定的染料和下列染料：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750；胺反应性BODIPY染料，例如BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR和BODIPY-TR；Cy3、Cy5、6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、若丹明绿、若丹明红、肾造影剂、ROX、SYPRO、TAMRA、2′,4′,5′,7′-四溴磺酰荧光素和TET。

可由分子探针(Invitrogen)获得在用于本文所述方法的一些实施方案的RT-PCR探针的制备中有用的荧光标记核糖核苷酸的具体实例，并且这些实例包括Alexa Fluor 488-5-UTP、荧光素-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、四甲基若丹明-6-UTP、Alexa Fluor546-14-UTP、德州红-5-UTP和BODIPY TR-14-UTP。可由Amersham Biosciences(GE Healthcare)获得其它荧光核糖核苷酸，例如Cy3-UTP和Cy5-UTP。

在用于本文所述方法的RT-PCR探针的制备中有用的荧光标记的脱氧核糖核苷酸的实例包括二硝基苯(DNP)-1′-dUTP、CascadeBlue-7-dUTP、Alexa Fluor488-5-dUTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、若丹明绿-5-dUTP、Alexa Fluor532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、四甲基若丹明-6-dUTP、AlexaFluor 546-14-dUTP、Alexa Fluor 568-5-dUTP、德州红-12-dUTP、德州红-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、Alexa Fluor 594-5-dUTP、BODIPY630/650-14-dUTP、BODIPY650/665-14-dUTP；Alexa Fluor488-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor594-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP。荧光标记的核苷酸可商购并且可从(例如)Invitrogen购买。

在一些实施方案中，经由经修饰的核苷酸将染料和其它部分，例如猝灭剂引入本文所述方法中使用的多核苷酸，例如FRET探针中。“经修饰的核苷酸”指已经化学修饰，但是仍起核苷酸的作用的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有共价连接的化学部分，例如染料或猝灭剂，并且可(例如)通过固相合成多核苷酸引入多核苷酸中。在其它实施方案中，经修饰的核苷酸包括在将经修饰的核苷酸并入核酸之前、期间或之后可与染料或猝灭剂反应的一个或多个活性基团。在特定实施方案中，经修饰的核苷酸是经胺修饰的核苷酸，即，已经修饰成具有活性胺基的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含经修饰的碱基部分，例如尿苷、腺苷、鸟苷和/或胞苷。在特定实施方案中，经胺修饰的核苷酸选自5-(3-氨基烯丙基)-UTP；8-[(4-氨基)丁基]-氨基-ATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-ATP；N6-(4-氨基)丁基-ATP、N6-(6-氨基)丁基-ATP、N4-[2,2-氧基-二(乙胺)]-CTP；N6-(6-氨基)己基-ATP；8-[(6-氨基)己基]-氨基-ATP；5-炔丙基氨基-CTP、5-炔丙基氨基-UTP。在一些实施方案中，具有不同核碱基部分的核苷酸经类似修饰，例如代替5-(3-氨基烯丙基)-UTP的5-(3-氨基烯丙基)-GTP。例如，可从Applied Biosystems、Sigma、Jena Bioscience和TriLink商购许多经胺修饰的核苷酸。

示例性可检测部分还包括但不限于结合对的成员。在一些此类实施方案中，结合对的第一个成员与多核苷酸连接。结合对的第二个成员与可检测标记，例如荧光标记连接。当将与结合对的第一个成员连接的多核苷酸和与可检测标记连接的结合对的第二个成员孵育时，结合对的第一个和第二个成员缔合并且可检测到多核苷酸。示例性结合对包括但不限于生物素和链霉亲和素、抗体和抗原等。

在一些实施方案中，在单个多重反应中检测多种靶RNA。在一些此类实施方案中，当从探针上释放时靶向独特cDNA的每种探针在光谱上可区别。因此，通过独特的荧光信号检测每种靶RNA。

本领域的技术人员可为所选测定，例如实时RT-PCR测定选择适合的检测方法。所选检测方法无须为上述方法，并且可能是任何方法。

4.2.示例性组合物和试剂盒

在另一方面，提供了组合物。在一些实施方案中，提供了用于本文所述方法的组合物。

在一些实施方案中，组合物包含至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，组合物包含至少一种引物。在一些实施方案中，组合物包含至少一种探针。在一些实施方案中，组合物包含至少一种引物和至少一种探针。

在一些实施方案中，提供了包含至少一种靶RNA特异性引物的组合物。术语“靶RNA特异性引物”涵盖具有相邻核苷酸区域的引物，相邻核苷酸区域具有如下的序列(i)在靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207或13750中同样存在，或(ii)与靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207或13750中发现的相邻核苷酸区域的序列互补。

在一些实施方案中，提供了包含至少一种靶RNA特异性探针的组合物。术语“靶RNA特异性探针”涵盖具有相邻核苷酸区域的引物，相邻核苷酸区域具有如下序列(i)在靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207或13750中同样存在，或(ii)与靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207或13750中发现的相邻核苷酸区域的序列互补。

在一些实施方案中，靶RNA特异性引物和探针包含脱氧核糖核苷酸。在其它实施方案中，靶RNA特异性引物和探针包含至少一种核苷酸类似物。非限制示例性核苷酸类似物包括但不限于本文所述类似物，包括LNA类似物和肽核酸(PNA)类似物。在一些实施方案中，靶RNA特异性引物和探针包含至少一种增大杂交结合能的核苷酸类似物(例如，以上讨论的亲和力增强核苷酸类似物)。在一些实施方案中，本文所述组合物中的靶RNA特异性引物或探针与样本中的一种靶RNA结合。在一些实施方案中，单个引物或探针与多个靶RNA，例如多个miRNA异构体结合。

在一些实施方案中，组合物中存在一种以上对单个靶RNA有特异性的引物或探针，引物或探针能够与靶RNA的重叠或空间分离区域结合。

应理解，即使下文未明确说明在其中将本文所述组合物设计为与由靶RNA反转录的cDNA杂交的一些实施方案中，所述组合物包含具有在靶RNA中同样存在的序列(或其区域)的至少一种靶RNA特异性引物或探针(或其区域)。

在一些实施方案中，组合物包含靶RNA特异性引物。在一些实施方案中，靶RNA特异性引物对小U2、miR-720、miR-451、13207或13750有特异性。在一些实施方案中，组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种靶RNA的每一种的多种靶RNA特异性引物。

在一些实施方案中，组合物包含靶RNA特异性探针。在一些实施方案中，靶RNA特异性探针对小U2、miR-720、miR-451、13207或13750有特异性。在一些实施方案中，组合物包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种靶RNA的每一种的多种靶RNA特异性探针。

在一些实施方案中，组合物为含水组合物。在一些实施方案中，含水组合物包含缓冲组分，例如磷酸盐、tris、HEPES等，和/或以下讨论的另外组分。在一些实施方案中，组合物干燥，例如经冻干，并且适合通过添加液体复水。干燥组合物可包括缓冲组分和/或另外组分。

在一些实施方案中，组合物包含一种或多种另外组分。另外组分包括但不限于盐，例如NaCl、KCl和MgCl₂；聚合酶，包括耐热性聚合酶；dNTP；RNA酶抑制剂；牛血清白蛋白(BSA)等；还原剂，例如β-巯基乙醇；EDTA等。本领域的技术人员可根据组合物的预期用途选择适合的组合物组分。

在一些实施方案中，提供了包含与基质连接的靶RNA特异性探针的可寻址微阵列组分。

用于本文所述方法中的微阵列包含探针共价或非共价连接于其上的固体基质。在一些实施方案中，能够与一种或多种靶RNA或cDNA杂交的探针在限定位置(“可寻址阵列”)与基质连接。正如本领域人员所意识到，探针可以多种方式与基质连接。在一些实施方案中，首先合成探针，并随后与基质连接。在其它实施方案中，在基质上合成探针。在一些实施方案中，使用例如光致聚合和光刻法等的技术在基质表面合成探针。

在一些实施方案中，固体基质是修饰为含有适于探针连接或缔合的离散个体位点并且可受至少一种检测方法检验的材料。基质的代表性实例包括玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯和苯乙烯与其它物质的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龙或硝化纤维、树脂、二氧化硅或硅基材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃和塑料。在一些实施方案中，基质允许光学检测，无需明显地发荧光。

在一些实施方案中，基质平坦。在其它实施方案中，将探针置于管的内表面，(例如)以进行流通样本分析以将样本体积减到最小。在其它实施方案中，探针可位于多孔板的孔中。还有其它实施方案中，探针可与可寻址微珠阵列连接。在还有其它实施方案中，探针可与柔性基质连接，例如软泡沫，包括由特定塑料制成的闭孔泡沫。

基质和探针可各自经官能团衍生以便二者随后连接。例如，在一些实施方案中，基质经一个或多个化学官能团衍生，所述化学官能团包括但不限于氨基、羧基、桥氧基和硫醇基。在一些实施方案中，探针通过一个或多个官能团与基质直接连接。在一些实施方案中，探针通过连接子(即，将杂交和检测中涉及的探针区域与基质表面间隔开的相邻核苷酸区域)与基质间接连接。在一些实施方案中，探针通过5′末端与固体支撑物连接。在其它实施方案中，探针通过3′末端连接。还有其它实施方案中，探针通过内部核苷酸与基质连接。在一些实施方案中，探针与固体支撑物非共价连接，例如经生物素-链霉亲和素相互作用，其中生物素化探针和基质表面共价涂覆链霉亲和素。

在一些实施方案中，组合物包含具有与基质连接的探针的微阵列，其中至少一个探针(或其区域)包含小U2、miR-720、miR-451、miR-13207或13750的区域中同样存在或与之互补的序列。在一些实施方案中，除包含那些RNA中至少一个的区域中同样存在或与之互补的序列的探针外，微阵列进一步包含含另一种靶RNA的区域中同样存在或与之互补的序列的至少一个探针。在一些实施方案中，除包含那些RNA中至少一个的区域中同样存在或与之互补的序列的探针外，微阵列进一步包含含其它靶RNA的区域中同样存在或与之互补的序列的至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个探针。在一些实施方案中，微阵列包含每种在微阵列上唯一一个位置的靶RNA特异性探针。在一些实施方案中，微阵列包含在微阵列上多个位置的至少一种靶RNA特异性探针。

如本文所使用，术语与靶RNA(或其靶区域)“互补”或“部分互补”和探针序列与靶RNA序列的“互补性”百分比是与靶RNA序列的反向互补体的“同一性”百分比。在测定本文所述组合物中使用的探针(或其区域)和靶RNA，例如本文公开的靶RNA之间的“互补性”程度中，将“互补性”程度表示为探针(或其区域)的序列和与之最佳比对的靶RNA序列的反向互补体之间的同一性百分比。通过计数2个序列之间相同的比对碱基的数量，除以探针中相邻核苷酸的总数，并且乘以100计算百分比。

在一些实施方案中，微阵列包含具有序列与靶RNA的靶区域完全互补的区域的至少一种探针。在其它实施方案中，微阵列包含具有与靶RNA的最佳比对靶区域的序列比较时，序列包含一个或多个碱基错配的区域的至少一种探针。

在一些实施方案中，微阵列包含具有小U2、miR-720、miR-451、13207或13750中同样存在或与之互补的至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个相邻核苷酸的区域的至少一种探针。在一些实施方案中，微阵列包含具有另一靶RNA的区域中同样存在或与之互补的至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个相邻核苷酸的区域的至少一种探针。

在一些实施方案中，微阵列包含具有序列与靶RNA互补的区域的探针，所述靶RNA包含人miRNome的主要部分(即，在构造微阵列时已经被其他人登记到miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)的公开微RNA)，例如人miRNome的至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%，甚至至少约95%。在一些实施方案中，微阵列包含具有序列在靶RNA中同样存在的区域的探针，所述靶RNA包含人miRNome的主要部分，例如人miRNome的至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%，甚至至少约95%。

在一些实施方案中，提供了包含与微珠连接的探针的组分，所述微珠例如Luminex出售的微珠，其各自经不同强度的红色和红外荧光团内部染色以为每种珠粒产生独特信号。在一些实施方案中，用于进行本文所述方法的组合物包括多种微珠，各自具有独特光谱特征。每个经独特标记的微珠与独特靶RNA特异性探针连接，以致来自珠粒中染料的独特光谱特征与特定探针序列相关联。非限制示例性探针序列包括SEQ ID NO:42至61、81和82。非限制示例性探针序列包括具有选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个相邻核苷酸的序列。非限制示例性探针序列包括具有选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的序列。非限制示例性探针序列还包括包含小U2、miR-720、miR-451、13207或13750中同样存在或与之互补的区域的探针。非限制示例性探针序列还包括包含其它靶RNA中同样存在或与之互补的区域的探针。

在一些实施方案中，经独特标记的微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补的区域。在一些实施方案中，经独特标记的微珠有探针与之连接，所述探针包含选自SEQ ID NO:42至61、81和82的序列。在一些实施方案中，经独特标记的微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列具有选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个相邻核苷酸的区域。在一些实施方案中，经独特标记的微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列具有选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的区域。在一些实施方案中，经独特标记的微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列在另一靶RNA的区域中同样存在或与之互补的区域。

在一些实施方案中，提供了包含多种经独特标记的微珠的组合物，其中至少一种微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补的区域。在一些实施方案中，提供了包含多种经独特标记的微珠的组合物，其中至少一种微珠有探针与之连接，所述探针包含选自SEQ IDNO:42至61、81和82的序列。在一些实施方案中，提供了包含多种经独特标记的微珠的组合物，其中至少一种微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列具有选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个相邻核苷酸的区域。在一些实施方案中，提供了包含多种经独特标记的微珠的组合物，其中至少一种微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列具有选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的区域。在一些实施方案中，提供了包含多种经独特标记的微珠的组合物，其中至少一种微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补的区域，并且至少一种微珠有探针与之连接，所述探针具有其序列在另一靶RNA的区域中同样存在或与之互补的区域。

在一些实施方案中，组合物包含多种经独特标记的微珠，其各自有独特探针与之连接，所述探针具有与包含人miRNome的主要部分，例如人miRNome的至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%的靶RNA互补的区域。在一些实施方案中，组合物包含多种经独特标记的微珠，其具有独特探针与之连接，所述探针具有其序列在包含人miRNome的主要部分，例如人miRNome的至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%的靶RNA中同样存在的区域。

在一些实施方案中，提供了包含用于检测至少一种靶RNA的至少一种多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，多核苷酸用作反转录酶反应的引物。在一些实施方案中，多核苷酸用作扩增的引物。在一些实施方案中，多核苷酸用作RT-PCR的引物。在一些实施方案中，多核苷酸用作检测至少一种靶RNA的探针。在一些实施方案中，多核苷酸经可检测标记。在一些实施方案中，多核苷酸为FRET探针。在一些实施方案中，多核苷酸为TaqMan

探针、分子信标或蝎型探针。

在一些实施方案中，组合物包含具有在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补的序列的至少一种FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含具有选自SEQ ID NO:42至61、81和82的序列的至少一种FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含具有其序列具有选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个相邻核苷酸的区域的至少一种FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含具有其序列具有选自SEQ ID NO:52至61的序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个或至少70个相邻核苷酸的区域的至少一种FRET探针。在一些实施方案中，组合物包含具有其序列在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补的区域的至少一种FRET探针和具有其序列在另一靶RNA区域中同样存在或与之互补的区域的至少一种FRET探针。

在一些实施方案中，FRET探针经供体/受体对标记，以致在PCR反应期间探针消化时，其产生与特异性靶RNA相关的独特荧光发射。在一些实施方案中，当组合物包含多个FRET探针时，每个FRET探针经不同供体/受体对标记，以致在PCR反应期间探针消化时，每个探针产生与特异性探针序列和/或靶RNA相关的独特荧光发射。在一些实施方案中，FRET探针的序列与靶RNA的靶区域互补。在其它实施方案中，当与靶RNA的最佳比对靶区域的序列比较时FRET探针具有包含一个或多个碱基错配的序列。

在一些实施方案中，组合物包含由至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个核苷酸组成的FRET探针，其中至少一部分序列在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补。在一些实施方案中，FRET探针的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个核苷酸在小U2、miR-720、miR-451、13207或13750区域中同样存在或与之互补。在一些实施方案中，FRET探针具有与小U2、miR-720、miR-451、13207或13750的序列或互补序列比较时带1、2或3个碱基错配的序列。

在一些实施方案中，组合物进一步包含由至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或至少25个相邻核苷酸组成的FRET探针，其中FRET探针包含在另一靶RNA的区域中同样存在或与之互补的序列。在一些实施方案中，FRET探针在另一靶RNA的至少10个、至少11个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个或至少24个相邻核苷酸的区域中同样存在或与之互补。

在一些实施方案中，试剂盒包含以上讨论的多核苷酸。在一些实施方案中，试剂盒包含以上讨论的至少一种引物和/或探针。在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种聚合酶，例如耐热性聚合酶。在一些实施方案中，试剂盒包含dNTP。在一些实施方案中，用于本文所述实时RT-PCR方法中的试剂盒包含一种或多种靶RNA特异性FRET探针和/或用于反转录靶RNA的一种或多种引物和/或用于扩增靶RNA或由其反转录的cDNA的一种或多种引物。

在一些实施方案中，一种或多种引物和/或探针为“线性”的。“线性”引物指为单链分子，并且通常不包含(例如)至少3、4或5个相邻核苷酸的短区域的多核苷酸，所述相邻核苷酸与相同核苷酸中的另一区域互补，以致引物形成内部双链体。在一些实施方案中，用于反转录的引物在3’端包含至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个或更多个相邻核苷酸的区域，所述区域具有与靶RNA的5’端的至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个或更多个相邻核苷酸的区域互补的序列。

在一些实施方案中，试剂盒包含用于扩增由靶RNA，例如小U2、miR-720、miR-451、13207或13750反转录的cDNA的一对或多对线性引物(“正向引物”和“反向引物”)。相应地，在一些实施方案中，第一引物包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个相邻核苷酸的区域，其序列与靶RNA的5’端的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个相邻核苷酸的区域的序列相同。而且，在一些实施方案中，第二引物包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个相邻核苷酸的区域，其序列与靶RNA的3’端的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个相邻核苷酸的区域的序列互补。在一些实施方案中，试剂盒包含用于扩增由小U2、miR-720、miR-451、13207或13750反转录的cDNA的至少第一组引物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于扩增由另一靶RNA反转录的cDNA的至少第二组引物。

在一些实施方案中，试剂盒包含至少2组、至少5组、至少10组、至少15组、至少20组、至少25组、至少30组、至少40组、至少50组、至少60组、至少75组或至少100组引物，其各自用于扩增由不同靶RNA，包括小U2、miR-720、miR-451、13207和13750反转录的cDNA。在一些实施方案中，试剂盒包含至少一组能够扩增由样本中的靶RNA反转录的一种以上的cDNA的引物。

在一些实施方案中，用于本文所述组合物中的探针和/或引物包含脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，用于本文所述组合物中的探针和/或引物包含脱氧核糖核苷酸和一种或多种核苷酸类似物，例如LNA类似物或上述其它双链体稳定核苷酸类似物。在一些实施方案中，用于本文所述组合物中的探针和/或引物包含所有核苷酸类似物。在一些实施方案中，所述探针和/或引物在互补区域中包含一种或多种双链体稳定核苷酸类似物，例如LNA类似物。

在一些实施方案中，本文所述组合物还包含对用于标准化靶RNA的量的一个或多个管家基因有特异性的探针和引物(在RT-PCR的情况下)。此类探针(和引物)包括对选自U6 snRNA、ACTB、B2M、GAPDH、GUSB、HPRT1、PPIA、RPLP、RRN18S、TBP、TUBB、UBC、YWHA(TATAA)、PGK1和RPL4的管家基因的一种或多种产物有特异性的探针(和引物)。

在一些实施方案中，用于本文所述实时RT-PCR方法中的试剂盒进一步包含用于反转录和扩增反应的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含酶(例如反转录酶)和热稳定性DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于反转录和扩增的三磷酸核糖核苷酸(dNTP)。在更多实施方案中，试剂盒包含为探针和引物的特异性杂交而优化的缓冲液。

4.2.1.RNA水平的示例性标准化

在一些实施方案中，靶RNA水平的定量需要对每个细胞的总RNA和样本制备期间样本损失的程度进行假定。为了修正不同样本之间或在不同条件下制备的样本之间的差异，将一些实施方案中的靶RNA的量标准化为至少一个内源管家基因的水平。

在本文所述方法中用作参考基因的适当基因包括就其而论，在正常和癌性肺部细胞之间，或在不同细胞系之间或在不同生长及样本制备条件下产物的量不变的基因。在一些实施方案中，在本文所述方法中用作标准化对照的内源管家基因包括但不限于U6 snRNA、RNU44、RNU 48和U47。在典型实施方案中，用于标准化RNA测得量的所述至少一个内源管家基因选自U6 snRNA、U6 snRNA、RNU44、RNU 48和U47。在一些实施方案中，使用一个管家基因标准化。在一些实施方案中，使用一个以上的管家基因标准化。

在一些实施方案中，向患者样本，例如血清样本中添加外标(spike-in)对照多核苷酸作为对照。非限制示例性外标对照为CelmiR-39。在一些实施方案中，使用外标对照修正由样本，例如血清纯化RNA的偏差。在一些实施方案中，在与靶RNA相同或相似的测定中检测外标对照。本领域的技术人员可根据应用选择适合的外标对照。

4.2.2.示例性定性方法

在一些实施方案中，方法包括检测与正常靶RNA谱(在一些示例性实施方案中，为对照样本的靶RNA谱)相比，由临床样本生成的靶RNA谱的质变。RNA谱的一些质变表明由其获得临床样本的受试者中肺癌的存在。RNA谱的各种质变表明转为肺癌的倾向。术语“靶RNA谱”指关于相同样本中多种靶RNA的并发水平的一组数据。

在一些实施方案中，所述多种靶RNA中的至少一种靶RNA是选自小U2、miR-720、miR-451、13207或13750的至少一种RNA。在一些实施方案中，所述多种靶RNA中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或至少5种靶RNA选自小U2、miR-720、miR-451、13207或13750。在一些实施方案中，所述多种靶RNA包含至少1种、至少2种、至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少40种、至少50种、至少60种、至少75种或至少100种另外靶RNA。在一些实施方案中，呈其成熟形式的靶RNA包含少于30个核苷酸。在一些实施方案中，靶RNA为微RNA。在一些实施方案中，靶RNA为小细胞RNA。

使用任何适合分析方法，包括本文提出的分析方法获得用于制备靶RNA谱的定性数据。

在一些实施方案中，例如，使用(例如)如上所述的微阵列获得并发RNA谱数据。因此，除用于定量测定如上所述的特异性靶RNA的水平外，可采用包含具有与miRNome的主要部分互补的序列的探针的微阵列进行靶RNA绘图，以分析靶RNA表达模式。

根据RNA绘图方法，在一些实施方案中，定量反转录来自怀疑患有肺癌的受试者的样本的总RNA以提供一组与样本中的RNA互补的标记多核苷酸。然后使多核苷酸与包含靶RNA特异性探针的微阵列杂交以提供样本的杂交图谱。结果是表示样本的靶RNA图谱的样本杂交图谱。杂交图谱包含来自由样本反转录的多核苷酸与微阵列中的靶RNA特异性探针结合的信号。在一些实施方案中，将图谱记录为存在或不存在结合(信号对比零信号)。在一些实施方案中，记录的图谱包括来自每次杂交的信号的强度。将图谱与由正常(即非癌)或(在一些实施方案中)对照样本生成的杂交图谱作比较。信号的改变表明受试者中肺癌的存在。

4.3.示例性另外靶RNA

在一些实施方案中，联合检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA，方法包括检测一种或多种另外靶RNA。另外靶RNA包括但不限于微RNA、其它小细胞RNA和mRNA。在一些实施方案中，选择已经证实通常与肺癌或特定类型或阶段的肺癌相关的一种或多种另外靶RNA。

在一些实施方案中，本文所述方法进一步包括检测染色体共存体，即，人类基因组中相互群集，倾向于一起调节的靶RNA。相应地，在更多实施方案中，所述方法包括检测各自位于染色体中，距选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA的染色体定位不超过50,000bp的一种或多种靶RNA的表达。

4.4.药物组合物和治疗方法

在一些实施方案中，本公开涉及治疗其中在个体的肺癌细胞中靶RNA的表达失调，例如上调或下调的肺癌的方法。在一些实施方案中，本公开涉及治疗其中在个体的肺癌细胞中靶RNA的水平相对于正常细胞或血清改变，例如更低或更高的肺癌的方法。当癌细胞中至少一种分离的靶RNA，例如小U2上调时，所述方法包括向个体施用有效量的抑制所述至少一种靶RNA的表达的至少一种化合物，以便抑制肺癌细胞的增殖。或者，在一些实施方案中，当癌细胞中至少一种靶RNA上调时，所述方法包括向个体施用有效量的抑制所述至少一种靶RNA的活性的至少一种化合物，以便抑制肺癌细胞的增殖。在一些实施方案中，此类化合物可为多核苷酸，包括包含经修饰核苷酸的多核苷酸。

当肺癌细胞中至少一种靶RNA，例如miR-451、miR-720、13207和/或13750下调时，所述方法包括施用有效量的分离靶RNA(即，在一些实施方案中，经化学合成、重组表达或由其自然环境中纯化的靶RNA)或其分离变体或生物活性片段，以便抑制个体中癌细胞的增殖。

本公开进一步提供了治疗肺癌的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含抑制小U2的表达或活性的化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少一种分离靶RNA或其分离变体或生物活性片段及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述至少一种分离靶RNA与肺癌细胞中存在的相对于正常水平(在一些示例性实施方案中，相对于对照样本中靶RNA的水平)，水平降低的靶RNA，例如miR-720、miR-451、13207和/或13750相对应。

在一些实施方案中，分离的靶RNA与癌细胞中下调的内源野生型靶RNA基因产物相同。在一些实施方案中，分离的靶RNA为变体靶RNA或其生物活性片段。如本文所使用，“变体”指与相应野生型靶RNA具有小于100%序列同一性，但是仍具有野生型靶RNA的一种或多种生物活性(例如，抑制靶RNA分子表达和肺癌相关细胞过程的能力)的靶RNA基因产物。靶RNA的“生物活性片段”是具有野生型靶RNA的一种或多种生物活性的靶RNA基因产物片段。在一些实施方案中，分离的靶RNA可与一种或多种另外抗癌治疗一起施用，包括但不限于化疗、放疗及其组合。在一些实施方案中，分离的靶RNA与另外抗癌治疗同时施用。在一些实施方案中，分离的靶RNA与另外抗癌治疗依次施用。

在一些实施方案中，药物组合物包含抑制靶RNA的表达或活性的至少一种化合物。在一些实施方案中，所述化合物对在肺癌细胞中其水平相对于正常水平(在一些示例性实施方案中，相对于对照样本中靶RNA的水平)升高的一种或多种靶RNA有特异性。在一些实施方案中，靶RNA抑制剂对特定靶RNA，例如小U2有特异性。在一些实施方案中，靶RNA抑制剂包含与小U2和/或其它靶RNA的至少一部分互补的核苷酸序列。

在一些实施方案中，靶RNA抑制剂选自双链RNA、反义核酸和酶促RNA分子。在一些实施方案中，靶RNA抑制剂为小分子抑制剂。在一些实施方案中，靶RNA抑制剂可与其它抗癌治疗联合施用，包括但不限于化疗、放疗及其组合。在一些实施方案中，靶RNA抑制剂与其它抗癌治疗同时施用。在一些实施方案中，靶RNA抑制剂与其它抗癌治疗依次施用。

在一些实施方案中，根据Semple等，Nature Biotechnology advanceonline publication，2010年1月17日(doi:10.1038/nbt.1602))配制并施用药物组合物，所述文献以引用的方式整体并入本文用于任何目的。

如本文所使用，术语“治疗”指改善肺癌相关的症状，包括预防或延迟症状的发作和/或减轻肺癌症状的严重程度或频率。

术语靶RNA或靶RNA表达或活性的抑制剂的“有效量”是足以抑制患有肺癌的个体中癌细胞的增殖的量。本领域的技术人员易于确定用于本文公开的药物组合物中的化合物的有效量，例如通过考虑例如待治疗个体的大小和体重、疾病的阶段、个体的年龄、健康和性别、施用途径和局部或全身施用等因素。

除分离的靶RNA、靶RNA抑制剂或其药学上可接受的盐外，本文公开的药物组合物进一步包含药学上可接受的载体，包括但不限于水、缓冲水、生理盐水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸和透明质酸。在一些实施方案中，药物组合物包含封装于(例如)脂质体内的分离靶RNA或靶RNA抑制剂。在一些实施方案中，药物组合物包含(例如)通过如以上4.1.5节中描述的核酸骨架的修饰，对核酸酶有抗性的分离靶RNA或靶RNA抑制剂。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂和缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含至少一种化学治疗剂，包括但不限于烷化剂、抗代谢物、表鬼臼毒素、蒽环霉素、长春花生物碱、植物生物碱和萜类、单克隆抗体、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、铂化合物、蛋白激酶抑制剂和反义核酸。

药物组合物可呈溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、颗粒、胶囊、含液体胶囊、粉末、缓释制剂、栓剂、乳液、气雾剂、喷雾剂、悬浮液形式或适合使用的任何其它形式。施用方法包括但不限于口服施用、肠胃外施用、静脉内施用、口服施用和通过吸入施用。

下列实施例仅仅是为了说明目的，并非意在以任何方式限制。

5.实施例

5.1 实施例1：通过微阵列测定肺部原发性肿瘤中的小RNA水平

所选群体

群体中包括13名诊断患有肺癌的患者，9名男性和4名女性。其中7名患者从未吸烟，而6名患者有严重吸烟史。因为鳞状细胞肺癌和非鳞状细胞肺癌是最常见的两种肺癌类型(超过所有肺癌的70%)，包括3名诊断患有鳞状细胞癌的患者(Epi-4、Kmalp-21、Kmalp-25)和6名诊断患有非鳞状细胞癌的患者(Adk-2、Adk-9、Adk-10、Adk-15、Adk-23和Adk-29)。另外，还选择了1名诊断患有类癌的患者(Car-13)、1名诊断患有肉瘤样癌的患者(Ksarc-19)、1名诊断患有小细胞肺癌的患者(Scc-27)和1名诊断患有大细胞神经内分泌癌的患者(Lcnec-31)。表1示出了群体中患者的列表和每名患者的各种临床特征。

表1.群体中患者的临床特征

PT=原发性肿瘤

ANT=相邻正常组织

4名患者具有极具攻击性的肺癌形式，Ksarc-19(肉瘤样癌)、Adk-10和Adk-29(均为非鳞状细胞癌)和Lcnec-31。患者Ksarc-19在手术1个月后复发并于6个月后死亡。患者Car-13(类癌)具有缓慢生长的肺癌形式。

仅从4名患者收集了原发性肿瘤，而从其余9名收集原发性肿瘤和相邻正常组织。对于所有患者而言，测定原发性肿瘤中肿瘤细胞与正常细胞的相对量介于90%和100%之间。从尽可能远离原发性肿瘤的位置收集相邻正常组织，并且不含可检测的肿瘤细胞。

组织样本

使用来自肺部原发性肿瘤的存档或新鲜速冻样本。用研钵和研棒使组织样本于TRIzol

试剂(Invitrogen;Carlsbad,CA)中匀化并根据生产商的方案提取RNA。将RNA样本稀释于无RNA酶的水中并于-80℃(-112℉)下储存。

小RNA制备

使用Flash PAGE分馏器(Ambion)使所有样本富集小RNA成分。简言之，使用Flash PAGE分馏器将总RNA样本上样至预制凝胶上。凝胶移位后回收小于40nt的总RNA成分(“小RNA成分”)并重新悬浮于无核酸酶的水中。

微阵列分析

探针设计和点样

用于微阵列制备的多核苷酸探针具有构型5’-NH₂-(C)₆-(间隔区)-(寡聚体探针序列)-3’。5’-氨基允许化学键接于阵列支撑物。每个探针还包括如下所示15nt的相同间隔区序列，以防止多核苷酸探针与阵列支撑物的非特异性相互作用。

5′氨基C6-TTGTAATACGACTCA–寡聚探针序列。(SEQ ID NO:62)

本文的探针序列省略了连接子。因为最初将微阵列设计为检测微RNA水平，所以似乎已经与小U2RNA杂交的探针是miR-1290的探针，其具有序列：

5′-TCCCTG

TCCAAAAATCCA-3′(SEQ ID NO：663)

该序列与小U2序列的互补体只有一个核苷酸不同，用粗体显示。

由Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)根据标准方案合成探针。使用Nexterion(Schott)微阵列载玻片作为微阵列的固体支撑物。

用于点样的多核苷酸探针浓度为25μmol。使用Schott的具有阵列玻璃支撑物添加有1%SDS(十二烷基硫酸钠)允许更大点尺寸(例如，与无SDS的70-100μm相比，100-150μm)的Nexterion点样缓冲液为探针点样，一式两份。使用的点样仪是装备有Stealth SMP3针(Telechem)的QArray mini(Genetix)。一系列点沉淀后，在为下一系列的探针点样之前用60mM NaOH洗涤点样针5次。每个载玻片设计有48块点样探针，每一区块为20×18平方的点样探针。每个探针点样一式两份。使用前将点样载玻片储存在4℃下。

小RNA标记

小RNA成分的标记改编自European Molecular Biology Group在EMBL(Heidelburg,Germany)研发的公开方案(Castoldi等，RNA 2006年5月;12(5):913-20，以引用的方式整体并入本文)。简言之，在4℃下将小RNA成分与含有10μM于用无RNA酶的水稀释至1X的Ambion缓冲液中的经染料标记的四核苷酸(5’-rUrUrUrU–Cy5-3’)(或可选地，5’-rUrUrUrU–Cy3-3’)(Biospring,Germany)、8%聚乙二醇(PEG)、2mM三磷酸腺苷(ATP)和T4RNA连接酶(0.7U/μl)的混合物孵育6小时。通过在65℃下加热混合物15分钟进行标记反应。这个过程将聚U染料标记的尾连接至所有小RNA的3’端。杂交之前将标记样本储存在4℃下。

阵列杂交

使用Discovery杂交站(Ventana,Tucson,AZ)使标记小RNA成分与点样阵列杂交。简言之，2mL的1%BSA、2X SSC和0.2% SDS混合物与芯片一起在42℃下孵育30分钟。然后使用EZ Prep缓冲液(Ventana)洗涤芯片1次，然后再用Ribowash(Ventana)洗涤3次。接着，向阵列中添加20μl标记小RNA混合物和180μl ChipHybe试剂(Ventana)。在37℃下加热阵列6分钟，然后在42℃下孵育8小时，之后停止加热。用Ribowash(Ventana)洗涤芯片1次，然后在37℃下加热2分钟。再用添加了1滴CheapClean(Ventana)的Ribowash(Ventana)洗涤芯片，并且在37℃下孵育2分钟。再用Ribowash(Ventana)洗涤芯片2次。干燥储存芯片过夜。第二天，根据Ventana对Discovery杂交站的说明进行最后洗涤。用2X SSC+0.2XSDS缓冲液洗涤载玻片2次，然后再用0.1X SSC洗涤1次。在室温下使用来自Arrayit(TeleChem International,Sunnyvale,CA)的高速离心机干燥所有载玻片并且在扫描之前于黑暗中保存。

阵列图像采集

使用Axon^TM扫描仪(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)及其Genepix^TM软件扫描阵列。将图像格式化为tif格式，按16b/像素(1600*1600)的图像颜色深度定义。在这种设置下，像素可假定范围从0至65,535的强度值。表现出最大强度值的像素“饱和”并且赋值为65,535。阵列扫描的分辨率设为10μm/像素。对于使用不同荧光染料(例如，Cy5和Cy3)的杂交实验，将光电倍增管(PMT)调节至较高强度点(在低于Cy5的PMT设置下扫描Cy3)。

阵列图像分析

激光扫描仪的PMT将载玻片每个指定“点”的捕获荧光强度数字化并且将数值存储为与该点相对应的像素。然后分析由此类像素构成的图片。图像分析的第一项任务是使用称为分割的过程检测斑点位置。用适用或固定半径的圆圈分割斑点。为了可靠分割和量化，斑点直径需要大于5-6个像素。分割之前提供分度网格，指定斑点的适当位置。分割本身检测了靠近网格圆圈的斑点界限。简言之，Genepix软件为阵列上的每个斑点分配圆圈(分割)。因为斑点几乎从未在完美矩形网格上，由于点样缺陷和/或支撑物变形，所以必须以较为灵活的方式进行分割。

用软件分割后，手动修改圆圈并调节到斑点上，直至清晰识别阵列上的所有斑点。在这个阶段，如果阵列呈现妨碍将真实斑点与背景加以区别的高背景噪音，拒绝阵列进行进一步分析。

图像分析的第二项任务是量化斑点并将数据输出至结果文件中。一旦使斑点定位于图像上，这就是相对容易且良好定义的任务。量化斑点强度使用最频繁的统计法是属于斑点的像素的平均值或中值。在离群像素的存在下，中值法比平均值更强。然而，实际上，使用平均值或中值获得的结果差异很小。

阵列数据分析

使用R生物导体包分析所有阵列数据(“生物导体：对计算生物学和生物信息学的开放软件研发，”Genome Biol.2004;5(10):R80.Epub 2004年9月15日，其以引用的方式整体并入本文)。

首先通过比较内部对照的斑点强度测试阵列数据的质量。一个内部对照(SEQ ID NO:64；表2)用作标记对照(标记之前将这种合成RNA添加到纯化小RNA成分中)，而其它6个内部对照(SEQ ID NO:65至70；表2)用于数据的标准化(在各520fmol/个阵列杂交之前将这些合成RNA对照添加到总RNA成分中)。表2中还示出了与合成RNA结合的探针序列和突变探针序列(SEQ ID NO:71至78)。

表2

用于微阵列实验中的对照序列

序列(5’-3’)	序列标识号
		CGCGCGUCGCUUUAUCUACUGU	SEQ ID NO：64；CTL30_COMP
UUAUCGUUCGAUAAGUCGCGUU	SEQ ID NO：65；CTL11_COMP
		GAAGUUACUAUGUAGGCAACCU	SEQ ID NO：66；CTL23_COMP
CGCGGGACUAAUUGUUACCGGG	SEQ ID NO：67；CTL26_COMP
		UCGCGUCGAACUCCGCAACCGA	SEQ ID NO：68；CTL29_COMP
ACCGAACGCCGUACCCAUCGGG	SEQ ID NO：69；CTL31_COMP
		CGAGGGUAACGACUCUCGUGUC	SEQ ID NO：70；CTL36_COMP
TTGTAATACGACTCAACAGTAGATAAAGCGACGCGCG	SEQ ID NO：71；CTL30
		TTGTAATACGACTCAAACGCGACTTATCGAACGATAA	SEQ ID NO：72；CTL11
TTGTAATACGACTCAAGGTTGCCTACATAGTAACTTC	SEQ ID NO：73；CTL23
		TTGTAATACGACTCACCCGGTAACAATTAGTCCCGCG	SEQ ID NO：74；CTL26
TTGTAATACGACTCATCGGTTGCGGAGTTCGACGCGA	SEQ ID NO：75；CTL29
		TTGTAATACGACTCACCCGATGGGTACGGCGTTCGGT	SEQ ID NO：76；CTL31
TTGTAATACGACTCAGACACGAGAGTCGTTACCCTCG	SEQ ID NO：77；CTL36
		TTGTAATACGACTCACCCGGTAACAATTAGACCCGCG	SEQ ID NO：78；CTL26_MUT

其斑点强度高于平均局部本底强度加上其标准偏差的1．5倍的所有序列分类为表达小RNA。为了考虑做进一步分析有效的阵列强度数据，需要满足下列标准：

1．杂交对照的特异性必须在接受标准内(例如CTL26与其相应的单碱基突变体CTL26_MUT)。

2．阳性对照复制的信号强度近似相等

3．对于每一区块基于阳性对照的中间区块信号强度之间近似相等

4．基于检测的所有序列的中间阵列信号之间近似相等

5．纯化和标记对照(CTL30)的信号强度。

通过计算Log2比例进行数据的统计标准化，其中Log2比例等于复制斑点的平均强度信号/所述区块的所有阳性对照的中值强度。为每一区块进行标准化以避免不均匀标记阵列的所有区块。已经证实这种区块-区块标准化比使用载玻片的整体标准化更有效。获得值为Log2值。

比较来自肺癌原发性肿瘤与正常肺部组织的样本中每种多核苷酸探针的斑点强度，产生每种小RNA，例如微RNA的相对水平的估值。

RNA水平的倍数变化与2^(Log2比例)相对应。Log2比例是比较的两种情况之间的比例，或log2(X原发性肿瘤/X正常)，其与(log2X原发性肿瘤–log2X正常)相同，其中X为测量强度值。在没有来自“正常”情况的信号的情况下，将实验中的最低测量强度值用作计算倍数变化值的基线。小于0的倍数变化值与(1/倍数变化)下调次数相对应。

结果

对于分析的大多数原发性肿瘤观察到小U2水平升高。虽然最初将这种RNA鉴定为序列上有一个核苷酸不同的miR-1290，但是如以下所讨论，为血清样本测序后变得明显的是该测定和其它测定中检测到小U2，并且在来自肺癌患者的血清中存在的小U2水平高于来自健康个体的血清。

表3示出了每种组织小U2的标准化信号值。表3还示出了以两种不同方式计算的小U2水平的倍数变化。首先，为从中收集相邻正常组织的的9名患者计算与来自相同患者的相邻正常组织中小U2的水平相比，原发性肿瘤样本中小U2的水平(“倍数变化/相同个体”)。从这一点，9名患者中7名的小U2水平明显更高。倍数变化范围从3.11(Adk-15)至33.74(Kmal-21)。在患者Adk-29的原发性肿瘤样本和相邻正常组织中小U2的水平似乎相似，而与具有非常缓慢生长肺癌形式的患者Car-13的相邻正常组织相比，其原发性肿瘤样本中小U2的水平更低。

在第二次倍数变化计算中，基于来自每名患者的原发性肿瘤中的水平和9个相邻正常组织中小U2水平的平均值(6.08)计算小U2水平的倍数变化。

表3：原发性肿瘤样本中观察到的小U2水平的倍数变化

使用计算倍数变化的方法发现小U2水平在大多数原发性肿瘤样本中升高。

对该小群体中分析的大多数原发性肿瘤还观察到miR-720和13207水平升高，并且miR-451水平降低。表4示出了如上所述，使用原发性肿瘤中每种微RNA的水平与正常组织样本中微RNA水平的平均值的比例计算的miR-720、miR-451和13207水平的倍数变化。未测定患者ADK2的miR-720、miR-451和13207的水平。

表4：原发性肿瘤样本中观察到的miR-720、miR-451和13207水平的倍数变化

患者ID	miR-720	miR-451	13207
				Ksarc-19	2.72	-10.15	60.35
LCNEC-31	未测定	-2.86	10.31
				scc-27	1.35	-7.90	11.85
EPI-4	未测定	-9.47	43.85
				Kmalp21	1.99	-7.99	18.94
Kmalp25	1.95	-3.72	22.74
				Car13	未测定	-3.23	未测定
Adk15	2.73	-4.68	2.98
				Adk23	5.03	-16.47	2.45
ADK9	9.81	-5.28	2.02
				ADK10	4.77	-7.77	1.32
adk29	3.06	-12.78	1.52

5.2 实施例2：通过qRT-PCR测定的肺部原发性肿瘤中的小RNA水平

使用TaqMan

定量RT-PCR(qRT-PCR；Applied Biosystems)测定测量用于实施例1中的微阵列实验的相同小RNA样本中的小U2。小RNA RNU44用作内源性对照(Amaral FC等J Clin Endocrinol Metab94:320-323(2009))。来自6名患者(Adk-15、Adk-23、Kmalp-25、Adk-29、Scc-27和Lcnec-31)的原发性肿瘤和来自其中3名患者(Adk-15、Adk-23和Scc-27)的相邻正常组织的小RNA用于分析。

使用2^-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen，Methods,25:402-408(2001))，并且使用3个相邻正常组织中小U2水平的平均值作为参考计算原发性肿瘤中小U2水平的倍数变化。结果示于表5中。

表5.组织样本中小U2的qRT-PCR量化

qRT-PCR数据与以上讨论的微阵列实验的结果相关性良好。图1示出了qRT-PCR实验中测定的6个样本的结果。在该图中，qRT-PCR为表5所示的2^-ΔΔCt数据。“微阵列-1-”是通过比较原发性肿瘤样本中小U2的水平与相同患者的相邻正常组织中的水平而计算的倍数变化。“微阵列-比例-”是通过比较原发性肿瘤样本中小U2的水平与所有患者的相邻正常组织的平均值而计算的倍数变化。

微阵列和qRT-PCR实验的结果证明在测定的大多数原发性肺部肿瘤中(13个中的10个)小U2水平较高并且小U2水平升高并非是肺部肿瘤亚型特异性的。

使用类似的TaqMan

定量RT-PCR(qRT-PCR)测定以测量用于实施例1中的微阵列实验的相同小RNA样本中的miR-720、miR-451和13207的水平。然而，在这种情况下，小RNA RNU48用作内源性对照(Zhu等BMC Res.Notes2:89(2009)；Collino等PLoS ONE 5:1(2010)；Chiyomaru等J.Canc.102:883(2010))。来自6名患者(Adk-15、Adk-23、Kmalp-25、Adk-29、Scc-27和Lcnec-31)的原发性肿瘤和来自其中3名患者(Adk-15、Adk-23和Scc-27)的相邻正常组织的小RNA用于分析。

使用2^-ΔΔCt方法(Livak和Schmittgen，Methods,25:402-408(2001))，并且使用3个相邻正常组织中微RNA水平的平均值作为参考计算原发性肿瘤中miR-720、miR-451和13207水平的倍数变化。对于下调RNA，计算倍数变化为-1/2^-ΔΔCt。结果示于表6中。

表6.组织样本中miR-720、miR-451和13207的qRT-PCR量化

^*该数字为2^-ΔΔCt。

^*这些数字为-1/2^-ΔΔCt。

那些结果证实，miR-451和13207水平通常在原发性肿瘤组织中比在正常组织中更低。

5.3 实施例3：通过qRT-PCR测定的更大群体中的小RNA水平

所选群体

选择36个个体，其中24名已经诊断为患有肺癌，并且其中12名健康。这项研究证明，小U2可用作使用微创测定的肺癌早期检测标记。

24名肺癌患者患有早期肺癌。6名诊断为IA期肺癌，14名为IB期肺癌，并且4名为IIB期肺癌。所述群体包括16名男性和8名女性。16名患者为吸烟者，1名为曾吸烟者，而7名未曾吸烟。患者均未诊断患有糖尿病、传染性疾病、其它癌症、肥胖或心脏问题。在收集组织时患者均未服药。表7示出了群体中24名患有肺癌的患者和每名患者的各种临床特征。

表7：群体中肺癌患者的临床特征

群体中的12名健康个体不患有糖尿病、传染性疾病、癌症、肥胖或心脏问题中的任一种。在收集组织时健康患者均未服药。表8示出了群体中的12名健康个体和每个个体的各种临床特征。

表8：群体中健康个体的临床特征

ID	取样时的年龄	性别	吸烟状况
				50437	47	男	先前使用过
42199	21	男	3支烟/天
				49508	37	男	从未使用
50444	40	女	10支烟/天
				49511	40	男	从未使用
42214	22	女	先前使用过
				50448	38	女	先前使用过
46816	39	女	从未使用
				49509	35	女	从未使用
43517	37	男	20支烟/天
				46810	38	女	从未使用
50446	35	男	4支烟/天

对于群体中的每个个体，使用1ml血清提取RNA用于小U2水平的TaqMan

定量RT-PCR测定。

从血清样本中分离总RNA

向每个血清样本中添加3个体积(3ml)的Trizol LS，然后将样本在室温下孵育5min。向每个样本中添加0.8ml氯仿(每0.75ml TrizolLS，0.2ml氯仿)，然后用力搅拌样本15秒。将样本在室温下孵育3分钟。然后在4℃下12,000xg(9,600rpm)离心样本15分钟，并收集水相(4ml)。

向水相中添加1个体积的酸化苯酚/氯仿(5份苯酚与1份氯仿，pH4.5)。轻轻搅拌所述相并使其在室温下静置2至3分钟。然后在4℃下12,000xg(9,600rpm)离心样本10分钟，并收集水相。然后重复苯酚/氯仿萃取。

第二次苯酚/氯仿萃取后，向每个样本中添加1.25个体积的100%EtOH并搅拌样本。将各700μl的样本上样至mirVana^TMmiRNA分离柱(Ambion)上并且在室温下8,000xg离心所述柱15秒。丢弃滤液，并将另700μl样本上样至所述柱上并离心。再次丢弃滤液。重复所述过程直至所有样本已经通过mirVana^TM柱。

然后将700μl的miRNA洗涤溶液1上样至mirVana^TM柱上。在室温下8,000xg离心所述柱10秒，并丢弃滤液。然后将500μl的miRNA洗涤溶液2/3上样至mirVana^TM柱上。在室温下8,000xg离心所述柱10秒，并丢弃滤液。再次将500μl的miRNA洗涤溶液2/3上样至mirVana^TM柱上。在室温下8,000xg离心所述柱10秒，并丢弃滤液。

在室温下8,000xg离心所述柱1分钟以去除残留洗涤缓冲液。将所述柱转移至清洁管中并且向柱中添加100μl无RNA酶的水，并且在室温下以最高速度(12,000xg；9,600rpm)离心20秒。

通过qRT-PCR检测血清中的小U2

使用TaqMan

定量RT-PCR(qRT-PCR；Applied Biosystems)测定测量从群体中个体的血清中分离的总RNA样本中的小U2水平。表9中为群体中每个个体示出了3次反应的平均Ct，连同来自表7和8的某些特征。

表9：小U2的qRT-PCR的平均Ct值

ID	吸烟状况	临床诊断	时期	时期分组	平均Ct
						47031	从未使用	乳头状腺癌	T1NXM0	IA	35.17
48716	30支烟/天	鳞状细胞癌	T2N1M0	IIB	34.71
						41379	从未使用	腺癌	T1NXM0	IA	32.28
48708	25支烟/天	鳞状细胞癌	T1N0M0	IA	32.22
						48712	从未使用	鳞状细胞癌	T2N0M0	IB	32.15
49129	20支烟/天	腺癌	T2N0M0	IB	32.06

47044	20支烟/天	鳞状细胞癌	T2NXM0	IB	31.91
						47042	20支烟	鳞状细胞癌	T2NXM0	IB	31.86
48714	从未使用	腺癌	T2N0M0	IB	31.84
						45417	40支烟/天	腺癌	T2N0MX	IB	31.77
47322	15支烟/天	鳞状细胞癌	T2NXM0	IB	31.77
						47033	30支烟/天	腺癌	T1NXM0	IA	31.76
45937	15支烟/天	腺癌	T2N1MX	IIB	31.62
						45926	20支烟/天	腺癌	T2N0M0	IB	31.35
49137	从未使用	腺癌	T1N0M0	IA	31.31
						45694	从未使用	细支气管肺泡癌	T1NXM0	IA	30.85
45424	40支烟/天	鳞状细胞癌	T2N1MX	IIB	30.56
						45419	20支烟/天	腺癌	T2N0MX	IB	30.54
41537	20支烟/天	腺癌	T2N1MX	IIB	30.25
						44664	60支雪茄/天	鳞状细胞癌	T2N0M0	IB	30.18
45407	30支烟/天	鳞状细胞癌	T2N0MX	IB	30.17
						49136	先前使用过	鳞状细胞癌	T2NXM0	IB	29.63
48710	30支烟/天	腺癌	T2N0M0	IB	28.88
						48711	从未使用	鳞状细胞癌	T2N0M0	IB	28.78
50437	先前使用过	健康			38.69
						42199	3支烟/天	健康			35.48
49508	从未使用	健康			35.09
						50444	10支烟/天	健康			34.91
49511	从未使用	健康			34.2
						42214	先前使用过	健康			34.17
50448	先前使用过	健康			34.02
						46816	从未使用	健康			34
49509	从未使用	健康			33.98
						43517	20支烟/天	健康			33.66

46810	从未使用	健康			33.07
						50446	4支烟/天	健康			32.34

图2示出了表9所示的Ct值的图。图2中标记“CT比例”的数据是表9所示的平均Ct，其是3次反应的平均值。群体的肺癌和健康组之间分离良好。仅2名肺癌患者的Ct值高于健康个体。在该实验中，约90%的肺癌患者与健康个体相比小U2水平升高。在32.3的Ct截断值下，灵敏度为83.3%而特异性为100%。

数据的接收操作特征(ROC)图示于图6中。ROC图示出了肺癌患者和健康个体之间的良好分离。测量小U2的血清水平能够使用Ct≤32.28的标准，以91.7%灵敏度、100%特异性鉴定患有肺癌的个体。

在该实验中，血清中小U2的水平是非常好的肺癌标志，另外，小U2适于使用微创测定检测早期肺癌。

也使用TaqMan?定量RT-PCR(qRT-PCR；Applied Biosystems)测定测量从表7和8所示群体中的个体的血清中分离的总RNA样本中miR-720、miR-451和13207的水平。表10中为群体中每个个体示出了每种RNA来自3次反应的平均Ct，连同来自表7和8的某些特征。

表10：miR-720、miR-451和13207的平均Ct值

图3至5分别示出了来自表10的miR-451、miR-720和13207的Ct值图。如图3所示，基于miR-451水平的肺癌存在的灵敏度和特异性分别为85%和75%。进一步地，虽然miR-451似乎在原发性肿瘤细胞中以相对于正常细胞更低的水平存在，但是在该实验中发现miR-451在来自一小群肺癌患者的血清中存在的水平升高。如图4所示，基于miR-720水平的肺癌存在的灵敏度和特异性分别为83.3%和100%。最后，如图5所示，基于血清样本中更低的miR-13207水平的肺癌存在的灵敏度和特异性分别为75%和91.7%。

5.4 实施例4：高小U2水平与肺癌相关

所选群体

为该群体选择28名诊断为患有非肺癌的患者以确定成熟小U2是否与肺癌特异性相关。8名患者诊断为患有结直肠癌，5名为患有膀胱癌，9名为患有乳腺癌，和6名为患有前列腺癌。包括患有一系列早期至晚期癌症的患者。总共，有4名I期患者，14名II期患者，8名III期患者和1名IV患者。患者均未诊断患有糖尿病、传染性疾病、其它癌症、肥胖或心脏问题。在血清收集时患者均未服药。最后，13名患者有吸烟史。表11列出了群体中的所有患者和每名患者的各种临床特征。表11还示出了来自以下讨论的小U2qRT-PCR测定的Ct值。

表11：群体中非肺癌患者的临床特征

通过qRT-PCR检测非肺癌患者血清中的小U2

如以上实施例3中所述，分离来自表11中所列每名患者的1ml血清的总RNA。

使用TaqMan定量RT-PCR(qRT-PCR；Applied Biosystems)测定测量从群体中个体的血清分离的总RNA样本中的小U2水平。表11中为每个个体示出了来自3次测定的平均Ct值。

图7示出了表11所示Ct值的图。在图中将每种癌症类型绘制成单个列。标记为“Ct比例”的数据是来自表11中所示3次反应的平均Ct。从左到右，所述列为肺癌(数据来自实施例3)、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌和前列腺癌。仅6名非肺癌患者的Ct值低于实施例3中测定的100%特异性值(Ct=32.28)。相反，22名(79%)非肺癌患者的Ct值在与实施例3中健康个体相似的范围内。因此，更高水平的小U2与肺癌特异性相关。

图8中示出了数据的ROC图。ROC图示出了肺癌患者和非肺癌患者之间的良好分离。测量小U2的血清水平能够使用Ct≤32.28的标准，以91.7%灵敏度、78.6%特异性鉴定患有肺癌与其它癌症的个体。

在Ct值低于阈值(32.28)的6名患者中，其中3名患有晚期癌症(患者43994、40017和49152)。2名更为晚期的癌症患者的Ct值刚好高于阈值(48433和42979)。在高于阈值的其余20名患者中，仅3名为III期和1名为IV期。进一步地，在非常接近或低于Ct阈值的8名非肺癌患者中，5名为乳腺癌患者，表明在乳腺癌中小U2可能更常处于较高水平。其它4名乳腺癌患者具有在正常范围的更高Ct值。总之，这些结果表明在癌症的后期，在除肺部以外的癌症中小U2水平可能更高。然而，在前期，仅在肺癌中小U2水平始终很高。

发现miR-720对肺癌的特异性比小U2低。在患有肺癌的患者和患有其它癌症的患者中miR-720的Ct值图在29.4的Ct截断值下显示出83.3%的灵敏度和64.3%的特异性。(数据未示出。)当单独考虑其它癌症时，在该实验中miR-720将肺癌与膀胱癌和前列腺癌区分开，但未与乳腺癌或结直肠癌区分开。(数据未示出。)在该实验中，13207未将肺癌与其它癌症区分开。(数据未示出。)

5.5 实施例5：鉴定的小RNA并非吸烟状况或性别的标志

图9中示出了所有患者，包括癌症患者和健康个体中小U2水平的Ct值与吸烟史相对的ROC图。该图显示小U2并非吸烟状况的标志。用miR-720、miR-451和13207获得相似结果。(数据未示出。)

当根据个体的性别绘制Ct值时，也发现小U2、miR-720、miR-451和13207并非性别的标志。(数据未示出。)

最后，发现小RNA的组合，例如小U2和miR-720的组合并非性别或吸烟状况的标志。(数据未示出。)

5.6 实施例6：小RNA组合提高了检测灵敏度和特异性

以各种方式结合表9(小U2)和表10(miR-720、miR-451和13207)所示的Ct数据以确定是否会提高所述测定的灵敏度和/或特异性。对于每个组合，Ct值相互相加(在两种RNA均上调的情况下)或相减(在一种RNA上调而一种RNA下调的情况下)。

图10示出了小U2和miR-451的组合。将每名患者的小U2和miR-451的Ct值加在一起。对于小U2和miR-451的组合而言，灵敏度和特异性分别为85%和91.7%。

图11示出了小U2和miR-720的组合。将每名患者的小U2和miR-720的Ct值加在一起。对于小U2和miR-720的组合而言，灵敏度和特异性分别为87.5%和100%。

图12示出了小U2、miR-720和13207的组合。从小U2和miR-720的Ct值总和中减去13207的Ct值。对于小U2、miR-720和13207的组合而言，灵敏度和特异性分别为90.5%和100%。

表12总结了小U2、miR-720和13207及其组合的灵敏度和特异性数据。

表12：某些小RNA及其组合用于检测肺癌的灵敏度和特异性

图13示出了将特异性设为100%时，通过检测某些RNA检测肺癌的灵敏度图。为将特异性设为100%，将Ct截断值设为所有健康样本高于(或低于)Ct截断值线。然后用该Ct截断值测定灵敏度。如该图中所示，当结合某些小RNA的检测时，灵敏度升高。

为了确定肺癌患者与健康个体中某些RNA组合的中值Ct之间的分离，如以下标准化小U2和miR-720组合的Ct和小U2、miR-720和13207组合的Ct。首先，如以上测定Ct总和(即，Ct(小U2)+Ct(miR-720)；和Ct(小U2)+Ct(miR-720)–Ct(13207))。然后将Ct总和标准化为100%特异性截断值：(((Ct总和)/(100%特异性下的Ct总和))-1)×100。因此，对于两种组合而言Ct截断值为0。如图14所示，除增加灵敏度外，某些RNA组合还导致肺癌患者与健康患者的中值Ct之间更大的分离。小U2和miR-720的组合(A)产生85.7的特异性和对于标准化数据约18的中值分离(用上线和下线之间的距离表示)，而小U2、miR-720和13207的组合(B)产生90.5的特异性和对于标准化数据约21的中值分离(用上线和下线之间的距离表示)。

5.7 实施例7：另一群体中通过qRT-PCR测定的小RNA水平

所选群体

选择了21个个体，其中11名已经诊断为患有肺癌，并且其中10名健康。这项研究证明小U2可用作使用微创测定的肺癌早期检测标记。

11名肺癌患者患有早期肺癌。5名诊断为IA期肺癌，4名为IB期肺癌，并且2名为IIB期肺癌。所述群体包括6名男性和5名女性。4名患者为吸烟者，1名为曾吸烟者，而6名未曾吸烟。患者均未诊断患有糖尿病、传染性疾病、其它癌症、肥胖或心脏问题。在收集组织时患者均未服药。群体中的10名健康个体没有糖尿病、传染性疾病、癌症、肥胖或心脏问题中的任一种。在收集组织时健康个体均未服药。表13示出了群体中11名患有肺癌的患者和每名患者的各种临床特征以及群体中的10名健康个体。

表13：群体-2中肺癌患者的临床特征

对于群体中的每个个体，使用1ml血清提取RNA用于TaqMan

定量RT-PCR测定(qRT-PCR；Applied Biosystems)。如实施例3中所述分离RNA。

使用TaqMan

定量RT-PCR测定测量从群体中个体的血清中分离的总RNA样本中的小RNA水平。检测的小RNA水平为小U2和miR-720及CelmiR-39(秀丽隐杆线虫(C.elegans)miR-39)。添加CelmiR-39作为外标对照以修正由血清纯化RNA的偏差。表14中为群体中每个个体示出了3次反应的平均Ct，连同来自表13的某些特征。

表14：小U2和miR-720及CelmiR-39外标对照的平均Ct

通过从每种RNA和RNA组合的Ct中减去CelmiR-39的Ct，表15示出了相对于CelmiR-39的Ct值，小U2和miR-720的ΔCt值。另外，U2和miR-720组合的ΔCt值也示于表15中。

表15：小U2和miR-720及其组合的ΔCt值

图15示出了小U2相对于CelmiR-39的ΔCt值图。在该实验中，小U2的ΔCt对检测肺癌产生81.8%的灵敏度和100%的特异性。图16示出了miR-720相对于CelmiR-39的ΔCt值图。在该实验中，miR-720的ΔCt对检测肺癌产生81.8%的灵敏度和80%的特异性。

图17示出了小U2和miR-720各自相对于CelmiR-39的ΔCt值总和图。在该实验中，ΔCt值的总和对检测肺癌产生72.7%的灵敏度和100%的特异性。

5.8 实施例8：来自血清的小RNA的初步测序

由来自IA、IIA、IB和IIB期肺癌患者的两种不同混合血清对小RNA测序。混合血清I包括来自15名患者的血清而混合血清II包括来自3名患者的血清。还由来自3名健康个体的混合血清对小RNA测序。另外，由腺癌和鳞状细胞癌两个原发性肺部肿瘤样本对小RNA测序。对于混合血清I，使用mirVana^TMmiRNA分离试剂盒纯化小RNA(长度<200个核苷酸)并用Fasteris SA(Switzerland)测序。对于原发性肿瘤而言，按大小分离RNA并用Fasteris SA测序。对于混合血清II和来自健康个体的血清，由Norgen Biotek(Canada)提取总RNA并且在LC Sciences(Houston,TX)测序。

以下列表示出了由来自肺癌患者的至少一种混合血清或在至少一种原发性肺部肿瘤样本中测序的一些小RNA序列：

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：2；小U2)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAUGGAAU-3′(SEQ ID NO：3；小U2)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAU-3′(SEQ ID NO：4；小U2)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：5；小U2)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：6；小U2)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：7；小U2)

5′-AAAUGGAUUUUUGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：8；小U2)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAU-3′(SEQ ID NO：9；小U2)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：10；小U2)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：11；小U2)

5′-AAUGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：12；小U2)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGAU-3′(SEQ ID NO：13；小U2)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：14；小U2)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：15；小U2)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：16；小U2)

5′-AUGGAUUUUUGGAGCAGGG-3′(SEQ ID NO：17；小U2)

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGGAGA-3′(SEQ ID NO：18；小U2)

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGGAG-3′(SEQ ID NO：19；小U2)

5′-UGGAUUUUUGGAGCAGGGA-3′(SEQ ID NO：20；小U2)

5′-UCUCGCUGGGGCCUCCA-3′(SEQ ID NO：21；miR-720)；

5′-AUCUCGCUGGGGCCUCCA-3′(SEQ ID NO：23；miR-720)；

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGUU-3′(SEQ ID NO：24；miR-451)；

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGU-3′(SEQ ID NO：29；miR-451)；

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAG-3′(SEQ ID NO：30；miR-451)；

5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU-3′(SEQ ID NO：28；miR-451)；

5′-UUUAGUAAUGGUAAUGGUUCU-3′(SEQ ID NO：27；miR-451)；

5′-UAAUGGUAAUGGUUCUCUUG-3′(SEQ ID NO：26；miR-451)；

5′-UGUCUUUCCUUGUUGGAGCAGG-3′(SEQ ID NO：31；13207)；

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGCT-3′(SEQ ID NO：35；13750)；

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAGC-3′(SEQ ID NO：38；13750)；

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAAG-3′(SEQ ID NO：39；13750)；

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGAA-3′(SEQ ID NO：40；13750)；和

5′-TGTAGAGCAGGGAGCAGGA-3′(SEQ ID NO：41；13750)。

5．9 实施例9：通过qRT-PCR测定的更大群体中的小RNA水平

所选群体

为该群体选择了174个个体。一组个体健康，无已知癌症或炎症性或传染性疾病；一组个体已经诊断为患有其它癌症、各种炎症性疾病，例如哮喘、过敏症和结节病，和/或各种传染性疾病(这些个体分为“MD”和“SI”组；“MD”指轻度疾病而“SI”指“严重疾病”)；一组个体已经诊断为患有慢性阻塞性肺病(COPD)和肺癌；一组个体已经诊断为患有COPD，但无肺癌；一组个体已经诊断为患有肺癌；并且一组个体已经诊断为患有肺纤维化。另外，9个个体怀疑患有肺癌，但是在样本采集时尚未确诊。那些个体用于验证标志，而不用于如以下讨论的初步分析。表16示出了群体中患者的临床特征。

对于群体中的每个个体，使用1ml血清提取RNA用于TaqMan

定量RT-PCR测定(qRT-PCR；Applied Biosystems；用于miR-720和miR-451)或使用Exiqon定制LNA引物的qRT-PCR(Exiqon,Vedbaek,DK；用于小U2和13750)。如实施例3中所述分离RNA。

使用TaqMan

定量RT-PCR测定或使用Exiqon引物的qRT-PCR测量从群体中个体的血清中分离的总RNA样本中的小RNA水平。检测的小RNA水平为小U2、miR-720、miR-451、13750和CelmiR-39(秀丽隐杆线虫miR-39)。添加CelmiR-39作为外标对照以修正由血清纯化RNA的偏差。表17中为群体中每个个体示出了3次反应的平均Ct。

表17：小U2、miR-720、miR-451、13750和CelmiR-39外标对照的平均Ct

在该实验中，用大得多的群体，确认在来自肺癌患者的血清中存在的小U2水平升高，而在来自肺癌患者的血清中存在的miR-720、miR-451和13750水平降低。

图18示出了13750的Ct值图。在该实验中，13750将肺癌与对照，包括COPD区分开，p值<0.001。

对表17中测试的4种标志进行方差分析(ANOVA)以确定每种标志区分肺癌与非肺癌的能力。ANOVA的结果示于表18中。

表18：小U2、miR-720、miR-451和13750的ANOVA结果

RNA	Sq F值	Pr(>F)
			小U2	137.6	<2.2e-16
miR-720	45.8	6.4e-10
			miR-451	4.6	0.035
13750	31.1	1.72e-7

小U2、miR-720和13750均能够将肺癌与非肺癌区分开，其中p值<0.001。MiR-451能够将肺癌与非肺癌区分开，其中p值<0.05。

使用线性判别分析(LDA)方法将数据中的类间方差与类内方差的比例减到最小，以便最大化肺癌与非肺癌的可分离性。参见，例如，Nikas等Cancer Inform.11:1-14(2012)；R Development Core Team(2011)；R：统计计算的语言和环境(A language and environment forstatistical computing)。R Foundation for Statistical Computing，Vienna,Austria.ISBN3-900051-07-0。使用这种方法，确定了每种RNA线性判别的系数，并示于表19中。

表19：线性判别的系数

RNA	系数
		小U2	1.0712027
miR-720	-0.4534064
		miR-451	-0.1715311
13750	-0.2694863

然后使用公式：(Ct小U2×1.0712027)-(Ct13750×0.2694863)-(miR-720×0.4534064)-(miR-451×0.1715311)将系数应用于每名患者的每种微RNA的Ct。该公式称为“Canon LDA-1”。

然后测试使用4种RNA的组合的Canon LDA-1区分肺癌与其它病状的能力。从该分析中略去了纤维化样本。结果示于图19中。小U2、miR-720、miR-451和13750的组合能够将患有肺癌的患者与患有其它病状的患者区分开。

因为许多肺癌患者也患有COPD，所以测定了小U2、miR-451、miR-720和13750的每一种区分无癌症的COPD与有癌症的COPD的能力。表20示出了4种RNA的ANOVA结果。

表20：小U2、miR-720、miR-451和13750的ANOVA结果

RNA	Sq F值	Pr(>F)
			小U2	47.2	2.0e-6
miR-720	1.9	0.18
			miR-451	0.07	0.79
13750	24.7	9.8e-5

小U2和13750能够区分无肺癌的COPD与有肺癌的COPD，其中p值<0.001。

再次，使用LDA方法将数据中的类间方差与类内方差的比例减到最小，以便最大化有癌症的COPD与无癌症的COPD的可分离性。使用这种方法，测定小U2和13750的线性判别系数，并示于表21中：

表21：线性判别系数

RNA	系数
		小U2	-0.7535686

13750

0.7190100

5.10 实施例10：Canon LDA-1的验证

使用4种RNA的组合(Canon LDA-1)测试来自表16所示9名“验证”患者的样本以确定在通过其它方法诊断之前所述组合检测早期肺癌的能力。表22示出了验证群体中的9名患者和诊断之前采集血清的月份数。在后3名患者中，因为在诊断之前分析了样本，所以确定了组合的无偏预测值。

表22：验证群体

使用小U2、miR-720、miR-451和13750的组合预测验证群体中每名患者的肺癌状态。如图20所示，正确预测了验证群体中9名患者中8名的肺癌状态。为患者S10-826-d返回了唯一不正确的结果，其最终诊断为患有肺癌，这很可能是由于先前存在的膀胱癌的转移。进一步地，在测定中确定由临床医师鉴定为患有疑似肿瘤形成的患者S10-971没有患有肺癌。这名患者最终诊断为没有患有肺癌。

这些结果证明Canon LDA-1(小U2、miR-720、miR-451和13750)能够在临床医师能够用目前可用的技术预测前几个月预测肺癌的存在(或不存在)。

5.11 实施例11：小U2在早期肺癌中高度表达

根据肺癌时期绘制表17所示小U2的数据。结果示于图21中。小U2在I期肺癌中高度表达。因此，至少小U2可能是检测早期肺癌特别好的标志。这个结果与以上实施10中讨论并示于图20中的验证结果一致。

本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件均据此以引用的方式整体并入用于所有目的，如同单独地指出将每个单独的出版物、专利、专利申请或其它文件以引用的方式并入用于所有目的一样。

虽然已经说明并描述了各个特定实施方案，但是应认识到，在不背离本发明精神和范围的前提下可作改变。

Claims

1.一种用于检测受试者中肺癌的存在的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，其中检测到小U2的水平高于小U2的正常水平，或检测到选自13207、miR-720、miR-451和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者中肺癌的存在。

2.一种用于检测受试者中肺癌的存在的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，并且将所述样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的所述至少一种RNA的水平与所述RNA的正常水平作比较，其中检测到小U2的水平高于小U2的正常水平，或检测到选自13207、miR-720、miR-451和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者中肺癌的存在。

3.一种促进受试者中肺癌的诊断或肺癌患者治疗的监测的方法，包括检测来自所述受试者的样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，并且将所述检测结果传达给执业医生以便确定所述受试者是否患有肺癌或监测所述肺癌患者的治疗。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测小U2的水平。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测13750的水平。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测miR-720的水平。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测miR-451的水平。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少两种RNA的水平。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括：

a)检测小U2和13750的水平，或

b)检测小U2和miR-451的水平；或

c)检测小U2和miR-720的水平；或

d)检测13750和miR-451的水平；或

e)检测13750和miR-720的水平；或

f)检测miR-451和miR-720的水平。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少三种RNA的水平。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括：

a)检测小U2、miR-720和13750的水平；或

b)检测小U2、miR-720和miR-451的水平；或

c)检测小U2、miR-451和13750的水平；或

d)检测miR-720、miR-451和13750的水平。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少四种RNA的水平。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法包括检测小U2、miR-720、miR-451和13750的水平。

14.一种用于检测受试者中肺癌的存在的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样本中小U2的水平，其中检测到小U2的水平高于小U2的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法进一步包括检测选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，其中检测到选自13207、miR-720、miR-451和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者中肺癌的存在。

16.一种用于检测受试者中肺癌的存在的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样本中13750的水平，其中检测到13750的水平低于13750的正常水平表明所述受试者中肺癌的存在。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法进一步包括检测选自小U2、miR-720、miR-451和13207的至少一种RNA的水平，其中检测到小U2的水平高于小U2的正常水平，或检测到选自13207、miR-720和miR-451的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者中肺癌的存在。

18.一种监测肺癌患者对治疗的反应的方法，包括检测在第一个时间点取自所述受试者的第一样本中，选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，并且将选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平与在第二个时间点取自所述患者的第二样本中各RNA的水平作比较，其中所述第二个时间点在所述第一个时间点之前并且其中相对于所述第二样本，所述第一样本中小U2的水平下降或选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平升高，表明所述肺癌患者对治疗有反应。

19.一种用于检测受试者中肺癌的存在的方法，包括从所述受试者获得样本，将所述样本提供给实验室以检测所述样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，从所述实验室接收表明所述至少一种RNA的水平的讯息，其中检测到小U2的水平高于小U2的正常水平，或检测到选自13207、miR-720、miR-451和13750的至少一种RNA的水平低于各RNA的正常水平，表明所述受试者中肺癌的存在。

20.一种用于监测肺癌患者对治疗的反应的方法，包括在第一个时间点从所述受试者获得第一样本，将所述第一样本提供给实验室以检测所述样本中选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平，从所述实验室接收表明所述至少一种RNA的水平的讯息，将所述第一样本中所述至少一种RNA的水平与在第二个时间点取得的第二样本中所述至少一种RNA的水平作比较，其中所述第二个时间点在所述第一个时间点之前，其中相对于所述第二样本，所述第一样本中小U2的水平下降或选自miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA的水平升高，表明所述肺癌患者对治疗有反应。

21.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述检测包括使包含选自SEQ ID NO:42至51、81和82的序列的至少8个相邻核苷酸的至少一个多核苷酸与来自所述样本的RNA或由来自所述样本的RNA反转录的cDNA杂交，并且检测包含多核苷酸和选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA或cDNA的复合体。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

a)小U2选自成熟小U2、成熟小U2异构体、小U2前体及其组合；

b)miR-720选自成熟miR-720、成熟miR-720异构体、miR-720前体及其组合；

c)miR-451选自成熟miR-451、成熟miR-451异构体、miR-451前体及其组合；

d)13207选自成熟13207、成熟13207异构体、13207前体及其组合；

e)13750选自成熟13750、成熟13750异构体、13750前体及其组合。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：

a)小U2具有选自SEQ ID NO:2至20的序列；

b)miR-720具有选自SEQ ID NO:21和23的序列；

c)miR-451具有选自SEQ ID NO:24和28至30的序列；

d)13207具有SEQ ID NO:34的序列；并且

e)13750具有选自SEQ ID NO:35和38至41的序列。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样本选自组织样本和体液。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述组织样本为肺组织样本。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述肺组织样本包括肺癌细胞。

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述体液选自血液、尿液、痰、唾液、粘液和精液。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述样本为血液样本。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述血液样本为血清样本。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述血液样本为血浆样本。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肺癌为早期肺癌。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肺癌为I期肺癌。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测包括定量RT-PCR。

34.选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的至少一种RNA用于检测受试者中肺癌的存在或用于监测肺癌患者的治疗的用途。

35.小U2用于检测受试者中肺癌的存在或用于监测肺癌患者的治疗的用途。

36.13750用于检测受试者中肺癌的存在或用于监测肺癌患者的治疗的用途。

37.小U2和13750用于检测受试者中肺癌的存在或用于监测肺癌患者的治疗的用途。

38.小U2、miR-720、miR-451和13750用于检测受试者中肺癌的存在或用于监测肺癌患者的治疗的用途。

39.一种包含寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸包含至少8个与选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA互补的相邻核苷酸。

40.一种包含寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸包含至少8个与由选自小U2、miR-720、miR-451、13207和13750的RNA反转录的cDNA互补的相邻核苷酸。

41.一种包含根据权利要求37或权利要求38所述的组合物的试剂盒。