CN106662543A - 肺癌患者中的非侵入性基因突变检测 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种用于检测体液中的唾液生物标志物的系统和方法。特别是，所述系统适于检测受试者中的肺癌生物标志物。所述系统包括：具有至少一个孔的电化学传感器芯片，其中所述至少一个孔包括工作电极，所述工作电极涂有导电聚合物，所述导电聚合物用至少一种捕获探针官能化；以及至少一种经标记的检测探针。当所述至少一种经标记的检测探针与所述受试者的含有肺癌的生物标志物的样品混合并加到所述至少一个孔中时，将电流施加到所述样品，使得当所述生物标志物的至少一些结合到所述捕获探针时，产生所述样品中电流的可测量变化，所述变化指示肺癌。

Description

肺癌患者中的非侵入性基因突变检测

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2014年6月3日提交的美国临时专利申请No.62/007,286的优先权，该申请的内容整体以引用方式并入本文。

技术领域

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明根据美国国立卫生研究院授予的TR00124在政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。

背景技术

肺癌在所有癌症中的发病率最高，并且在全世界是癌症相关死亡的主要原因，占所有男性癌症死亡的29％和所有女性癌症死亡的26％(Siegel R,Naishadham D,JemalA.Cancer statistics,2012.CA Cancer J Clin 2012；62:10-29)。最近对肺癌发病机制和分子肿瘤学的理解已促成了对编码可作为药理学靶标的酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)中获得性遗传改变的生物和治疗重要性的发现(Lynch TJ,Bell DW,Sordella R等Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlyingresponsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.The New Englandjournal of medicine 2004；350:2129-2139；Paez JG,Janne PA,Lee JC等EGFRmutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinibtherapy.Science 2004；304:1497-1500)。外显子19中的缺失(p.E746_A750del)和外显子21中的点突变(p.L858R)最经常发生，并与对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的高度响应性相关。在2009年，第一项随机化临床试验(易瑞沙泛亚洲研究(Iressa Pan-Asia Study))证实：对于携带激活EGFR突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者而言，用EGFR-TKI进行的初治优于基于铂的标准化疗(Mok TS,Wu YL,Thongprasert S等Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.The New England journal of medicine2009；361:947-957)。随后，一项单组研究和三项其他随机化研究确认了激活EGFR突变与对吉非替尼和/或埃罗替尼疗法的客观响应之间的关联(Maemondo M,Inoue A,Kobayashi K等Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutatedEGFR.N Engl J Med 2010；362:2380-2388；Mitsudomi T,Morita S,Yatabe Y等Gefitinibversus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancerharbouring mutations of the epidermal growth factor receptor(WJTOG3405):anopen label,randomised phase 3trial.Lancet Oncol 2010；11:121-128；Rosell R,Carcereny E,Gervais R等Erlotinib versus standard chemotherapy as first-linetreatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer(EURTAC):a multicentre,open-label,randomised phase3trial.The lancet oncology 2012；13:239-246；Zhou C,Wu YL,Chen G等Erlotinibversus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFRmutation-positive non-small-cell lung cancer(OPTIMAL,CTONG-0802):amulticentre,open-label,randomised,phase 3study.Lancet Oncol 2011；12:735-742)。

对从支气管镜检、计算机断层扫描(CT)引导的活检、手术切除或来自恶性胸腔积液的引流获得的活检或细胞学样本中的肿瘤细胞进行了EGFR突变分析。然而，大多数NSCLC患者罹患晚期癌症并且不得不经受侵入性活检程序以便提供肿瘤组织用于EGFR突变检测。此外，EGFR致癌基因突变的进行性发展最终导致耐药性。因此，对EGFR致癌基因突变的初始检测和连续监测对于NSCLC患者的长期管理具有重要意义；这一策略使得临床医生能够调整治疗策略，从而改善致癌基因分子靶向疗法的临床结果。

鉴于血液具有与原发性肿瘤相同的遗传损伤，诸如循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA的血源性生物标志物对于检测源自恶性肿瘤的体细胞突变大有前景(Bidard FC,Weigelt B,Reis-Filho JS.Going with the flow:from circulating tumor cells toDNA.Science translational medicine 2013；5:207ps214)。因为并非所有在血液中鉴定的细胞都是CTC，而且这些方法不能捕获所有表型的CTC，所以使用CTC来检测EGFR突变仍充满挑战(Wicha MS,Hayes DF.Circulating tumor cells:not all detected cells arebad and not all bad cells are detected.Journal of clinical oncology:officialjournal of the American Society of Clinical Oncology 2011；29:1508-1511)。从血浆样品中提取DNA与采集CTC相比相对简单直接。然而，检测血浆中的循环肿瘤DNA需要使用分子方法，诸如基于聚合酶链式反应(PCR)的技术(Kimura H,Kasahara K,Kawaishi M等Detection of epidermal growth factor receptor mutations in serum as apredictor of the response to gefitinib in patients with non-small-cell lungcancer.Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 2006；12:3915-3921；Kimura H,Suminoe M,KasaharaK等Evaluation of epidermal growth factor receptor mutation status in serumDNA as a predictor of response to gefitinib(IRESSA).British journal of cancer2007；97:778-784)、高效液相色谱法(Bai H,Mao L,Wang HS等Epidermal growth factorreceptor mutations in plasma DNA samples predict tumor response in Chinesepatients with stages IIIB to IV non-small-cell lung cancer.Journal ofclinical oncology:official journal of the American Society of ClinicalOncology 2009；27:2653-2659)以及突变富集液相芯片法(Zhang H,Liu D,Li S等Comparison of EGFR signaling pathway somatic DNA mutations derived fromperipheral blood and corresponding tumor tissue of patients with advancednon-small-cell lung cancer using liquidchip technology.The Journal ofmolecular diagnostics:JMD 2013；15:819-826)。这些技术是复杂、依赖技术且耗时的，并因此在临床使用中受到限制。

因此，本领域需要用于指导肺癌的治疗的系统和方法，该系统和方法为非侵入性的、随时可用的、只需最少的样品制品或无需样品制备，并提供关于EGFR突变状态的即时信息。本发明满足此需求。

发明内容

在一个方面，本发明提供了用于检测受试者中的肺癌的装置。该装置包括基底上的单元阵列，每个单元包括电极芯片，电极芯片包括工作电极、反电极和参比电极。至少一个单元的工作电极涂有导电聚合动物，导电聚合物嵌有捕获探针或用捕获探针官能化，捕获探针结合到肺癌的第一标志物。

在一个实施方案中，工作电极、反电极和参比电极由导电材料构成。在一个实施方案中，导电聚合物包含吡咯。在一个实施方案中，导电聚合物在工作电极上通过向装置施加循环方波电场而电聚合。

在一个实施方案中，肺癌的第一标志物是核酸。在一个实施方案中，捕获探针是与样品中编码突变EGFR的核酸序列杂交的核酸。在一个实施方案中，捕获探针是与样品中编码野生型EGFR的核酸序列杂交的核酸。

在一个实施方案中，编码突变EGFR的核酸编码选自EGFR的E746-A750缺失突变体和EGFR的L858R点突变的EGFR突变体。在一个实施方案中，捕获探针包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

在一个方面，本发明提供了检测受试者中的肺癌的方法。该方法包括：获得受试者的样品；将样品的第一部分与包含经标记的检测探针的溶液混合；将混合物添加到装置上的第一电极芯片，该电极芯片包括工作电极、反电极和参比电极；其中工作电极涂有导电聚合动物，该导电聚合物嵌有捕获探针，该捕获探针能够结合到样品中与肺癌相关的第一标志物；以及测量电极芯片中的电流，其中电流的变化与样品中存在与肺癌相关的第一标志物相关。

在一个实施方案中，该方案还包括在添加步骤期间向电极芯片施加循环方波电场。

在一个实施方案中，第一标志物包含可变区，该可变区包含具有与肺癌相关的突变的核酸序列，并且检测探针和捕获探针中的至少一者与可变区杂交。

在一个实施方案中，与肺癌相关的第一标志物包含编码突变EGFR的核酸。在一个实施方案中，编码突变EGFR的核酸编码选自EGFR的E746-A750缺失突变体和EGFR的L858R点突变的EGFR突变体。

在一个实施方案中，捕获探针包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

在一个实施方案中，经标记的检测探针包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

在一个实施方案中，样品是唾液样品。在一个实施方案中，样品是血液样品。

在一个方面，本发明提供了用于检测受试者中的肺癌的系统。该系统包括：具有至少一个孔的电化学传感器芯片，其中所述至少一个孔包括工作电极，该工作电极涂有导电聚合物，该导电聚合物用至少一种捕获探针官能化；以及至少一种经标记的检测探针。在一个实施方案中，当所述至少一种经标记的检测探针与来自受试者的含有肺癌的第一标志物的样品混合并加到所述至少一个孔中时，将电流施加到所述至少一个孔中的样品，使得当第一标志物的至少一些结合到捕获探针时，产生样品中电流的可测量变化，该变化指示肺癌。

在一个实施方案中，第一标志物包含可变区，该可变区包含具有与肺癌相关的突变的核酸序列，并且检测探针和捕获探针中的至少一者与可变区杂交。在一个实施方案中，第一标志物是编码突变EGFR的核酸。

在一个实施方案中，样品中的电流变化可在将样品加载到孔中之后10分钟内测量。

在一个实施方案中，编码突变EGFR的核酸编码选自EGFR的E746-A750缺失突变体和EGFR的L858R点突变的EGFR突变体。

在一个实施方案中，捕获探针包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一个实施方案中，经标记的检测探针包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

附图说明

结合附图一起阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详细说明。出于举例说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应当理解，本发明并不限于在附图中所示的实施方案的精确安排和手段。

图1是用于检测肺癌患者体液中的EGFR突变的系统平台阵列技术的示意图。施加电场的循环方波(csw E-场)以释放和检测EGFR突变。在电化学传感器上测量EGFR序列，该传感器具有在导电聚合物中的预涂布捕获探针。当在-200mV电场下与TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)反应时，辣根过氧化物酶(HRP)标记的报告探针生成安培信号。

图2(包括图2A至图2F)是一组曲线图，描绘了针对特定的人EGFR突变检测而对平台进行的体外优化。应用EFIRM来检测携带外显子19缺失(图2A)和L858R突变(图2B)的寡核苷酸的循环数。将靶向寡核苷酸以1nM的最终浓度溶于Tris-HCl缓冲液。将野生型序列用作失配序列。通过降低被靶向的致癌基因序列与其他序列的比率，测定作为外显子19缺失(取自HCC827细胞)和L858R(取自NCI-H1975细胞)的TKI敏感性EGFR突变。电化学电流读数针对外显子19缺失(图2C)和L858R(图2D)以安培信号列出。反应使用20ng的输入DNA一式三份地进行。针对外显子19缺失(图2E)和L858R(图2F)提供了得自一式三份实验的平均值和标准偏差。

图3(包括图3A至图3G)描绘了经由本发明的系统检测异种移植的肺癌小鼠中的EGFR L858R点突变。(图3A)使用EGFR L858R异种移植小鼠的肿瘤负荷研究的设计。用(图3B)10μL血浆(R＝0.86)、(图3C)20μL血浆(R＝0.98)和(图3D)40μL血浆(R＝0.95)测试四组小鼠。反应一式三份地进行，提供了平均值和标准偏差。对数据的线性拟合以红色显示，提供了相关系数R。对于(图3E)10μl血浆、(图3F)20μl血浆和(图3G)40μl血浆，列出了安培电流读数。

图4(包括图4A至图4E)描绘了经由本发明的系统检测得自NSCLC患者的血浆和唾液中的EGFR突变。将该平台与直接在得自肺癌患者的血浆和唾液中由活检确定的EGFR突变类型进行了比较。为了检测具体的突变类型，将对应的探针应用到电化学传感器以检测具体的突变类型。(图4A)用于唾液中外显子19缺失的探针；(图4B)用于唾液中L858R的探针；(图4C)用于血浆中外显子19缺失的探针；和(图4D)用于血浆中L858R的探针。(***P<0.0001，单向方差分析和邦费罗尼事后检验(Bonferroni post hoc test))。(图4E)用于得自肺癌患者的唾液中外显子19缺失的探针的安培电流结果。

图5(包括图5A至图5C)描绘了经由本发明的系统对唾液中EGFR突变进行设盲和随机化临床检测的结果。EFIRM一式两份地进行。呈现了根据患者亚组的与外显子19缺失(图5A)和L858R点突变(图5B)相关的信号的绝对值(^***p<0.0001，单向方差分析和邦费罗尼事后检验)。(图5C)分别用于检测(从左至右)外显子19缺失(AUC＝0.94，95％CI，0.82至1)和L858R突变(AUC＝0.96，95％CI，0.90至1)的接收者操作特征曲线。

图6(包括图6A和图6B)描绘了使用本发明的系统来展示血浆与唾液之间的EGFR突变状态的相关性的实验的结果。散点图显示了使用血浆和唾液记录的安培电流之间的相关性和线性回归。每个点表示试验组(图6A)和设盲组(图6B)中一名患者的数据。

图7(包括图7A和图7B)描绘了通过使用本发明的系统来展示对33名NSCLC患者的血浆进行EGFR突变检测的实验的结果。通过外显子19探针使用EFIRM检测到的外显子19缺失组的安培电流明显高于野生型和p.L858R突变体组中的安培电流(图7A：p.E746-A750del组中的131.3.6±55.76相比野生型组中的9.76±1.77和p.L858R突变体组中的10.26±2.87，p<0.0001)。使用用于p.L858R的探针得到了类似的结果(图7B：p.L858R突变体组中的110.6±57.99相比野生型组中的9.51±2.73和p.E746-A750del组中的9.34±1.86，p<0.0001)。

具体实施方式

应当理解，本发明的附图和描述已被简化，以示出相关的要素而便于清楚地理解本发明，同时为了清楚起见，取消了许多存在于典型的生物标志物检测系统和方法中的其他要素。本领域的普通技术人员可认识到在实施本发明中可能需要和/或必需其他要素和/或步骤。然而，因为此类要素和步骤是本领域熟知的，并且因为它们不利于更好地理解本发明，所以本文不提供对这样的要素和步骤的讨论。本文的公开内容涉及本领域技术人员已知的对此类要素和方法的所有此类变化和修改。

定义

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料均可用于实践或检验本发明，但是将描述优选的方法和材料。

如本文所用，以下术语中的每一个均具有与其在本章节中相关的含义。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。以举例的方式，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

如本文所用的“约”在涉及可测量的值诸如量、持续时间等时意在涵盖与指定值±20％、±10％、±5％、±1％和±0.1％的变化，因为此类变化是合适的。

术语“异常”当在生物体、组织、细胞或其组分的情况下使用时是指在至少一个可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、每天的时间等)方面与显示“正常”(预期)的相应特征的那些生物体、组织、细胞或其组分不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型而言为正常的或预期的特征对于不同的细胞或组织类型而言可能是异常的。

如本文所用，术语“改变”、“缺陷”、“变异”或“突变”是指细胞的基因中影响该基因编码的多肽的功能、活性、表达(转录或翻译)或构象的突变。本发明所涵盖的突变可以是细胞中的基因导致所编码的多肽的功能、活性、表达或构象增强或破坏(包括所编码的蛋白完全无表达)的任何突变，并可包括例如错义和无义突变、插入、缺失、移码和提前终止。在不进行这样的限制的情况下，本发明涵盖的突变可改变mRNA的剪接(剪接位点突变)或导致阅读框中的转移(移码)。

术语“扩增”是指存在于样品中的靶核苷酸序列的拷贝数倍增所借助的操作。

如本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚体。本发明的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等,1988,Science 242:423-426)。

如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。

如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要抗体轻链同种型。

如本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术生成的抗体，比如通过如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应被理解为是指已通过DNA分子的合成而生成的抗体，所述DNA分子编码该抗体并且所述DNA分子表达抗体蛋白、或指定该抗体的氨基酸序列，其中所述DNA或氨基酸序列使用本领域可用且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。

如本文相对于抗体使用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这样的物种交叉反应性本身不改变抗体的特定分类。在另一实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这样的交叉反应性本身不改变抗体的特定分类。在一些情况下，术语“特异性结合”可参照抗体、蛋白或具有第二化学物质的肽的相互作用被用来意指该相互作用取决于在该化学物质上存在特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合特定的蛋白结构，而不是通常识别并结合蛋白。如果抗体针对表位“A”是特异性的，那么在含经标记的“A”和该抗体的反应中存在含表位A(或游离的、未标记的A)的分子将减少经标记的A与该抗体的结合量。

如本文所用，术语“标志物”或“生物标志物”意在包括可根据本发明用于确定肺癌的存在性和/或严重性的参数。

如果满足以下条件，则某标志物或生物标志物的水平“明显”不同于参比样品中该标志物或生物标志物的水平：得自患者的样品中的标志物水平与得自参比受试者的样品中的水平相差的量大于用来评估该标志物的测定法的标准误差，优选地至少10％，更优选地25％、50％、75％或100％。

术语“对照或参比标准”描述不含或含有正常、低或高水平的本发明的一种或多种标志物(或生物标志物)的一种或多种标志物(或生物标志物)表达产物的材料，使得该对照或参比标准可用作可借以对样品进行比较的对比物。

所谓短语“确定标志物(或生物标志物)的表达水平”是指使用技术人员可用来检测任何标志物表达产物的足够部分的技术在核酸或蛋白水平上评估样品中标志物的表达程度。

“差异表达增加”或“上调”是指与对照相比高至少10％或以上，例如高20％、30％、40％、或50％、60％、70％、80％、90％或以上，和/或高1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或以上，以及高其间的任何和全部整数或分数增量的生物标志物产物水平。

“差异表达降低”或“下调”是指与对照相比低至少10％或以上，例如低20％、30％、40％、或50％、60％、70％、80％、90％或以下，和/或低2.0倍、1.8倍、1.6倍、1.4倍、1.2倍、1.1倍或以下，以及低其间的任何和全部完整或部分增量的生物标志物产物水平。

“疾病”是一种动物健康状态，其中该动物不能保持体内平衡，并且其中如果该疾病没有减轻，则动物的健康将持续恶化。

如本文所用，“指导性材料”包括出版物、记录、图表或可用于传达试剂盒中的本发明组分用于检测本文所公开的生物标志物的有效性的任何其他表达媒介。本发明的试剂盒的指导性材料可以例如被附连到包含本发明的组分的容器上或与含有该组分的容器一起装运。或者，指导性材料可与容器单独装运，目的在于该指导性材料和组分由接受方配合使用。

当用于本文时术语“标记”是指直接或间接缀合到探针以产生“经标记的”探针的可检测化合物或组合物。标记本身可以被检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可以催化可被检测的底物化合物或组合物化学改变(例如，亲和素-生物素)。在一些情况下，引物可被标记以检测PCR产物。

一种或多种生物标志物的“水平”是指在样品中该生物标志物的绝对或相对量或浓度。

如本文所用的术语“标志物(或生物标志物)表达”涵盖基因的转录、翻译、翻译后修饰和表型表现，包括将基因中所编码的信息转化成RNA或蛋白的所有方面。以非限制性实例的方式，标志物表达包括转录成信使RNA(mRNA)和翻译成蛋白，以及转录成各种类型的不翻译成蛋白的RNA，诸如转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。

“测量”或者“检测”是指评估临床或源自受试者的样品内给定物质的存在、不存在、数量或量(其可以是有效量)，包括此类物质的定性或定量的浓度水平的衍生，或者以其他方式评价受试者的临床参数的值或分类。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文可互换使用，并且是指适于本文所述的方法的任何动物或其细胞，不论是体外的还是原位的。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人。

如本文所用，术语“提供预后”是指提供对肺癌的可能过程和结果的预测，包括预测严重性、持续时间、恢复的机会等。所述方法也可以用来设计合适的治疗计划，例如通过指示病症是否仍处于早期阶段，或病症是否已发展到积极治疗将是无效的阶段。

生物标志物的“参比水平”是指指示特定疾病状态、表型、或其缺乏，以及疾病状态、表型、或其缺乏的组合的生物标志物水平。生物标志物的“阳性”参比水平是指指示特定疾病状态或表型的水平。生物标志物的“阴性”参比水平是指指示特定疾病状态或表型的缺乏的水平。

如本文所用的“样品”或“生物样品”是指从个体分离的生物材料。生物样品可以包括适于检测所需生物标志物的任何生物材料，并且可以包括从个体获得的细胞和/或非细胞材料。

如本文所用的“标准对照值”是指可在样品(诸如唾液样品，无论是全部唾液还是唾液上清液)中检出的特定蛋白或核酸的预定量。标准对照值适用于本发明的方法，以便用于比较存在于唾液样品中的所关注的蛋白或核酸的量。作为标准对照的既定样品提供具有合理匹配的背景(例如，性别、年龄、种族和病史)的普通、健康人典型的唾液中所关注蛋白或核酸的平均量。标准对照值可以根据所关注的蛋白或核酸以及根据样品的性质(例如，全部唾液或上清液)而有所不同。

贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围的形式呈现。应当理解，以范围形式给出的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，对范围的描述应当被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被认为具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的各个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、6和其间的任何整数及分数增量。不管范围的广度如何，这均适用。

说明

本发明涉及一种快速且准确的基于聚合物的电化学平台阵列，其用于从诸如唾液样品或血液样品的生物样品检测指示肺癌的单或多生物标志物。虽然本发明一般被描述为用于检测唾液样品或血液样品，但是应该理解的是，可以使用任何生物流体样品，或者甚至是其他组织类型，前提是此类替代样品类型携带待分析的靶向标志物。此类标志物的非限制性实例包括所有基于唾液的肺致癌基因突变，诸如在表皮生长因子受体(EGFR)或与肺癌相关或指示肺癌的任何其他标志物中的一个或多个突变。例如，此类可检测的核酸、或基因中的可检测突变的非限制性实例包括与KRAS、BRAF、CCNI、FGF19、FRS2、GREB1和LZTS1相关的那些。应当理解，任何数目的生物标志物均可以集成到测定平台，包括但不限于每个阵列1、2、4、8、16、32或64种生物标志物。

经由本发明对受试者中的肺癌进行非侵入性检测使得临床医生能够以快速、经济且非侵入性的方式确定肺癌的存在。如本文所考虑的，本发明包括用于检测肺癌生物标志物的多重电化学传感器。该装置利用小样品体积，而准确度较高。此外，通过单次样品加载，可在该装置上同时测量多种标志物。该装置可通过减轻回到诊所和实验室的患者的负担而大大降低保健系统的成本。

在一个实施方案中，电化学传感器是电极芯片(GeneFluidics,USA)的阵列。如图1中所示，阵列的每个单元具有工作电极、反电极和参比电极。三个电极可在反应前由裸金或其他导电材料构造而成，使得样本可以在工作电极上被固定。可以在工作电极与参比电极之间的电势下测量工作电极与反电极之间的电化学电流。电势分布图可以是例如恒定的值、线性扫描或循环方波。塑料孔的阵列可用于分开每个三电极组，这有助于避免不同传感器之间的交叉污染。导电聚合物也可以在工作电极作为支撑膜沉积，并且在一些实施方案中，作为使工作电极官能化的表面沉积。如本文所考虑的，任何导电聚合物均可使用，诸如聚吡咯、聚苯胺、聚乙炔、聚苯撑、聚亚苯基亚乙烯基(polyphenylenevinylenes)、聚噻吩等。

在一个优选的实施方案中，跨样品孔内的电极产生循环方波电场。在某些实施方案中，产生方波电场中以有助于一个或多个捕获探针与传感器的聚合物的聚合。在某些实施方案中，产生方波电场中以有助于捕获探针与标志物和/或检测探针的杂交。csw E-场中的正电势有助于分子聚积到工作电极上，而负电势则移除弱的非特异性结合，以产生增强的特异性。另外，跨循环方波的正和负电势之间的摆动还在温育期间提供优异的混合，而不破坏所需的特异性结合，这将加速结合过程并导致更快的测试或测定时间。在一个实施方案中，方波周期可由较长的低电压期和较短的高电压期组成，以增强样品内结合伴侣的杂交。虽然对所选的实际时期没有限制，但是实例包括0.15至60秒的低电压期和0.1至60秒的高电压期。在一个优选的实施方案中，每个方波周期由1秒低电压和1秒高电压组成。对于杂交，低电压可以为约-200mV而高电压可以为约+500mV。在一些实施方案中，方波周期的总数可以在2至50之间。在一个优选的实施方案中，将5个循环方波应用于每个表面反应。通过csw E-场，聚合和杂交均在几分钟内在相同芯片上完成。在一些实施方案中，从样品加载开始的总检测时间短于30分钟。在其他实施方案中，从样品加载开始的总检测时间短于20分钟。在其他实施方案中，从样品加载开始的总检测时间短于10分钟。在其他实施方案中，从样品加载开始的总检测时间短于5分钟。在其他实施方案中，从样品加载开始的总检测时间短于2分钟。在其他实施方案中，从样品加载开始的总检测时间短于1分钟。

多通道电化学读取器(GeneFluidics)控制施加到阵列传感器上的电场，同时报告安培电流。在实践中，可将溶液加载到包括工作电极、反电极和参比电极的三电极区的整个区域上，这些电极被塑料孔的阵列限制和分开。在每个步骤之后，可将电化学传感器用超纯水或其他洗涤溶液漂洗，然后干燥，诸如在纯N₂下。在一些实施方案中，传感器是单次使用的、一次性传感器。在其他实施方案中，传感器是可重复使用的。

在一个实施方案中，本发明基于捕获探针与检测探针之间的亲和力，如图1中所示。如本文所考虑的，该测定平台可以被组织为任何类型的亲和结合测定或免疫测定，如本领域技术人员将理解的那样。在另一个实施方案中，本发明包括用于多个肺癌生物标志物测量而不是单个标志物的单个平台。目前，还没有这样的可用于该目的技术或装置。在另一个实施方案中，本发明创造了巨大的效益，因为它是简单、快速且稳健的。例如，只需要小样品体积(例如10μl)和不到10分钟的运行时间。该装置可提供多标志物水平。通过提供统计分析，使用者可以对其风险作出估计，并且通过利用可用的联网系统，结果可以快速传输以供临床医生审查而用于进一步的评估。

例如，可以设计特异于突变的成对的探针(捕获探针和检测探针)，诸如用于缺失突变或用于点突变。在图1的实例和本文所呈现的实验中，使用两组探针，一个用于缺失突变，一个用于点突变。检测探针可例如用异硫氰酸荧光素或本领域已知的任何其他标记进行标记。捕获探针首先通过施加循环方波电场而共聚到裸金电极上。例如，对于共聚期间的每个周期，电场可设为+350mV持续1s和+950mV持续1s。总体而言，聚合可以进行为期10秒或被视为必要的任何时长的5个周期。

聚合后，可对传感器芯片进行漂洗和干燥以用于随后的样品测量。可将诸如细胞培养基、血液样品或唾液样品的样品与检测探针混合并转移到电极上。然后以低和高电压周期(诸如-200mV持续1s和+500mV持续1s)进行杂交。总的杂交时间可以是例如为期10秒的5个周期。接着，基于标记类型对标记进行检测。例如，可以使用在酪蛋白磷酸盐缓冲盐水中缀合到辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体，并且可以加载辣根过氧化物酶的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物，然后测量安培信号。

嵌入导电聚合物中或以其他方式用于官能化工作电极表面的捕获探针，以及与样品混合的检测探针可以根据本领域中已知的用于产生探针的任何方案来构造。

传感器的捕获探针或检测探针可以是特异性结合所关注的标志物中的一种或多种的核酸、蛋白、小分子等中的任一种。例如，在一个特定的实施方案中，捕获探针和检测探针是包含与本发明的一种或多种核酸标志物基本上互补的区的寡核苷酸或多核苷酸。在一个实施方案中，捕获探针和检测探针包含基本上彼此互补的区。也就是说，在一个实施方案中，捕获探针包含与检测探针的区基本上互补的区。用于设计和配制寡核苷酸探针的方法是本领域中熟知的。

在一个实施方案中，标志物包含可变区，其中该可变区可包含与疾病相关的突变，诸如缺失、置换、点突变等。在一个实施方案中，捕获探针被设计成与核酸标志物(即，以野生型和突变同种型存在)的保守区杂交。在一个实施方案中，检测探针被设计成杂交到标志物的具有疾病相关突变的可变区的核酸序列，从而检测样品中的突变。在另一个实施方案中，检测探针被设计成杂交到具有野生型或非突变序列的可变区的核酸序列，从而检测样品中野生型标志物的存在。在一个实施方案中，捕获探针被设计成杂交到野生型或突变的可变区，而检测探针被设计成杂交到保守区。

例如，在一个实施方案中，捕获探针包含与编码EGFR的核酸的保守区基本上互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，检测探针包含与编码EGFR的核酸的可变区基本上互补的核苷酸序列，其中该可变区编码EGFR的野生型氨基酸序列。在一个实施方案中，检测探针包含与编码EGFR的核酸的可变区基本上互补的核苷酸序列，其中该可变区编码EGFR的疾病相关的突变序列。例如，在某些实施方案中，检测探针包含与编码EGFR的核酸的可变区基本上互补的核苷酸序列，其中该可变区编码EGFR的疾病相关的缺失突变体或点突变。

在一个实施方案中，当本发明用于检测编码EGFR的E746-A750缺失突变体的核酸时，捕获探针包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，当本发明用于检测编码EGFR的L858R点突变的核酸时，捕获探针包含含有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核酸分子。

在一个实施方案中，当本发明用于检测编码EGFR的E746-A750缺失突变体的核酸时，检测探针包含含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸分子。在一个实施方案中，当本发明用于检测编码EGFR的L858R点突变的核酸时，检测探针包含含有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的核酸分子。

在一个实施方案中，检测探针包含引起传感器电流变化的可检测标记，从而指示检测探针和相关标志物与捕获探针的杂交。在某些实施方案中，可检测的标记本身可足以改变传感器的电流。在某些实施方案中，可检测的标记在与外源性反应物接触时引起电流的变化。例如，可检测的标记可与反应物反应，以产生由传感器的电极感测到的局部变化，从而产生安培信号。因此，在某些实施方案中，在将样品施加到传感器之前、期间或之后，将反应物加到传感器。

在某些实施方案中，可检测的标记直接缀合到检测探针。在另一个实施方案中，可检测的标记经由检测探针的中间标签或标记结合到检测探针。例如，在一个实施方案中，检测探针包含标签、标记或表位，它们可用于结合到具有上述可检测标记的抗体或其他结合化合物。

用于在电化学传感器中产生局部变化的可检测的标记和反应物的实例在本领域中是熟知的。在一个实施方案中，可检测的标记包括HRP而反应物为TMB，它们反应产生安培信号。在另一个实施方案中，可检测的标记包括脲酶，而反应物包括尿素。

对所用的此类探针的浓度没有限制，并且可根据需要由使用者优化。

由于本发明的增强的灵敏度，可将非常小的体积用于执行所需的测定。例如，来自受试者的生物样品的大小可介于5至100微升之间。在一个优选的实施方案中，样品大小仅需要为约40微升。对待测试的实际或最终样品大小没有限制。

本发明还涉及检测与受试者中的肺癌相关的或指示受试者中的肺癌的一种或多种标志物的方法。在一个实施方案中，该方法可以作为杂交测定法来进行，并包括以下步骤：从受试者获得样品，向样品添加用直接针对肺癌的靶向标志物的可检测部分标记的检测探针，将样品施加到之前嵌有捕获探针或用捕获探针官能化的导电聚合物涂布的电极芯片，以及测量电极芯片中的电流。可以测量可检测的部分，或可以测量样品中的电流幅值，以确定样品中标志物的存在或不存在。在某些实施方案中，标志物与传感器的电极的杂交导致电流的增加或负电流。例如，在一个实施方案中，杂交导致约-10nA至约-1000nA范围内的电流。

本发明提供了用于诊断受试者中的肺癌的方法。因此，本发明的特征在于通过检测本文所公开的生物标志物而鉴定处于发生肺癌风险中的受试者(包括那些无症状或仅表现出肺癌的非特异性指标的受试者)的方法。这些生物标志物也可用于监测正在接受肺癌治疗和疗法的受试者，以及用于选择或修改将在患有肺癌的受试者中有效的疗法和治疗，其中此类治疗和疗法的选择和使用延缓肺癌的进展，或防止其发生。

在某些实施方案中，由本发明的系统和方法检测的生物标志物包括但不限于：核酸、或基因中的可检测突变，包括与EGFR、KRAS、BRAF、CCNI、FGF19、FRS2、GREB1和LZTS1相关的那些。在某些实施方案中，核酸生物标志物包括一个或多个与疾病相关的突变，包括插入、缺失、置换、易位、点突变、单核苷酸变体(SNV)等。本发明可用于检测本领域已知的或在将来发现的任何与疾病相关的生物标志物或与疾病相关的突变。以各种形式的癌症存在的示例性突变可例如见于“癌症中的体细胞突变目录”(Catalogue of Somatic Mutationsin Cancer,COSMIC)(Wellcome Trust Sanger Institute)。

在某些实施方案中，由本发明的系统和方法检测的生物标志物包括突变EGFR和编码突变EGFR的核酸分子。例如，各种EGFR突变体与肺癌相关，包括但不限于外显子19中的缺失、外显子18-21中的点突变以及大多发生在外显子20中的框内插入或复制。

外显子19中的示例性缺失包括例如在K745-S752区中一个或多个氨基酸的缺失，包括但不限于E746-A750缺失、K745-E749缺失、E746-E749缺失和E746-R748缺失。EGFR的示例性点突变包括但不限于G719X、L858R、T790M和L861Q。

本发明可用于检测任何这种突变，因为捕获探针和/或检测探针可以专门设计成杂交到编码所关注的突变蛋白的核酸分子。

本发明提供改善的对肺癌的诊断和预后。发生肺癌的风险可以通过测量本文描述的生物标志物中的一种或多种，并将测量值与参比或索引值进行比较来评估。这样的比较可以用数学算法或公式进行，以便将来自多个单独的生物标志物的结果的信息与其他参数组合成单个测量或指数。被鉴定为具有升高的肺癌风险的受试者可以任选地被选择来接受治疗方案，诸如施用预防性或治疗性化合物或治疗措施，以预防、治疗或延迟肺癌的发生。

在发生肺癌之前鉴定受试者使得能够选择和启动各种治疗性干预或治疗方案以延缓、减轻或防止癌症的发展或严重性。在某些情况下，监测至少一种生物标志物的水平还允许监测治疗肺癌的过程。例如，可以从正在接受肺癌治疗方案或治疗性干预(例如药物治疗、放疗、化疗等)的受试者提供样品。样品可在治疗之前、期间或之后的各个时间点得自受试者。

本发明的生物标志物因此可用于产生(i)未患肺癌和预计不会发生肺癌和/或(ii)患有肺癌或预计会发生肺癌的受试者的生物标志物概况或签名。受试者的生物标志物概况可以与预定的或参比的生物标志物概况进行比较以诊断或确定有发生肺癌风险的受试者，监测疾病的进展和疾病的进展率，以及监测肺癌治疗的有效性。关于本发明的生物标志物的数据也可与肺癌的其他数据或测试结果(包括但不限于成像数据、病史和任何相关的家族史)组合或关联。

本发明还提供了鉴定用于治疗肺癌的适当的或以其他方式为特定受试者定制的药剂的方法。在这方面，可以获取来自暴露于治疗剂、药物或其他治疗方案的受试者的测试样品，然后可以测定一种或多种生物标志物的水平。可将该一种或多种生物标志物的水平与源自治疗之前和治疗之后的受试者的样品进行比较，或与源自一名或多名因此类治疗或暴露已显示出风险因子改善的受试者的样品进行比较。

在一个实施方案中，本发明是诊断肺癌的方法。在一个实施方案中，该方法包括确定肺癌的分期或严重性。在一些实施方案中，这些方法可以利用生物样品(诸如尿液、唾液、血液、血清、血浆、羊水或泪液)，以检测样品中的本发明的一种或多种标志物。通常，样品将是“临床样品”，其为源自患者的样品。在一个实施方案中，生物样品是血液样品。在某些实施方案中，生物样品是源自受试者的血样的血清样品或血浆样品。

在一个实施方案中，该方法包括检测受试者的生物样品中的一种或多种标志物。优选地，生物样品是唾液。在各种实施方案中，将受试者生物样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与对比物中的相应生物标志物的水平相比较。对比物的非限制性实例包括但不限于阴性对照、阳性对照、受试者的预期正常背景值、受试者的历史正常背景值、受试者为其成员的群体的预期正常背景值、或受试者为其成员的群体的历史正常背景值。

在另一个实施方案中，本发明是通过评估受试者的生物样品中一种或多种本发明的标志物的水平而监测受试者中的肺癌进展的方法。

在各种实施方案中，受试者是人类受试者，并且可以是任何种族、性别和年龄的。

从本文所述的本发明的方法获得的信息可以单独使用，或与从受试者或从得自受试者的生物样品获得的其他信息(例如，疾病状态、病史、生命体征、血液化学等)组合使用。

在本发明的方法的其他各种实施方案中，在以下情况中，本发明的一种或多种标志物的水平被确定为升高：当一种或多种本发明的标志物的水平与对比对照相比时增加了至少10％、至少20％、至少30、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少100％时。

在本发明的方法中，针对从患者获得的生物样品中的一种或多种本发明的标志物的水平，对来自受试者的生物样品进行评估。生物样品中一种或多种本发明的标志物的水平可以通过评估以下方面而确定：生物样品中一种或多种本发明的生物标志物的多肽的量，生物样品中一种或多种本发明的生物标志物的mRNA的量，生物样品中一种或多种本发明的生物标志物的DNA的量，生物样品中一种或多种本发明的生物标志物的酶活性的量，或它们的组合。

本发明还包括测定试剂盒，其含有电化学传感器阵列和用于设置、执行、监测和解读本发明的测定法的说明书。任选地，该试剂盒可以包括用于检测生物标志物中的至少一种的试剂。该试剂盒还可以任选地包括传感器读取器。

实验实施例

通过参照以下实验实施例进一步详细地描述本发明。这些实施例仅出于举例说明的目的而提供，无意进行限制，除非如此指定。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例，而是应该被解释为涵盖因本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

无需进一步说明，据信本领域的普通技术人员可以使用前述的说明和下面的说明性实施例，实现并利用本发明以及实践要求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出了本发明的示例性实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1肺癌患者中的非侵入性EGFR基因突变检测

在四个连续的阶段中开发并验证了通过本发明的系统来检测EGFR突变。第一，用具有以下两个特定人EGFR突变的人肺癌细胞系进行了体外加入(spike-in)实验：c.2236_2250del15，其编码存在于HCC827细胞系中的p.E746-A750突变(外显子19缺失的主要形式)，和c.2573T>G，其编码NCI-H1975癌细胞系中的p.L858R突变。第二，在小鼠肺癌异种移植模型中随着肺肿瘤负荷的变化检测了体液中的突变EGFR DNA。在肿瘤进展的各个阶段测试了得自用人肺癌细胞系NCI-H1975(携带EGFR L858R突变)异种移植的小鼠的血浆。第三，将系统用于检测NSCLC患者唾液和血浆中的EGFR突变。最后，在设盲的临床研究中在得自人类肺癌患者的唾液中验证了EGFR突变检测。

现在描述在这些实验中用到的材料和方法。

细胞培养和DNA分离

人肺癌细胞系NCI-H1975和HCC827得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)。使细胞在具有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中繁殖。将基因组DNA用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)分离，并使用Nanodrop^TM 8000分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)测定DNA浓度。

小鼠肺癌异种移植模型

约6-8周龄的雌性nu/nu小鼠得自Charles River Labs(MA,USA)。将动物安置在符合辉瑞机构动物护理和使用委员会(Pfizer Institutional Animal Care and UseCommittee)的指导原则的标准洁净室条件下。将NCI-H1975细胞(2×10⁶个细胞)以1:1的比率重悬在无血清的基质胶中，并立即经皮下植入每只动物的右腹侧(n＝9)。

患者样品

为了有资格纳入本研究，要求患者具有经病理学确认的III或IV期肺腺癌。招募从2012年6月至2013年12月在NCKUH(台湾台南)治疗的患者。该研究得到了NCKUH的研究伦理委员会的批准。所有患者签署参加这项研究的知情同意书，且允许使用其肿瘤组织并采集唾液用于EGFR突变分析。

为了确保在验证阶段对分析设盲，负责分配的中心(MD Anderson Cancer Center(Houston,TX))将随机数指派给得自NCKUH的唾液样品并将代码分配给UCLA进行测试。在分配中心指派随机数的人不是在UCLA执行测试的同一人，也不是在NCKUH采集唾液的人，从而确保了对样品的完整设盲。仅当UCLA实验室提交数据之后，才解开唾液代码。

小鼠血浆的采集

为了从小鼠分离血浆，在植入后11、16和19天当肿瘤为100-300mm³、500-900mm³或>1000mm³时采集血液。将每组的三只小鼠处死，包括原初对照小鼠。将动物置于麻醉(异氟烷-氧气混合物)下并经由心脏穿刺获得血液。在含有EDTA的Vacutainer管(BDBiosciences,San Jose,USA)中采集大约1mL的血液，并以1900×g在4℃下离心10分钟。吸出血浆上清液，转移到1.5mL微量离心管中，并以16,000×g在4℃下离心10分钟以除去额外的细胞碎片。将血浆上清液吸出并转移至另一微量离心管中，储存在-80℃下直到使用。

EGFR突变的基于PCR的分析

获得来自肺肿瘤、转移部位和恶性积液细胞块的肿瘤组织以用于EGFR突变分析。选择通过苏木精和伊红染色由显微镜检查确定肿瘤含量>80％的组织样品用于研究。采集胸腔积液，并以250×g在4℃下离心10分钟，冷冻细胞沉淀。从采样到冷冻的样品处理所需的时间短于2h(39)。将基因组DNA用QIAamp DNA小量提取试剂盒(Qiagen)从细胞裂解物或肿瘤石蜡包埋块提取，并用于EGFR突变分析，如之前所述(40)。

唾液采集

由于外显子19缺失和外显子21L858R点突变代表了90％的EGFR敏感突变(SharmaSV,Bell DW,Settleman J,Haber DA.Epidermal growth factor receptor mutations inlung cancer.Nature reviews Cancer 2007；7:169-181；Sequist LV,Bell DW,Lynch TJ,Haber DA.Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptorantagonists in non-small-cell lung cancer.Journal of clinical oncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 2007；25:587-595)，因此仅允许经确认为野生型或具有这些突变的患者加入研究。根据之前确立的方案采集未经刺激的全唾液并进行处理(Li Y,St John MA,Zhou X等Salivary transcriptomediagnostics for oral cancer detection.Clin Cancer Res 2004；10:8442-8450)。简而言之，在采集期间将唾液样品保持在冰上，然后以2,600×g在4℃下离心15分钟。将上清液从沉淀中除去，用RNA酶抑制剂(Superase-In,Ambion Inc.,Austin,TX,USA)处理，在使用前储存在-80℃下。

经由系统平台检测体液中的EGFR突变

图1示出了本发明的系统的核心技术。传感器是基于导电聚合物的电化学芯片，其具有16个裸金电极芯片(GeneFluidics,Los Angeles,USA)的阵列。阵列的每个单元具有工作电极、反电极和参比电极。16通道电化学(EC)读取器(GeneFluidics)控制施加到16阵列传感器上的电场，同时报告安培电流。

如下为平台设计了特异于两种TKI敏感性突变的配对探针(捕获探针和检测探针；Sigma,St.Louis,USA)：用于外显子19缺失的捕获探针：5’-TGT TGC TTC CTT GAT AGC GACG-3’(SEQ ID NO:1)；用于外显子19缺失的检测探针：5’-GGA ATT TTA ACT TTC TCA CCT-3’(SEQ ID NO:2)；用于L858R点突变的捕获探针：5’-CAG TTT GGC CCG CCC AAA ATC-3’(SEQ ID NO:3)；用于L858R突变的检测探针：5’-TTG ACA TGC TGC GGT GTT TTC A-3’(SEQID NO:4)。如在这些实验中所用，将检测探针用异硫氰酸荧光素(FITC)在其3’端进行标记。首先通过施加循环方波电场使二十微升的捕获探针(100nM)与吡咯(Sigma)和100μL 3M的溶于1x磷酸盐缓冲盐水(pH 7.5；Invitrogen,Grand Island,USA)的KCl(Mettler Toledo,Columbus,USA)共聚到裸金电极上。将KCl以300mM的最终浓度加入，以实现高离子强度。对于每个周期，电场设定为+350mV持续1s和+950mV持续1s。总共，聚合反应进行了为期10秒的5个周期。

聚合后，将传感器芯片用去离子水漂洗并干燥。然后将样品诸如细胞培养基或40μL血液或唾液样品与955μL Tris-HCl缓冲液(Invitrogen)中的5μL检测探针混合，并转移到电极上。在-200mV持续1s以及在+500mV持续1s执行杂交。总聚合时间同样是为期10s的5个周期。接着，添加在酪蛋白磷酸盐缓冲盐水(Invitrogen)中的150U/mL的缀合至辣根过氧化物酶(1:1000稀释；Roche,Indianapolis,USA)的抗荧光素抗体。最后，加载辣根过氧化物酶的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物，并测量安培信号。总检测时间短于10分钟，且仅需20-40μL的生物样品。

统计学分析

为了评价本发明的系统在检测EGFR突变中的性能，针对每个探针绘制了接收者操作特征曲线，并计算了AUC及其95％置信区间。所有分析均使用SAS 9.3TS Level 1M1(DeLong ER,DeLong DM,Clarke-Pearson DL.Comparing the areas under two or morecorrelated receiver operating characteristic curves:a nonparametricapproach.Biometrics 1988；44:837-845)进行。

现在描述实验的结果。

使用肺癌细胞系对EGFR突变检测进行优化

对图1中所描绘的系统进行了优化以检测以下EGFR突变：外显子21中的c.2573T>G(编码p.L858R)和外显子19中的c.2236_2250del15(编码15个碱基对的缺失，从而导致突变E746-A750del)。将具有相应突变的得自人肺癌细胞系NCI-H1975和HCC827的基因组DNA样品用于检测优化。

首先针对大致数量的杂交周期对电场特性进行优化(图2A和图2B)。在两个电波周期之后杂交信号快速增加。在五个周期之后，完美匹配的信号达到了平台，而错配序列仅生成背景信号水平。因此，经优化的杂交周期针对所有后续研究定义为五个。

通过降低突变EGFR DNA与野生型EGFR DNA的比率研究了系统检测相应EGFR突变的特异性和灵敏性(图2C至图2F)。对于p.E746-A750del，在存在野生型DNA的情况下检出了少至0.1％的突变DNA。对于p.L858R点突变，当使用对照样品时，检出了少至1％的突变DNA。将十微升2ng/μL的DNA用于这些实验。这些数据证实本发明的系统可以高灵敏度和特异性检测EGFR突变。

具有异种移植的肺癌的小鼠模型的血浆中EGFR突变的检测

血浆取自4种不同情形下肿瘤负荷渐增的用具有EGFR点突变p.L858R的人肺癌细胞系NCI-H1975异种移植的小鼠模型：(1)无肿瘤(非异种移植小鼠)，(2)小肿瘤(100-500mm³)，(3)中等肿瘤(500-900mm³)，和(4)大肿瘤(>900mm³)。将用携带EGFR野生型的HCT116细胞系异种移植的小鼠用作对照(Bamford等,2004,Br J Cancer,91:355-358)。为了确定经优化的系统是否能够检测这些异种移植小鼠血浆中的EGFR突变，以第0、11、16和19天的规定时间间隔用所述系统一式三份地测定了四十微升小鼠血浆(图3A)。观察到了电化学电流与肿瘤大小之间的正关系(图3B至图3D；(b)10μl血浆(R＝0.86)，(c)20μl血浆(R＝0.98)，和(d)40μl血浆(R＝0.95))。增大的血浆体积产生了对不同肿瘤大小的更好的区分(图3B至图3D)。原初小鼠与最低的信号量相关(图3B至图3D)。小肿瘤(100-500mm³)与明显不同于原初组的信号水平相关，而更大的肿瘤具有更高的电流信号(图3B至图3D)。在19天的生长后，得自具有大肿瘤的小鼠的DNA产生了大约几百nA的电化学电流(图3C和图3D)。这些结果表明本发明的系统可从异种移植小鼠血浆检测和监控进行性肿瘤发展。安培读数在图3E至图3G中提供。

使用所述平台测定法检测得自NSCLC患者的血浆和唾液中的EGFR突变

开展了实验以研究本发明的系统是否能够在NSCLC患者的血浆和唾液中检测两种最常见的TKI敏感性EGFR突变(p.L858R和p.E746-A750del)。对于每名NSCLC受试者，在National Cheng Kung University Hospital(NCKUH)采集组织、血浆和唾液。在样品采集后，在NCKUH进行了基于活检的EGFR基因分型。通过EFIRM在University of California,Los Angeles(UCLA)进行了两种EGFR突变的基于血浆和唾液的检测。

二十二名NSCLC患者(12名男性和10名女性，平均年龄62.0±12.7，大部分不吸烟)满足入选标准并入选(表1)。EGFR突变率与在亚洲肺腺癌中检测EGFR突变的其他研究相当，范围从38％(Huang YS,Yang JJ,Zhang XC,Yang XN,Huang YJ,Xu CR,Zhou Q,Wang Z,SuJ,Wu YL.Impact of smoking status and pathologic type on epidermal growthfactor receptor mutations in lung cancer.Chin Med J(Engl)2011；124:2457-2460)至55％(Ho HL,Chang FP,Ma HH,Liao LR,Chuang YT,Chang-Chien YC,Lin KY,ChouTY.Molecular diagnostic algorithm for epidermal growth factor receptormutation detection in asian lung adenocarcinomas:Comprehensive analyses of445taiwanese patients with immunohistochemistry,pcr-direct sequencing andscorpion/arms methods.Respirology 2013；18:1261-1270)。在首次治疗前获得血浆和唾液样本。图4示出了得自唾液和血浆的结果，显示了与基于活检的基因分型相比的相应EGFR突变。在唾液样品中得自p.E746-A750del外显子19缺失组检测的原始安培电流信号在图4E中示出，数据在60秒时读取。使用外显子19探针通过EFIRM检测的外显子19缺失组(p.E746-A750del)的安培电流明显高于基于唾液的野生型和p.L858R突变体组中的电流(图4A和图4E；p.E746-A750del组中的106.3±13.2相比野生型组中的12.8±7.5和p.L858R突变体组中的6.3±4.7；P<0.0001)。使用L858R探针通过EFIRM检测的外显子21突变体组(p.L858R)的安培电流明显高于野生型和p.L858R突变体组中的电流(图4B；p.L858R突变体组中的66.5±27.2相比野生型组中的9.5±5.3和p.E746-A750del组中的7.7±4.2；P<0.0001)。使用针对外显子19缺失组(图4C；p.E746-A750del组中的117.2±8.1相比野生型组中的20.7±11.7和p.L858R突变体组中的10.4±9.2；P<0.0001)和p.L858R突变体组(图4D；p.L858R突变体组中的79.0±34.2相比野生型组中的18.1±8.9和p.E746-A750del组中的13.5±7.4；P<0.0001)设计的探针，从血浆得到了类似的结果。建议采用与对照组的平均值相比高2个SD的截止值来区分突变体组和对照组。这些发现表明EFIRM可用于检测具有NSCLC的患者的血浆和唾液中的特定EGFR突变。

使用所述平台测定法检测NSCLC患者中的EGFR突变的设盲和随机化研究

为了确定是否可以用经优化的系统技术来检测NSCLC患者唾液中的EGFR致癌基因突变，从40名具有两种最常见的EGFR酪氨酸激酶域突变(p.L858R和外显子19缺失)的NSCLC患者获得设盲唾液，并通过本发明的系统进行评价。

得自晚期NSCLC患者的四十个唾液样品在National Cheng Kung UniversityHospital(NCKUH)采集，设盲，检测并送往University of California,Los Angeles(UCLA)进行验证。在NCKUH进行基于活检的EGFR基因分型(表2)。设盲的样品在MD AndersonCancer Center(MDACC)由第三方机构的生物统计学家进一步随机化，然后在UCLA进行两个EGFR突变的EFIRM测量。在UCLA将平台测定法用于检测这些患者的唾液中的两个EGFR突变。

患者队列由22名男性和18名女性组成，平均年龄为58.8±10.4岁；32个病例(80％)表现出IV期癌症，大多数患者不吸烟(表1)。设盲组中的临床特征(包括肿瘤分期和EGFR突变)与试验组中的相似。

使用外显子19探针通过EFIRM检测的外显子19缺失组的安培电流明显高于野生型和p.L858R突变体组中的电流(图5A；p.E746-A750del组中的126.6±58.6相比野生型组中的14.5±3.5和p.L858R突变体组中的9.6±3.7；P<0.0001)。使用针对p.L858R突变体组设计的探针获得了类似的结果(图4B；p.L858R突变体组中的113.2±75.1相比野生型组中的15.9±9.6相比p.E746-A750del组中的9.5±3.2；P<0.0001)。接收者操作特征分析(图5C)表明对于携带p.E746-A750del或p.L858R突变的探针而言AUC分别为0.94(95％CI,0.82–1)和0.96(95％CI,0.90–1)(图5C)。

使用EFIRM确定血浆与唾液之间EGFR突变状态的相关性

将得自血浆的发现与得自唾液的发现进行比较，以评价唾液是否能像血浆一样提供有用信息并用作用于突变测试的额外体液。对于试验组，使用两个不同的探针，将唾液的安培电流与得自血浆的电流相关联(图6A；p.E746-A750del组中的R＝0.98，P<0.0001和p.L858R组中的R＝0.99，P<0.0001)。

在设盲组(33个血浆样品)中观察到了类似的结果。首先证实了EFIRM能够用于检测这33名患者的血浆中的特定EGFR突变(图7A和图7B)。如在试验队列中，据发现，通过EFIRM检测的血浆的安培电流与得自唾液的电流相关联(图6B；p.E746-A750del组中的R＝0.94，P<0.0001和p.L858R组中的R＝0.92，P<0.0001)。

表1：

表1试验组和设盲验证组的患者特征。^aT检验；^b卡方检验；^c费歇尔检验(Fisher’stest)

表2：

F，女性；M，男性；PR，部分响应；SD，病情稳定

表2四名接受TKI的患者的临床特点及疗程

使用外显子19探针通过EFIRM检测的外显子19缺失组的安培电流明显高于野生型和p.L858R突变体组中的电流(图5A，p.E746-A750del组中的126.6.±58.57相比野生型组中的14.52±3.54相比p.L858R突变体组中的9.61±3.67，p<0.0001)。使用针对p.L858R突变体组设计的探针获得了类似的结果(图5B，p.L858R突变体组中的113.2±75.06相比野生型组中的15.85±9.65和p.E746-A750del组中的9.54±3.24，p<0.0001)。接收者操作特征分析(图5C)表明对于携带p.E746-A750del或p.L858R突变的探针而言，曲线下面积(AUC)分别为0.94(95％CI，0.82至1)和0.96(95％CI，0.90至1)(图5C；表3)。(表3)。

表3：

CI，置信区间。

表3TKI治疗的接收者操作特征分析。

本发明的系统用于致癌基因突变分析

当前的致癌基因突变检测技术主要基于PCR，需要样品预处理和若干小时的检测时间。经由本发明的系统，从循环EGFR序列中准确鉴定了EGFR突变。该系统利用(1)从体液简单而有效的生物标志物释放，(2)增强的样品混合和积聚，(3)增强的EGFR基因杂交和(4)对非特异性干扰的抑制。当暴露于非均匀电场时，DNA/RNA在原位快速释放。每一突变的特异性预计会产生在电压、周期数、持续时间和其他参数方面独特的电场特性。电场(循环方波)中的正电势有利于基因靶标积聚到工作电极上，而负电势则移除弱结合的非特异性序列。除了增强杂交外，循环方波电场还因电场的连续摆动而产生近场溶液混合和积聚。该系统仅允许完美匹配的序列杂交；错配的序列则被移除。通过单独优化所关注的每个靶序列的电特性，该系统实现与定量PCR相当的灵敏性和特异性，而只需要几微升临床样品。

目前，对于从机理上如何检测唾液中的肿瘤特异性致癌基因突变尚不完全明确。在之前的研究中，已证实，源自乳腺癌的微囊泡能够与唾液腺细胞相互作用，从而改变它们分泌的微囊泡的组成(Lau CS,Wong DT.Breast Cancer Exosome-like Microvesiclesand Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-DerivedExosome-like Microvesicles In Vitro.PLoS ONE 2012；7:e33037)；抑制胰腺癌中的外来体生物起源导致不能产生判别性唾液生物标志物(Lau C,Kim Y,Chia D等Role ofPancreatic Cancer-derived Exosomes in Salivary Biomarker Development.J BiolChem 2013；288:26888-26897)。最近的研究提供了关于以下方面的进一步证据：外来体不仅携带蛋白、RNA、微RNA、线粒体DNA(Guescini M,Guidolin D,Vallorani L等C2C12myoblasts release micro-vesicles containing mtDNA and proteins involved insignal transduction.Experimental cell research 2010；316:1977-1984)和单链DNA，还携带双链突变Kras和p53 DNA的大片段(Kahlert C,Melo SA,Protopopov A等Identification of Double Stranded Genomic DNA Spanning all Chromosomes withMutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with PancreaticCancer.The Journal of biological chemistry 2014)。更重要的是，肿瘤特异性EGFRvIII之前已在血清微囊泡中检出(Paez JG,Janne PA,Lee JC等EGFR mutations inlung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science2004；304:1497-1500)，并表明会释放到血液中与缺乏EGFRvIII的癌细胞的质膜合并(Al-Nedawi K,Meehan B,Micallef J等Intercellular transfer of the oncogenicreceptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumor cells.Nature cellbiology 2008；10:619-624)，可以合理地假设：源自肺癌细胞的携带EGFR DNA的微囊泡影响其他细胞诸如唾液腺中的那些细胞的DNA含量。然而，肺癌细胞释放这些微囊泡并经由血液将它们分散到远处的机制仍未确立。

TKI治疗对EGFR突变的检测的影响

在检测来自NSCLC患者的唾液中的EGFR突变的关联性分析期间，已意识到，四名患者在进入研究前接受了TKI治疗(表2)。这四个样品的安培电流明显低于(10～25-nA)得自具有相同EGFR突变但之前未接受TKI治疗的NSCLC患者的信号。得自经TKI治疗的病例的信号与具有野生型EGFR的那些患者相似。据假设，TKI治疗有效抑制NSCLC细胞的生长，从而导致较少的循环肿瘤细胞脱落和/或突变EGFR(游离形式或外来体结合的)脱落，并有效导致本发明的系统在唾液中更低的检出。这与本发明的数据一致。应当注意的是，数据分析排除了这4名之前用TKI治疗的病例。

在NSCLC患者中检测EGFR突变的当前临床实践

对扩增后的DNA产物进行直接测序是检测EGFR突变的最流行方法。这一策略通常需要长达3-4周才能得出结果，并且在临床上受到低灵敏度和假阴性或无信息结果的限制，尤其是对于细胞学样本而言。已经引入了若干新的技术，包括使用TaqMan PCR以及变性高效液相色谱法(Janne P,Borras A,Kuang Y等Arapid and sensitive enzymatic methodfor epidermal growth factor receptor mutation screening.Clinical cancerresearch:an official journal of the American Association for Cancer Research2006；12:751-758；Chin T,Anuar D,Soo R等Detection of epidermal growth factorreceptor variations by partially denaturing HPLC.Clin Chem 2007；53:62-70；EndoK,Konishi A,Sasaki H等Epidermal growth factor receptor gene mutation in non-small cell lung cancer using highly sensitive and fast TaqMan PCR assay.LungCancer 2005；50:375-384)，但它们都未被用作检测EGFR突变的标准临床方法。

此外，通常还存在与适当组织样品的采集和可获性以及肿瘤内遗传异质性相关的实际临床障碍。在患有晚期NSCLC的患者中，并不总是能够得到用于EGFR突变测试的肿瘤组织，因为根据CT引导的活检或支气管镜活检，仅采集少量的组织，或采集的组织具有极低水平的肿瘤或无肿瘤。最近的证据提示，区域分离的异质性体细胞突变事件可导致采样偏差，这将损害对源自单肿瘤活检的基因组数据的解读(Gerlinger M,Rowan AJ,Horswell S等Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregionsequencing.The New England journal of medicine 2012；366:883-892；Yap TA,Gerlinger M,Futreal PA,Pusztai L,Swanton C.Intratumor heterogeneity:seeingthe wood for the trees.Science translational medicine 2012；4:127ps110)。对于不具有足够用于突变测定的肿瘤组织的患者，或由于组织样品中的肿瘤异质性而怀疑与假阴性结果相关的患者，基于体液的EGFR突变检测可替代组织活检用于分子诊断。

本发明的系统的临床应用

将本发明的系统应用于直接检测来自NSCLC患者唾液的EGFR突变将以非侵入性、快速且经济有效的方式提供关于EGFR突变状态的信息。这些优点将使得临床医生能够以及时的方式调整他们的治疗策略，因而改善EGFR靶向疗法的临床结果。由于该系统基于电化学平台，因此其可容易地转变成高通量致癌基因突变分析实验室测定法以及用于在现场快速鉴定致癌基因突变的护理点装置。已经开发了基于该平台的将唾液样品用于癌症检测的便携式护理点装置(数据和原型未示出。除了有助于做出治疗决策外，该系统还具有诊断或筛查肺癌的潜力。对于不具有足够用于突变测定的肿瘤组织的患者，经由本发明进行的突变检测可替代组织活检。该系统技术的另一项有影响力的应用是解决在这些EGFR-TKI治疗过程中因EGFR激酶域中的继发性突变而最终发生的熟知的耐药性，这种耐药性阻碍EGFR靶向疗法后生存率的总体改善。本发明是一种非侵入性方法，其将允许在肺癌进展期间连续监测体细胞EGFR突变。第三，对于具有肺结节的患者而言，该平台将有助于差异诊断。最后，该系统具有筛查肺癌的潜力，尤其是在从不吸烟的人中。虽然大多数肺癌源自吸烟，但在全世界约25％的肺癌病例发生于从不吸烟的人，每年造成>300,000例死亡(Sun S,SchillerJH,Gazdar AF.Lung cancer in never smokers--a different disease.Nature reviewsCancer 2007；7:778-790；Wakelee HA,Chang ET,Gomez SL等Lung cancer incidence innever smokers.Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology 2007；25:472-478)。在考虑暴露于香烟烟雾的量之后，已提议对高风险受试者进行基于低剂量CT的检查以提供对肺癌的早期诊断(BoisellePM.Computed tomography screening for lung cancer.JAMA:the journal of theAmerican Medical Association 2013；309:1163-1170)。然而，对于从不吸烟的人，并未确立理想的方法来检测处于高癌症风险的那些人。EGFR突变是第一类与从不吸烟的患者中的癌症相关的特定基因突变，并且增加的香烟暴露与EGFR突变状态负相关(Pham D,Kris MG,Riely GJ等Use of cigarette-smoking history to estimate the likelihood ofmutations in epidermal growth factor receptor gene exons 19and 21in lungadenocarcinomas.Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology 2006；24:1700-1704)。与为了检测循环DNA而采集血液相比，采集唾液是非侵入性的，因此使用本发明来检测EGFR突变对于早期肺癌筛查中基于血液的诊断是有利的，尤其是在从不吸烟的人中。

本文引用的每一专利、专利申请和出版物的公开内容据此均整体以引用方式并入本文。

虽然已参照具体的实施方案公开了本发明，但显而易见的是，本发明的其他实施方案和变型形式可由本领域的技术人员在不脱离本发明的实质和范围的情况下设计。所附权利要求旨在被视为包括所有此类实施方案和等同的变型形式。

序列表

<110> 加利福尼亚大学董事会

魏方(Wei, Fang)

大卫•Ｔ•Ｗ•翁(Wong, David T.W.)

苏武舟(Su, Wu-Chou)

<120> 肺癌患者中的非侵入性基因突变检测

<130> 206030-0045-00-WO.604504

<150> US 62/007,286

<151> 2014-06-03

<160> 4

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 1

tgttgcttcc ttgatagcga cg 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 2

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<210> 3

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<210> 4

<211> 22

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<213> 人工序列

<220>

<223> 化学合成的

<400> 4

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Claims (25)

1.一种用于检测受试者中的肺癌的装置，包括：

基底上的单元阵列，每个单元包括电极芯片，所述电极芯片包括工作电极、反电极和参比电极；

其中至少一个单元的所述工作电极涂有导电聚合物，所述导电聚合物嵌有捕获探针或用捕获探针官能化，所述捕获探针结合到肺癌的第一标志物。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述工作电极、反电极和参比电极由导电材料构成。

3.根据权利要求1所述的装置，其中所述导电聚合物包含吡咯。

4.根据权利要求1所述的装置，其中所述导电聚合物在所述工作电极上通过向所述装置施加循环方波电场而电聚合。

5.根据权利要求1所述的装置，其中所述肺癌的第一标志物是核酸。

6.根据权利要求1所述的装置，其中所述捕获探针是与样品中编码突变EGFR的核酸序列杂交的核酸。

7.根据权利要求6所述的装置，其中所述编码突变EGFR的核酸编码选自EGFR的E746-A750缺失突变体和EGFR的L858R点突变的EGFR突变体。

8.根据权利要求1所述的装置，其中所述捕获探针是与样品中编码野生型EGFR的核酸序列杂交的核酸。

9.根据权利要求1所述的装置，其中所述捕获探针包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

10.一种检测受试者中的肺癌的方法，包括：

获得所述受试者的样品；

将所述样品的第一部分与包含经标记的检测探针的溶液混合；

将混合物添加到装置上的第一电极芯片，所述电极芯片包括工作电极、反电极和参比电极；其中所述工作电极涂有导电聚合动物，所述导电聚合物嵌有捕获探针，所述捕获探针能够结合到所述样品中与肺癌相关的第一标志物；以及

测量所述电极芯片中的电流，其中电流的变化与所述样品中存在与肺癌相关的所述第一标志物相关。

11.根据权利要求10所述的方法，还包括在添加步骤期间向所述电极芯片施加循环方波电场。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述第一标志物包含可变区，所述可变区包含具有与肺癌相关的突变的核酸序列，并且所述检测探针和捕获探针中的至少一者与所述可变区杂交。

13.根据权利要求10所述的方法，其中与肺癌相关的所述第一标志物包含编码突变EGFR的核酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述编码突变EGFR的核酸编码选自EGFR的E746-A750缺失突变体和EGFR的L858R点突变的EGFR突变体。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述捕获探针包含选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3的核苷酸序列。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述经标记的检测探针包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品是唾液样品。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品是血液样品。

19.一种用于检测受试者中的肺癌的系统，包括：

具有至少一个孔的电化学传感器芯片，其中所述至少一个孔包括工作电极，所述工作电极涂有导电聚合物，所述导电聚合物用至少一种捕获探针官能化；以及

至少一种经标记的检测探针；

其中当所述至少一种经标记的检测探针与来自受试者的含有肺癌的第一标志物的样品混合并加到所述至少一个孔中时，将电流施加到所述至少一个孔中的所述样品，使得当所述第一标志物的至少一些结合到所述捕获探针时，产生所述样品中电流的可测量变化，所述变化指示肺癌。

20.根据权利要求19所述的系统，其中所述第一标志物是编码突变EGFR的核酸。

21.根据权利要求19所述的系统，其中所述样品中的电流变化可在将所述样品加载到所述孔中之后10分钟内测量。

22.根据权利要求19所述的系统，其中所述第一标志物包含可变区，所述可变区包含具有与肺癌相关的突变的核酸序列，并且所述检测探针和捕获探针中的至少一者与所述可变区杂交。

23.根据权利要求20所述的系统，其中所述编码突变EGFR的核酸编码选自EGFR的E746-A750缺失突变体和EGFR的L858R点突变的EGFR突变体。

24.根据权利要求19所述的系统，其中所述捕获探针包含选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:3的核苷酸序列。

25.根据权利要求19所述的系统，其中所述经标记的检测探针包含选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的核苷酸序列。