CN110117653A - 肺癌突变位点的突变率的检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肺癌突变位点的突变率的检测方法,其包括:(1)对肺癌患者外周血的血浆样本进行cfDNA的提取,获得cfDNA提取物;(2)针对肺癌相关的EGFR L858R位点设计第一突变型检测探针(序列为SEQ ID NO:5)和第一野生型检测探针(序列为SEQ ID NO:6)、第一引物(序列为SEQ ID NO:1)和第二引物(序列为SEQ ID NO:2),并且针对肺癌相关的EGFR 19号外显子缺失位点设计第二突变型检测探针(序列为SEQ ID NO:7)、第二野生型检测探针(序列为SEQ ID NO:8)、第三引物(序列为SEQ ID NO:3)和第四引物(序列为SEQ ID NO:4);(3)以cfDNA提取物为模板,进行ddPCR检测,获得含有敏感性突变位点的扩增产物;(4)对扩增产物进行数据分析,获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的突变率。由此,能够灵敏地获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的突变率。
Description
本申请是申请日为2017年10月24日、申请号为201711003578.2、发明名称为一种 肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及医学和生物技术领域,具体涉及一种肺癌突变位点的突变率的检测方法及试剂盒。
背景技术
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤,绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮,故亦称支气管肺癌。近50多年来,世界各国特别是工业发达国家,肺癌的发病率和死亡率均迅速上升,是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,5年生存率仅为16.8%,每年新确诊肺癌患者达到160万,肺癌同时也是癌症患者死亡的首要病因,每年有140万人口死于肺癌。
目前,传统的肺癌治疗方式有:外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可以切除肿瘤,但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移,还可能造成器官损伤及身体免疫力降低;化疗是一种全身性的治疗,效果明显和迅速,但是在杀伤肿瘤细胞的同时也可能会把正常细胞一起杀灭,所以,化疗算得上是一种“玉石俱焚”的治疗方法;放疗在某些肿瘤方面可以达到手术切除的效果,但放疗成本高,周期长,并发症也较多。
靶向治疗作为一种新兴治疗手段,由于其毒性小,副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。然而靶向药物的选择依赖于患者的基因分型,靶向药物往往有其对应的靶基因,当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活,或者是调控细胞凋亡的信号通路被抑制,当使用相应的靶向药物之后,该通路被阻断,肿瘤细胞被杀死。因此针对肺癌的靶基因以及其驱动基因的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是靶向治疗的重要作用靶点,目前针对EGFR的靶向药物包括EGFR抗单克隆抗体药爱必妥、帕尼单抗,以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙和特罗凯。其中,针对酪氨酸激酶抑制剂靶向药物的使用还要参照EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性突变,最常见的敏感性突变包括EGFR L858R突变和EGFR 19Del。这些突变使患者对EGFR-TKI(tyrosine kinase inhibitor,酪氨酸激酶抑制剂)敏感,对肺癌患者靶向药物的选择具有指导意义,如果野生型患者采用EGFR-TKI治疗,会增加41%疾病进展风险的概率。因此,检测EGFR基因突变情况,筛查获益人群,将大大提高药物的效率并节约资源。
肿瘤的治疗效果与肿瘤的早期发现有很大的关系,由于肺癌肿瘤细胞倍增时间短、进展快,非小细胞肺癌患者中,约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率很低,因此肺癌检出越早越有利于治疗,因此研发一种为肺癌早期诊断提供参考信息的检测技术迫在眉睫。
循环肿瘤DNA(ctDNA),是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物,可用于基因分型和肿瘤发展状态及预后的无创检测。CtDNA是游离DNA(cell-freeDNA,cfDNA)的一种,最早应用于产前胎儿性别的判断和筛查唐氏综合征等发育性疾病。但是存在于外周血液中的游离DNA与癌症关系的理解十分缓慢,原因是ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。随着肿瘤的疾病进展,ctDNA在血液中的含量也随之升高,液体活检技术在超早期就能对血液中含有的极微量的ctDNA进行捕获测序,为肿瘤早期诊断及相关突变提供参考依据,这对癌症的早期发现是一次革命性的进步。
现有的EGFR基因方法主要包括QPCR、一代测序、FISH、IHC等。但是,这些方法检测步骤繁琐,且敏感度低,而且针对FISH以及IHC的检测结果还需要有经验的技术人员进行鉴定。近几年来,液体活检出现在公众的视野之中,《ASCO年度报告:2015临床肿瘤学进展》中,液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一,可以实现稀有变异和拷贝数变异的检出,灵敏度高。
针对现有的肺癌检测方法存在如下缺陷与不足:第一,传统检测优化方法主要依靠技术人员的经验进行结果判读,不能直接、客观、准确反映检测结果,也不能对DNA进行绝对定量;第二,现有的基于肺癌EGFR L858R和19Del的检测优化方法,通常对样本的cfDNA总量和质量要求高,容易受大量血缘DNA以及反应抑制剂的影响;第三,现有的基于肺癌EGFRL858R和19Del的检测优化方法检测步骤繁琐,且检测灵敏度低,会存在一定量的假阳性检测结果,尤其是血浆样本中cfDNA假阳性检出率更高,因为cfDNA主要是来源于胚系起源的良性细胞,ctDNA占比相对低很多;第四,有文献资料显示在cfDNA提取过程中加入carrierRNA并不能促使cfDNA提取总量增加,很有可能会使gDNA大片段聚沉。第四,液体活检步骤繁琐,周期较长,成本高,不适合单个或2个位点的检测。
综上,基于循环肿瘤DNA检测技术现已成为焦点,但是本领域还是缺乏低投入、高灵敏度、高准确性的突变DNA检测技术来检测肺癌EGFR L858R和19Del。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的在于提出一种低投入、高灵敏度、高准确性的肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法及应用。
所采用的技术方案为:
一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测方法,包括如下步骤:
(1)提供肺癌患者外周血样本,对所提供的外周血样本进行血细胞和血浆分离;
(2)对分离获得的血浆样本采用两步纯化法进行cfDNA的提取,获得cfDNA提取物;
(3)针对肺癌相关的EGFR L858R位点设计2个探针如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示、和1对引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;针对肺癌相关的EGFR 19号外显子缺失位点设计2个探针如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示、和1对引物如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示;
(4)以提取的cfDNA为模板,进行ddPCR检测,获得含有敏感性突变位点的扩增产物;
(5)对获得的扩增产物进行数据分析,获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的比例。
本发明采用针对肺癌EGFR L858R位点和EGFR 19Del区域分别设计的1对引物和2条荧光探针对微量cfDNA进行PCR扩增和检测,然后对探针荧光信号值进行数据分析,获得准确的EGFR L858R和EGFR19号外显子19Del信息。
本发明的肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del的检测方法,其检测结果,仅用于分析和判断靶标基因的突变信息,并为肺癌患者治疗和用药指导提供可靠的分析依据。
本发明针对EGFR 21号外显子L858R突变位点上下游特定区域,设计特异性高的长度分别为22bp和24bp的1对PCR引物;针对突变型和野生型EGFR L858R位点设计了特异性高的突变型检测探针和野生型检测探针,长度为16bp。
本发明针对EGFR 19号外显子缺失突变上下游特定区域,设计了特异性高的长度分别为22bp和18bp的1对PCR引物;针对突变型和野生型EGFR L858R位点设计了特异性高的突变型检测探针和野生型检测探针,长度分别为21bp,18bp。
本发明ddPCR检测方案以血浆/血清中提取的cfDNA为模板,进行PCR扩增,对PCR循环数和退火温度进行优化,能够在cfDNA低投入量的情况下检出EGFR L858R和19Del低频突变,为肺癌患者的靶向治疗方案制定提供了重要的参考依据。
优选的,步骤(1)中,抽取肺癌患者外周血,4h内进行血浆和血细胞的分离,血浆和血细胞分离的方法包括如下步骤:
1)外周血样本1600g,离心外周血10min,分离为血细胞和血浆(上清液),血细胞于-80℃保存;
2)血浆样本进行第二次离心,16000g离心10min,移取上清液转并移至保存管中,置于-80℃保存。
优选的,步骤(2)中,采用两步纯化法抽提血浆cfDNA,抽提过程中不加入carrierRNA。
优选的,步骤(2)中,两步纯化法为:第一次采用异丙醇沉淀cfDNA,去除杂质,第二次采用无水乙醇沉淀cfDNA,去除杂质之后,去离子水进行洗脱,洗脱液即为所需的cfDNA模板。
优选的,步骤(3)中,是针对野生型和突变型的EGFR L858R位点以及野生型和缺失型19号外显子设计。
需要说明的是,本发明的检测优化方法中EGFR L858R和EGFR19Del位点的选择是因为该位点对EGFR-TKI治疗方案的选择具有指导意义。EGFR激酶结构域是由18-24号外显子组成,而EGFR激酶激活突变最常见于18-21号外显子,这些激活突变聚集围绕在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合的口袋周围。吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等TKI是具有19号外显子缺失和21号L858R突变的大多数晚期肺癌患者的首选治疗方式。
优选的,步骤(3)中,探针的3’端均具有MGB-NFQ修饰,野生型检测探针5’端均具有FAM荧光基团修饰,突变型检测探针5’端具有HEX荧光基团修饰。
需要说明的是,FAM和HEX属于荧光基团,NFQ属于猝灭基团。当FAM基团或HEX基团与NFQ基团在同一序列上时,两个基团位置相聚很近,此时FAM荧光基因或HEX荧光基团因为NFQ猝灭基团的作用而不产生荧光信号;当荧光探针结合靶标序列上后,会因为Taq酶的扩增作用而被降解,从而导致FAM荧光基因或HEX荧光基团与NFQ猝灭基团分离,荧光信号得以释放,从荧光信号数值可以分析得到检测位点的突变率。
优选的,步骤(5)中,数据分析包括荧光阈值确定,检测阈值确定,阴、阳性结果判读;荧光阈值的确定包括空白对照组和阴性对照组荧光阈值的确定;检测阈值的确定包括最低检测限的阳性对照组阈值的确定;阴、阳性结果的判读包括依据阴性对照组、最低检测限的阳性对照组以及强阳性对照组的数据分析对检测结果进行分析、判定。
一种肺癌EGFR L858R和19Del的ddPCR检测试剂盒,所述试剂盒中含有针对野生型和突变型L858R位点设计的2条探针如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示和针对所述位点上下游设计的1对引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;和
所述试剂盒中含有针对野生型和突变型19号外显子设计的2条探针如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示、和针对缺失部位上下游设计的1对引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
所述试剂盒采用上述任一所述方法进行EGFR L858R和19Del检测。
上述所述的试剂盒在肿瘤患者治疗中的应用,所述试剂盒对肺癌患者EGFR T790M和19Del进行检测,为肺癌患者提供基因位点突变信息,为肺癌个体化精准用药指导、药效评估以及疗效监测提供重要的参考依据。
可以理解,本发明的检测方法就是针对肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del位点设计的,可以应用于各种肺癌检测试剂盒或检测设备,获得实时、准确的肺癌EGFR L858R和EGFR19Del位点的突变信息。
本发明的公开了一种肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del检测的试剂盒,试剂盒中含有本发明的肺癌EGFR L858R位点的2条荧光检测探针和1对目标区域PCR扩增引物和EGFR19Del的2条荧光检测探针和1对目标区域PCR扩增引物,并且,试剂盒采用本发明的检测方法对待测样品进行检测。
一种肺癌患者络氨酸激酶抑制剂敏感性突变的检测方法,其用上述任一所述方法进行EGFR L858R和19Del检测,在肺癌晚期治疗过程中,为肺癌患者提供基因位点突变信息,为肺癌个体化精准用药指导、药效评估以及疗效监测提供了重要的参考依据。
由于采用以上技术方案,本发明的有益效果在于:
本发明的肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del检测方法,以ctDNA为检测对象,优化外周血中cfDNA的提取,只需要少量的外周血,并针对肺癌EGFR L858R位点和EGFR 19Del分别设计了特异性高的2条荧光检测探针和1对目标区域PCR扩增引物,能够准确、实时的反映EGFRL858R和EGFR 19Del位点的变异情况,具有较高的灵敏度。本发明的检测优化方法针对ctDNA中的肺癌EGFR L858R和EGFR19Del位点进行PCR扩增、检测分析,针对肺癌患者提供用药相关的EGFR L858R和EGFR 19Del位点突变信息,为肺癌患者个体化精准用药指导、药效评估以及靶向治疗动态监测提供了重要的参考依据。
附图说明
图1是本申请实施例中20160319072001-e样本提取的cfDNA的质控检测结果图;
图2是本发明实施例中cfDNA样本L858R突变型位点检测一维结果图(图中深灰色代表无扩增的cfDNA微滴,蓝色代表突变型cfDNA微滴。)
图3是本发明实施例中cfDNA样本L858R野生型位点检测一维结果图(图中深灰色代表无扩增的cfDNA微滴,绿色代表野生型cfDNA微滴。)
图4是本发明实施例中cfDNA样本L858R突变型、野生型位点检测二维结果图;
图5cfDNA EGFR L858R突变阴性检测结果图。A:突变型检测结果图;B:野生型检测结果图。
图6是本申请实施例中20160511002-e样本提取的cfDNA的质控检测结果图;
图7是本发明实施例中cfDNA样本19Del突变型位点检测一维结果图(图中深灰色代表无扩增的cfDNA微滴,蓝色代表野生型cfDNA微滴。)
图8是本发明实施例中cfDNA样本19Del野生型位点检测一维结果图(图中深灰色代表无扩增的cfDNA微滴,绿色代表野生型和突变型cfDNA总微滴。)
图9是本发明实施例中cfDNA样本19Del突变型、野生型位点检测二维结果图;
图10cfDNA EGFR 19Del突变阴性检测结果图。
具体实施方式
据美国国家综合癌症网(缩写NCCN)NSCLC临床指南推荐,肺癌患者在使用EGFR-TKI之前应进行EGFR的基因检测,以选择获益人群。目前市场上针对肺癌的基因检测技术主要是FISH、ARMS、一代测序技术或者是二代高通量测序技术。这些检测手段都存在很多弊端,例如:全基因组或者全外显子组的检测,虽然检测内容丰富,但是成本高,而且检测出来的绝大多数信息与肺癌无关;FISH检测结果的准确性高度依赖于检测人员的经验和技能;二代高通量测序检测步骤繁琐,工作量较大,检测周期较长,仅用于检测1-2个基因位点的突变信息费用较高。因此迫切需要针对肺癌一个或两个位点进行分析,检测开发一种快速、便捷、准确、经济的检测技术,以便实现肺癌靶向治疗动态实时监测。
本发明通过对大量方法和试剂的筛选,改进血浆中cfDNA的提取方法,不需加入carrier RNA,采用两步醇沉的方法进行提取DNA,并将微滴数字PCR与高特异性的引物序列和探针序列相结合,创造性的提出了一种实时、无创、精准、快速的肺癌EGFR L858R和EGFR19Del位点的检测方法。本发明的检测方法以外周血中极其微量的ctDNA为检测对象,通过微滴乳化技术,降低抑制剂的影响,从而降低背景噪声,使得检测方法的灵敏度和准确性大幅度提升。
本发明的肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del的检测方法,可为肺癌靶向用药提供关键的靶标突变位点信息,并可根据患者的个体差异性,辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案,提高患者生活质量,延长患者的生存时间。
发明本发明中涉及的名词解释如下:
荧光检测探针,是指针对肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del的野生型位点和突变型位点设计的2条带有荧光基团、MGB基团和NFQ猝灭基团的探针,这2条捕获探针确保了L858R和EGFR 19Del的野生型和突变型位点能够被准确的检测,不遗漏,也没有其它基因的干扰,保障了检测的精准。
“carrier RNA”为一种是协助分离RNA的试剂。其成分为ployG偶联到DNAmate一种高分子化合物。研究表明,Carrier RNA能特异吸附低浓度RNA,并且有助于降低提取过程中RNase对RNA的降解作用。然而,研究表明,RNA Carrier对于常规双链DNA的提取并无促进作用。
本文所用“血液”和“外周血”为相同概念。
本文所用“酪氨酸酶抑制剂”指施用于对象后,能够引起酪氨酸激酶活性降低或表达量减少的药物和药物组合物。本发明的“酪氨酸激酶抑制剂”包括本领域所有已知或待开发的酪氨酸激酶抑制剂,例如:易瑞沙、埃罗替尼等。
PCR特异性扩增,是指利用PCR扩增的方法,对外周血中提取的极其微量的cfDNA进行EGFR L858R和EGFR 19Del特定区域的扩增。
下面通过具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明,不应理解为对本发明的限制。
实施例
本例的检测方法主要包括,从血液中提取游离循环DNA,以cfDNA为模板,利用设计的EGFR L858R和EGFR 19Del的野生型和突变型荧光探针及相应的引物对cfDNA进行PCR扩增,并对扩增产物进行检测,最后对荧光信号数据进行分析,获得肺癌EGFR L858R和19Del的变异信息。实际样本选用福建多中心肺癌项目样本编号为20160518001-e,用于L858R位点信息的检测;福建多中心肺癌项目样本,编号为20160511002-e,用于19Del位点信息的检测。
实施例1 cfDNA提取优化
外周血中的ctDNA含量很低,比例约为1/1000,因此保证血浆cfDNA提取质量至关重要。
优选的,cfDNA提取方案详细步骤如下:
1.取外周血2mL在获得血液的3h内处理,包括以下步骤:
(1)1600g,离心外周血10min,分离为血细胞和血浆(上清液),血细胞于-80℃保存;
(2)血浆样本进行第二次离心,16000g离心10min,移取上清液转并移至保存管中,置于-80℃保存。
2.本例具体采用核酸提取或纯化(重鼎,ZD-YL-Midi-40)进行cfDNA提取,优化提取步骤如下:
(1)取洁净的10mL离心管,加入10μL ProteinaseK,再加入1mL步骤1收集的血浆,然后加入1mL溶液GH,漩涡混合20sec。然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min。
(2)上述混合液中加入1mL异丙醇(血浆:GH:异丙醇=1:1:1),充分漩涡混合。将混合液移入套有收集管的中量离心柱后10000rpm离心1min,弃去收集管中废液。
(3)向离心柱中加入2.5mL溶液W1A(按照要求加入无水乙醇),然后10000rpm离心2min,取出离心柱后弃去收集管中废液,将离心柱放回。
(4)向离心柱中加入4mL溶液W2(按照要求加入无水乙醇),10000rpm离心2min,去除废液。
(5)向离心柱中加入1.5mL无水乙醇,10000rpm离心2min,将离心柱小心取出,转移至新的15mL离心管中,开盖室温放置10min,挥发残余乙醇。
(6)向离心柱中加入450μLTE溶液,室温静置10min后,10000rpm离心3min;
(7)弃去15mL离心管内的中量离心柱,向管内洗脱液中加入450μL溶液BK,混匀;
(8)加入450μL无水乙醇,混匀后室温静置5-10min(第二步醇沉)。
(9)取微量离心柱(套有收集管),将700μL混匀液移入微量离心柱中,封盖离心(10000rpm,30s),弃废液。重复操作,直至混匀液全部过柱。
(10)12000rpm,空转2min,然后室温静置5min,挥发残留乙醇。
(11)将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中,然后向柱中加入溶液NFwater(50~60℃预热,提高洗脱效率)20μL,室温静置5min后离心(13000rpm,2min),
(12)然后柱中加入20新鲜的NFwater进行二次洗脱,离心获得的溶液即为提取的cfDNA样本,共40μL。
(13)采用LifeQubit2.0测定提取的cfDNA的浓度,Agilent 4200TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小。
实施例2肺癌患者外周血提取的ctDNA的EGFR L858R和19Del位点检测
微滴式数字PCR系统(droplet digital PCR)在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理,将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后,对每个微滴的荧光信号进行逐一分析,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统的PCR技术相比,微滴式数字PCR方法能够确认代检靶分子的绝对数目,且具有更高的精确度和灵敏度。
本例的检测采用的EGFR L858R和EGFR 19Del目的区域PCR扩增上、下游引物是深圳市海普洛斯生物科技有限公司自主发明设计的。在本发明的一个优选例中,所述的针对EGFR L858R特异性引物具体如SEQ IDNO:1(CAGCATGTCAAGATCACAGATT)和SEQ ID NO:2(CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTC);所述的针对EGFR 19Del特异性引物具体如SEQ ID NO:3(TGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC)和SEQ ID NO:4(ACACAGCAAAGCAGAAAC)。
本例的检测采用的EGFR L858R和EGFR 19Del突变型荧光检测探针和野生型荧光检测探针属于深圳市海普洛斯生物科技有限公司自主研发设计。突变型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括FAM荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团。这种探针在退火时与基因突变型位点结合;野生型荧光检测探针从5’端到3’端依序包括HEX荧光基团、突变位点结合序列、MGB修饰基团和NFQ猝灭基团。这种探针在退火时与EGFR L858R野生型位点结合。因为FAM基团和HEX基团的所用激发波长不一样,检测系统可以很好的区分两者的荧光信号值,从而计算出检测样本EGFR L858R和EGFR 19Del突变率。
具体的,本例设计的突变型探针具体为所示序列。
L858R-TT:
5’-FAM-CAGTTTGGCCCGCCCA-MGB-NFQ
19Del-TT:
5’-FAM-AGGAATTAAGAGAAGCAACAT-MGB-NFQ
具体的,本例设计的野生型探针具体为所示序列。
L858R-TW:
5’-FAM-CAGTTTGGCCAGCCCA-MGB-NFQ
19Del-TW:
5’-FAM-ATCGAGGATTTCCTTGTT-MGB-NFQ
本例所用的上下游引物由生工生物工程股份有限公司合成;野生型、突变型检测探针由life technologies公司合成。
具体操作如下:
1.提取肺癌患者外周血浆的cfDNA;
2.配制反应体系:
(1)探针和引物的设计:本发明针对EGFR L858R和EGFR 19Del目标区域的上下游设计特异性引物;采用Taqman探针法进行设计,针对EGFR L858R和EGFR 19Del突变型和野生型序列设计相对应的突变型和野生型探针。
(2)按照表1配置PCR反应体系(先不加DNA模板),12μL/管进行分装。该阶段在试剂准备区完成,将配制好的反应体系转移至样本制备区。
(3)向分装好的PCR反应体系中加入DNA模板,反应体系共20μL,该阶段在样本制备区完成。模板添加顺序依次为:空白对照、阴性对照、受检验样本、弱阳性对照、强阳性对照。空白对照组:8μL无菌水,封闭PCR管;阴性对照组:4μL野生型标准品(1.25ng/μL)和4μL无菌水;弱阳性对照组:4μL(5ng/μL,0.1%突变率)弱阳性标准品和4μL无菌水;样本检测组:无菌水稀释的受检样本,8μL;强阳性对照组:4μL强阳性标准品(0.25ng/μL,5%突变率)和4μL无菌水。
(4)各体系涡旋仪混合,于掌式离心机离上离心,去除气泡,然后将反应体系转移至ddPCR检测区。
表1 PCR反应体系的配制
3.ddPCR检测阶段(阶段在ddPCR检测区完成)
(1)制备微滴
a取出微滴生成卡,按操作要求组装,在Oil加样孔中加入油,70μL/孔;
b在Sample加样孔中加入20μL上述反应体系,盖上封条,于微滴生成器中反应。由于微滴生成时,Oil孔与sample孔不能为空,故空白的Oil孔加入70μL油,Sample孔用25μL水代替。
(2)PCR扩增
a用移液枪将生成的微滴缓慢吸取并转移至96孔PCR板孔内(吸取和转移微滴时需缓慢操作,防止产生气泡,单次操作用时约5s)。
b用预热好的PX1热封仪对其进行封膜,推荐的运行程序为:180℃,5s。
c完成封膜后,将96孔板置于梯度扩增仪(T100Thermal Cycler)进行PCR反应,PCR条件如下:
EGFR L858R检测PCR反应条件:95℃变性10min;94℃变性30sec,60℃退火1min,40cycles;4℃保存。
EGFR 19Del检测PCR反应条件:95℃变性10min;94℃变性30sec,55℃退火1min,40cycles;4℃保存。
(3)微滴检测
将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪,设置反应参数,编辑样品信息,对所有样本进行荧光检测;微滴读取结束后,保存数据,进行下一步分析。
实施例3 EGFR L858R和EGFR 19Del位点荧光信号数值的分析
1.EGFR L858R位点荧光信号分析
(1)打开QuantaSoft软件,导入样本检测数据,选择Analyze模块开始对数据进行分析。
(2)首先需要确认所有样本类型的微滴生成数要在10000以上,只有在这个范围内检出的数据的CV值能控制在1.6%以内。然后选择1D Amplitude,确定突变型探针和野生型探针的荧光阈值,以空白对照组和野生型对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值。图2、图3说明本发明设计的EGFR L858R探针特异性很好,能明显区分出野生型微滴和突变型微滴。
(3)QuantaSoft软件会根据泊松分布计算每个样本20μL反应体系所含的模板拷贝数。利用FAM拷贝数/(FAM拷贝数+HEX拷贝数)可计算出L858R突变率。
(4)分析结果
测试结果见表2
表2 肺癌样本20160319072001-e EGFR L858R检测结果
本例对肺癌病人的样本的ctDNA进行检测,模板投入量均约为10ng,检测结果显示,20160319072001-eEGFR21号外显子L858R发生了EGFR-TKI敏感性突变,突变率为1.2%,突变检测结果见图4;存在EGFR L858R基因突变的肺癌患者,可依据FDA批准/NCCN推荐,服用一代TKI易瑞沙、特罗凯或二代TKI阿法替尼用于治疗。
2.EGFR 19Del位点荧光信号的分析
EGFR 19Del探针设计原理:如果样本为野生型,则同时显示FAM和HEX荧光信号;如果样本为突变阳性,只显示HEX信号。因此,EGFR 19Del突变率的计算方法为:(HEX拷贝数-FAM拷贝数)/HEX拷贝数。
分析流程如下:
(1)打开QuantaSoft软件,导入样本检测数据,选择Analyze模块开始对数据进行分析。
(2)首先需要确认所有样本类型的微滴生成数要在10000以上,只有在这个范围内检出的数据的CV值能控制在1.6%以内。然后选择1D Amplitude,确定突变型探针和野生型探针的荧光阈值,以空白对照组和野生型对照组划定突变型探针和野生型探针的阈值。图7、图8说明本发明设计的EGFR 19Del探针特异性很好,能明显区分出野生型微滴和突变型微滴。
(3)QuantaSoft软件会根据泊松分布计算每个样本20μL反应体系所含的模板拷贝数。利用(HEX拷贝数-FAM拷贝数)/HEX拷贝数可计算出L858R突变率。
(4)分析结果
测试结果见表2
表2 肺癌样本20160319072001-e EGFR 19Del检测结果
本例对肺癌病人的样本的ctDNA进行检测,模板投入量均约为10ng,检测结果显示,20160511002-e样本19号外显子发生了19Del EGFR-TKI敏感性突变,突变率为2.0%,突变检测结果见图8。存在EGFR基因19号外显子缺失突变的肺癌患者,可依据FDA批准/NCCN推荐,服用一代TKI易瑞沙、特罗凯或二代TKI阿法替尼用于治疗。
本发明的肺癌EGFR L858R和EGFR 19Del检测方法,以ctDNA为检测对象,具有灵敏度高的优势,可以从微量的cfDNA中检测出ctDNA。采用本例的检测方法,抽取5-10mL外周血液,通过对ctDNA的检测分析,动态评估癌症发展变化,制定精准医疗方案,整个检测过程无创伤,对病患没有任何负面影响;并且,本例的检测优化方法,可以准确的检测出靶向药物相关的EGFR L858R基因和EGFR 19Del,这为个体化精准用药指导提供了重要的参考依据。
本发明的检测方法,结合基因捕获技术,检测血液ctDNA的变异情况,具有10,000x以上的测序深度,测序的灵敏度能达到0.05%;并且,能够检测点突变、插入缺失、基因融合,基因拷贝数变化等基因变异信息,给出最精准的用药指导信息。
本发明具体涉及高灵敏度检测外周血浆中EGFR(epidermal growth factorreceptor,表皮生长因子受体)基因21外显子L858R位点突变和19号外显子缺失突变(19Del)的方法以及在监控肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂产生敏感性突变方面的应用,可用于指导肿瘤治疗的分析检测技术。本发明涉及外周血浆cfDNA(cell-freeDNA,游离DNA)提取方法和检测方法的优化,针对ctDNA(circulating tumourDNA,,循环肿瘤DNA)中的肺癌靶向用药相关位点进行检测分析,在肺癌晚期治疗过程中,针对肺癌患者提供用药相关基因位点突变信息,为肺癌个体化精准用药指导、药效评估以及疗效监测提供了重要的参考依据。本发明中所需要的cfDNA投入量可以低至0.5ng,检测灵敏度可以达到0.05%。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种肺癌突变位点的突变率的检测方法,其特征在于,包括:
(1)对肺癌患者外周血的血浆样本进行cfDNA的提取,获得cfDNA提取物;
(2)针对肺癌相关的EGFR L858R位点设计第一突变型检测探针和第一野生型检测探针、第一引物和第二引物,并且针对肺癌相关的EGFR 19号外显子缺失位点设计第二突变型检测探针、第二野生型检测探针、第三引物和第四引物;
(3)以所述cfDNA提取物为模板,进行ddPCR检测,获得含有敏感性突变位点的扩增产物;
(4)对所述扩增产物进行数据分析,获得EGFR敏感性突变L858R和19Del的突变率,
其中,所述第一突变型检测探针的序列为SEQ ID NO:5,所述第一野生型检测探针的序列为SEQ ID NO:6,所述第一引物的序列为SEQ ID NO:1,所述第二引物的序列为SEQ IDNO:2,并且
所述第二突变型检测探针的序列为SEQ ID NO:7,并且所述第二野生型检测探针的序列为SEQ ID NO:8,所述第三引物的序列为SEQ ID NO:3,所述第四引物的序列为SEQ IDNO:4。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,
在步骤(1)中,采用所述两步纯化法抽提血浆cfDNA。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,
在步骤(1)中,所述两步纯化法为:采用异丙醇沉淀cfDNA,去除杂质,然后采用无水乙醇沉淀cfDNA,去除杂质之后,去离子水进行洗脱,以获得包含cfDNA模板的洗脱液。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,
在步骤(2)中,所述第一突变型检测探针、所述第一野生型检测探针、所述第二突变型检测探针和所述第二野生型检测探针的3’端均具有MGB-NFQ修饰。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法,其特征在于,
所述第一野生型检测探针和所述第二野生型检测探针的5’端均具有FAM荧光基团修饰,并且所述第一突变型检测探针和所述第二突变型检测探针的5’端具有HEX荧光基团修饰。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,
在步骤(4)中,所述数据分析包括荧光阈值的确定、检测阈值的确定、以及阴阳性结果的判读。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,
所述荧光阈值的确定包括空白对照组和阴性对照组荧光阈值的确定;所述检测阈值的确定包括最低检测限的阳性对照组阈值的确定;所述阴阳性结果的判读包括依据阴性对照组、最低检测限的阳性对照组以及强阳性对照组的数据分析对检测结果进行分析、判定。
8.一种检测肺癌突变位点的突变率的试剂盒,其特征在于,是根据权利要求1至7中的任一项所述的检测方法检测的试剂盒。
9.一种检测肺癌突变位点的突变率的试剂盒,其特征在于,
包括针对肺癌相关的EGFR L858R位点设计第一突变型检测探针和第一野生型检测探针、第一引物和第二引物,并且针对肺癌相关的EGFR 19号外显子缺失位点设计第二突变型检测探针、第二野生型检测探针、第三引物和第四引物。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,
所述第一突变型检测探针的序列为SEQ ID NO:5,所述第一野生型检测探针的序列为SEQ ID NO:6,所述第一引物的序列为SEQ ID NO:1,所述第二引物的序列为SEQ ID NO:2,并且
所述第二突变型检测探针的序列为SEQ ID NO:7,并且所述第二野生型检测探针的序列为SEQ ID NO:8,所述第三引物的序列为SEQ ID NO:3,所述第四引物的序列为SEQ IDNO:4。
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