CN105624309A - 检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K-ras基因的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒，以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。使用本发明的引物和探针检测基因突变的方法包括：提供所述引物及探针；提取待测样品的DNA；配制扩增突变基因序列的荧光PCR反应体系；用目标探针与内参探针分别与扩增产物杂交，并检测相应荧光基团的荧光信号；根据目标探针与内参探针的荧光信号的强度和比例，判断基因突变的存在和/或计算突变率。本发明的检测基因突变的方法所需引物及探针数量少，优化过程简单，可以定性或定量地检测EGFR和/或K-ras基因的相关突变，且检测灵敏度高；对低起始量的DNA样本，也能够稳定检出。

Description

检测EGFR和/或K-ras基因突变的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因突变检测领域，具体地，涉及检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K-ras基因的突变的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。
背景技术
根据国际癌症研究中心(IARC)估计，未来癌症发病人数年均将会以3％～5％的速度递增，预计2020年全球将有2000万新发病例，死亡病例将达1200万。从发病率来看，中低收入国家癌症发病率远高于发达国家。所以强调各国应当采取必要的预防措施。我国每年用于癌症病人的医疗费用约800亿元，约占卫生总支出的20％，远高于其他慢性病的医疗费用。近50年来，我国癌症的发生谱有明显的变化：原来高发的胃癌、宫颈癌、阴茎癌、食管癌和鼻咽癌等有不同程度的下降；而肺癌、乳癌、结肠癌和前列腺癌等发病率有明显上升。
肿瘤是一种多因素参与、多步骤发展的全身性、系统性疾病，癌症相关基因异常是导致肿瘤细胞出现逃避凋亡、无限复制、血管生成、侵袭及转移和免疫逃逸等异常生物学行为的根本原因。靶向治疗，是针对肿瘤细胞特有的靶点(如导致肿瘤细胞生长失控的基因靶点)设计结合药物，达到抑制肿瘤细胞分裂增殖。具有高选择性和低毒性，可以长期用药，从而可以在延长患者生存时间的同时改善生活质量。
21世纪以来，在临床肿瘤学领域内，分子靶向治疗(MolecularTargetedTherapy)的涌现已经为很多乳腺癌、淋巴瘤、肺癌、大肠癌、肾癌、白血病和胃肠间质瘤(GIST)等患者带来了生存希望。在短短的十数年间，先后涌现出针对肿瘤细胞增殖信号传导通路的利托昔单抗(美罗华)、曲妥珠单抗(贺赛汀)、吉非替尼(易瑞沙)、厄罗替尼(特罗凯)、伊马替尼和西妥昔单抗(爱必妥)以及针对肿瘤新血管生成的贝伐单抗(Avastin)、恩度(rh血管内皮抑素，endostar)等一大批分子靶向药物。索拉非尼是第一个获得FDA批准用于治疗晚期肾癌的药物，可使晚期肾癌患者的无进展生存期(PFS)延长一倍；替西罗莫司(temsirolimus)2007年经美国FDA批准用于晚期肾癌的治疗，2009年NCCN肾癌专家组将替西罗莫司作为高危转移性肾透明癌患者的一线治疗方案。口服的mTOR抑制剂依维莫司(everolimus)则在2010年经FDA批准上市。
近年来，以表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)和EGFR信号通路中关键的组分为靶标的分子靶标检测及靶向治疗成为国际肿瘤界个体化医疗关注的焦点。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，吉非替尼和厄罗替尼已被FDA批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。这些靶向药物已应用于晚期和不适宜传统治疗方案的NSCLC患者的临床治疗。此外，范得他尼(Zactima)和索拉菲尼也都在进行临床试验，初步结果令人鼓舞。
EGFR主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。EGFR被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增值、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR信号转导通路上的基因发生体细胞突变及表达异常，从而导致肿瘤细胞无限制的扩增和迁移。
美国国家癌症综合网络(NCCN)2009年版的临床指南中明确指出：EGFR突变，尤其是第19号外显子缺失突变与肿瘤对TKIs如吉非替尼(Gefitinib)的敏感度有重要关系。综合文献中大量数据显示，Gefitinib在携带EGFR基因突变的NSCLC中的有效率是76.7％，有的文献提到的有效率甚至达到90％以上，而在野生型EGFR患者中只有12.2％。EGFR突变是靶向药物治疗的一个必要前提条件。
K-ras基因编码21kD的RAS蛋白，又名p21基因。在ras基因中，K-ras对人类癌症影响最大，它是一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。检测K-ras基因突变是深入了解癌基因的情况，了解各种癌症的发展预后，放、化疗疗效的重要指标。针对非小细胞肺癌的统计显示，约25％的腺癌患者携带K-ras基因突变。K-ras变异与吸烟史相关，与K-ras野生型患者相比，突变携带者具有更短的生存时间，与患者的不良预后相关。临床研究显示，具有K-ras基因突变的NSCLC患者对EGFR-TKI治疗不敏感。美国国家癌症综合治疗联盟(NationalComprehensiveCancerNetwork，NCCN)《结直肠癌临床实践指南》明确指出：1)所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；2)只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗。
因此，检测组织或血浆中EGFR、K-ras基因突变对于癌症患者临床用药，具有重要的参考价值。
EGFR基因突变主要发生在第18-21号外显子，最常见的突变包括第19号外显子的缺失突变，第20号外显子的片段插入和第21号外显子的点突变，这三类突变占EGFR突变的90％以上。第19号外显子的碱基缺失主要是在第746-752位密码子的缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸序列丢失，从而改变了细胞对TKIs的敏感性；第20号外显子第790位密码子(核甘酸位置2669碱基替换)出现T-M转换突变是引起耐药的主要原因；第21号外显子的点突变主要是第858位密码子出现T-G转换，使该位点的亮氨酸转变为精氨酸，简称为L858R。
K-ras基因的突变80％-90％主要位于K-ras基因的第2号外显子的密码子12位和13位上，包括7种突变类型：G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C。
目前的突变检测方法包括：Sanger测序法、实时荧光定量PCR法、高通量测序方法等。
Sanger测序法，即Sanger(桑格)双脱氧链终止法，是通过聚合酶链式反应(PCR)加毛细管电泳分离，再对PCR产物最末端碱基所带的荧光信号进行分析，计算机自动分析得出位置及碱基，最终得到序列的方法。该方法步骤繁琐，试验周期长(一般需2-3天)，对操作人员技术水平要求高，因此难以在临床大面积推广。更为重要的是测序技术本身灵敏度不高，只能检测15％以上的突变。而肿瘤组织是一个异质性的组织，EGFR突变又是一种杂合性突变，即EGFR基因DNA双链中有一条发生突变，而这种突变在检测样本中的比例小于10％，测序方法根本就无法检出。
实时荧光定量PCR法是目前最广泛应用的方法之一，使用特殊设计的引物(或包括探针)对目标分子进行扩增，并使用荧光信号对扩增分子进行标记，随着反应的进行，荧光信号会随着目标分子的扩增而增加，荧光信号的增加与目标分子呈指数关系。通过对荧光信号的检测，对目标分子进行定量。实时荧光定量PCR技术相对与常规PCR以及Sanger测序，具有灵敏度高、特异性高、无污染、并且能够对单个突变或多个突变位点进行检测的优点，但实时荧光定量PCR的以下缺点也影响着其在临床上的应用：1)只能进行相对定量，检测过程中需要引入标准品制作标准曲线用以进行标定；2)稳定检出灵敏度只能在100-1000拷贝/体系，更低拷贝无法检出。
专利CN101608240B公开了一种用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针，还公开了含有该引物、探针的试剂盒，该试剂盒仅能检测出29种EGFR突变，需要20条引物和4条探针，每个反应孔都是多重PCR反应，结果也并不能对基因突变的量的多少进行判别。
专利CN104328164A主要涉及基于taqman探针、PNA探针与一种多重不对称PCR方法，该发明的引物设计特殊需要较宽泛的退火温度，反应体系化学成分需要优化来增加PCR扩增能力，通过与设定的Tm值0.5℃以上来判断是否突变，对结果的精确度要求较高。
专利CN103923973A公开了一种基于数字PCR平台检测EGFR第19号外显子缺失突变的方法，探针和引物设计的原理是：采用肽核酸(peptidenucleicacids,PNA)锁定野生型的检测位点区域，以两对引物对、一对探针分别检测未被PNA锁定的突变型和总DNA模板，从而计算出突变率，此专利要求PNA特异性好，反应试剂成本高。
专利CN103911427A公开了一种基于数字PCR平台检测EGFR20(T790M)，EGFR21(L858R)基因点突变的方法和试剂盒，检测内容非常有限，一对探针检测一种点突变类型，远远不能满足实际检测需要。使用扩增阻滞突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)，对突变靶序列进行PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，该方法存在缺陷：ARMS技术引物最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，所以这种方法存在假阳性的风险。
故如何简化引物和探针设计，简化反应条件的优化，如引物、靶DNA、TaqDNA聚合酶的浓度，避开多对引物的多重PCR，同时又尽可能满足某一区域范围内多种突变的检测。例如，EGFR第19号外显子中456-493区域内，多种碱基的替换、插入、缺失，导致该区域出现高达39种突变形式的情况。临床样本包括癌症组织、血浆、尿液、积液等，样本量极少，并且样本类型复杂，以上方法无法在一个反应中进行同一基因的多重突变位点检测，因此，需要一种适于在复杂样本、低起始量样本中进行同一基因的多种突变位点检测的，操作简便、成本低廉的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人类表皮生长因子受体(EGFR)基因和/或K-ras基因的突变的引物、探针，包含该引物和探针的试剂盒，以及一种基于数字PCR平台检测基因突变的装置。本发明的检测基因突变的方法，所需引物及探针数量少，优化过程简单，不仅可以检测EGFR基因相关突变，而且可以计算出突变率；此外，K-ras基因的7种常见突变类型的检测只需要1个反应孔，EGFR第18-21号外显子的32种常见突变只需要4个反应孔，整个操作过程简单，大大减少了临床检测成本及工作量。
为实现上述目的，本发明公开了以下几个方面的内容：
第一方面，本发明提供了用于检测人类EGFR基因第18-21号外显子突变的引物及探针，包括以下四组引物和探针或与其具有至少60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性的核苷酸序列：
(1)用于检测EGFR基因第18号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:1：5’-CCTTGTCTCTGTGTTCTTGT-3’；
下游引物SEQIDNO:2：5’-TGTGCCAGGGACCTTAC-3’；
目标探针SEQIDNO:3：5’-CCGGAGCCCAGCTCTTTGATCT-3’；
(2)用于检测EGFR基因第19号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:5：5’-TAAAATTCCCGTCGCTATCAA-3’；
下游引物SEQIDNO:6：5’-AAAGGTGGGCCTGAGGTTCA-3’；
目标探针SEQIDNO:7：5’-GTTCAGAGCCATGGACCC-3’；
(3)用于检测EGFR基因第20号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:9：5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；
下游引物SEQIDNO:10：5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’；
突变型探针SEQIDNO:11：5’-TGAGCCGCGTGATGA-3’；
野生型探针SEQIDNO:12：5’-TGAGCCGCATGATGA-3’；
(4)用于检测EGFR基因第21号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:13：5’-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3’；
下游引物SEQIDNO:14：5’-TTCTCTTCCGCACCCAGC-3’；
突变型探针SEQIDNO:15：5’-TTGGGCGGGCCAAACTGCTG-3’；
野生型探针SEQIDNO:16：5’-TTGGGCTGGCCAAACTGCTG-3’。
对于上述检测人类EGFR基因突变的引物及探针：
在具体的实施方案中，优选地，针对第(1)组引物及目标探针，使用序列如SEQIDNO:4：5’-CAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCC-3’所示的寡核苷酸为内参探针；优选地，针对第(2)组引物及目标探针，使用序列如SEQIDNO:8：5’-AGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG-3’所示的寡核苷酸为内参探针。
上述引物及探针是根据人类EGFR基因的第18、19、20和/或21号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列设计的，可以检测EGFR基因的第18、19、20和/或21号外显子的多种突变，例如常见的32种突变；
优选地，所述第18外显子突变为c.2156G>C或c.2155G>A替换突变；
优选地，所述第19外显子突变为在c.2235-2253之间出现的任一缺失/插入/替换突变；
优选地，所述第20外显子突变为c.2369C>T替换突变；
优选地，所述第21外显子突变为c.2573TG>GT、c.2573T>G或c.2582T>A替换突变。
所述上游引物与下游引物覆盖约50-200bp区域，包括可能发生突变的基因检测区域。其中针对第18、19号外显子的检测采用目标探针和内参探针同时检测；当所述基因检测区域内未发生突变时，所述目标探针与引物覆盖范围内的基因检测区域结合，所述目标探针为约13-29bp；当所述基因检测区域内发生了突变时，则所述目标探针不与引物覆盖范围内的基因检测区域结合；所述内参探针结合引物覆盖范围内的无突变的保守区域，为约13-29bp；通过计算未发生突变的基因的比例，来确定是否发生了基因突变以及发生基因突变的比例。其中第20、21号外显子的检测采用野生型探针和突变型探针同时检测；当所述基因检测区域内未发生突变时，所述野生型探针与引物覆盖范围内的基因检测区域结合；当所述基因检测区域内发生突变时，所述突变型探针与引物覆盖范围内的基因检测区域结合；通过计算结合的突变型探针与结合的野生型探针的比例，来确定发生突变的比例。
在具体实施方案中，为检测目的，所有探针均带有荧光基团和淬灭基团，所述目标探针与所述内参探针、野生型探针与突变型探针的荧光基团不同；
优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5和Cy3；
优选地，所述淬灭基团选自BQH1、MGB、TAMARA和BHQ2。
第二方面，本发明提供了用于检测K-ras基因突变的引物及探针，包括以下引物和探针或与其具有至少60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性的核苷酸序列：
上游引物SEQIDNO:17：5’-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’；
下游引物SEQIDNO:18：5’-AATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC-3’；
目标探针SEQIDNO:19：5’-TGCCTACGCCTCCAGCTCC-3’。
对于上述检测K-ras基因突变的引物及目标探针，在优选的具体实施方案中，使用序列如SEQIDNO:20：5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’所示的寡核苷酸为内参探针。
使用上述引物及探针，可以检测K-ras基因第2号外显子第12位和/或第13位密码子的突变，优选地，所述突变导致以下氨基酸突变类型中的任意一种或几种的组合：G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R或G12C。
所述上游引物与下游引物覆盖约50-200bp区域，其中包括可能发生突变的基因检测区域；当所述基因检测区域内未发生突变时，所述目标探针与引物覆盖范围内的基因检测区域结合，所述目标探针为约13-29bp；当所述基因检测区域内发生了突变时，则所述目标探针不与引物覆盖范围内的基因检测区域结合；所述内参探针则结合引物覆盖范围内的无突变的保守区域，为约13-29bp；通过计算未发生突变的基因的比例，来确定是否发生了基因突变以及发生基因突变的比例。
在具体实施方案中，为检测目的，所述目标探针和/或内参探针带有荧光基团和淬灭基团，所述目标探针与所述内参探针的荧光基团不同；
优选地，所述荧光基团选自FAM(6-羧基突光素，例如，来自上海生工)、VIC(例如，来自上海生工)、HEX(六氯-6-羧基突光素)、Cy5(例如，来自上海生工)和Cy3(例如，来自上海生工)；
优选地，所述淬灭基团选自BQH1(例如，来自上海生工)、MGB(例如，来自美国LifeTechnologies)、TAMARA(6-羧基四甲基若丹明)和BHQ2(例如，来自上海生工)。
上述用于检测人类EGFR基因或K-ras基因的突变的引物及探针的设计过程如下：在NCBI数据库，搜索得到基因碱基序列，采用软件oligo7进行引物及探针的设计，先在突变位点及上下游设计探针，在探针的一般原则下同时满足无二级结构Tm在64-68度之间的要求；软件设置引物退火温度52-60度之间，上下游引物扩增产物小于200bp，探针退火温度比引物高出5℃，在引物扩增片段内设计探针。所述引物及探针的设计示例如附图1所示。
为了进一步增加反应的特异性，优选在探针中间碱基再引入一个不匹配的错配碱基，从而增加探针与突变位点区域结合的特异性，
可选的，再增加一个反应孔，在反应中加入肽核酸(peptidenucleicacids,PNA)锁定野生型的检测位点区域,或加入特定的核酸内切酶，将野生型的模板进行酶切降解，都是减少野生型模板的干扰，增加突变型的灵敏度。
第三方面，本发明提供了一种用于检测人类EGFR和/或K-ras基因突变的试剂盒，其包括如第一方面所述的引物及探针，和/或如第二方面所述的引物及探针。
根据本发明的试剂盒所能检测的常见基因突变类型包括：EGFR基因的突变：18号外显子突变是指18号外显子p.G719A/S(碱基突变为c.2156G>C或c.2155G>A)；19号外显子突变是指EGFR络氨酸激酶区19号外显子c.2235-2253之间出现任一缺失/插入/替换突变；20号外显子突变是指EGFR络氨酸激酶区20号外显子c.2369C>T(p.T790M)替换突变；21号外显子突变是指EGFR络氨酸激酶区21号外显子c.2573TG>GT或c.2573T>G(p.L858R)、c.2582T>A(p.L861Q)突变。KRAS基因突变是：2号外显子的密码子12位和13位上的突变，包括7种突变类型：G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C。可以使用本发明试剂盒检测的基因突变位点信息见以下表1。
表1
以上为常见的突变类型，若这些位点出现新的突变，理论上，采用本试剂盒进行检测的结果可能出现弱阳性，需要用其他的方法进一步验证。
在优选的具体实施方案中，本发明试剂盒的引物序列信息见以下表2。
表2
此套引物扩增片段都小于200bp，适用于血浆游离DNA、石蜡包埋组织或其他小片段DNA样本的扩增。
根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒的待检样品可以为从多种途径获取的临床样本中提取获得的DNA，所述临床样本选自手术切除组织，石蜡包埋组织切片，穿刺组织，胸水，全血、血浆和血清。
在优选的具体实施方案中，本发明试剂盒的探针序列信息见以下表3。
表3
在优选的具体实施方案中，本发明试剂盒的试剂组成见以下表4。
表4
根据本发明的具体实施方案，无模板对照是无DNA的超纯水；阴性质控品是检测位点为野生型的DNA；突变阳性质控品是携带目的基因区域测序结果显示检测位点突变型的质粒。阳性质控品(STD)由突变位点为阳性变异的突变序列(由北京六合华大基因科技有限公司合成)连接入质粒载体，然后转入大肠杆菌后，经提取纯化，然后稀释定量到103拷贝/微升，将32种稀释后的阳性质粒等比混合，即为试剂盒中的阳性质控品。
根据本发明的具体实施方案，所述试剂盒用于判定检测有效性的标准是：每次都检测阴性质控品，野生型质控品和突变型质控品，检测结果阴性质控品和野生型质控品均为阴性且突变型质控品为阳性时，实验才有效。
本发明所述的突变检测试剂盒，用来检测基因组特定范围内的突变，既可以进行定性分析，灵敏度可达0.1％(即，若一个反应孔稳定产生约10000个反应检测点，最低可检测到10个反应点为突变，则最低突变率即灵敏度为10/10000＝0.1％)，又可以进行定量分析，对低起始量(DNA总量低至0.1ng)的样本，能够进行稳定检出。
第四方面，本发明提供了一种检测人类EGFR基因和/或K-ras基因突变的方法，其包括：
(1)提供如第一方面所述的引物及探针，和/或如第二方面所述的引物及探针；
(2)处理待测样品并提取模板；优选地，所述待测样品为血浆游离DNA、石蜡包埋组织或其他小片段DNA样本；
(3)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系；
(4)用步骤(1)提供的引物扩增待测的基因序列，用步骤(1)提供的探针与所扩增的产物杂交，并检测反应体系的荧光基团的荧光信号；
(5)根据目标探针与内参探针、野生型探针与突变型探针的荧光信号的强度和比例，判断基因突变的存在和/或计算突变率。
在本方面的具体实施方案中，适宜的PCR反应体系包括酶，dNTP，PCR缓冲液，引物,探针等；从待测样本中提取DNA，加到PCR反应体系中；然后，进行PCR反应程序和荧光信号检测，根据荧光信号结果分析，判断样本是否存在突变以及突变的比例。
例如，待测样本中含有X个野生型基因目标分子，Y个突变型基因目标分子。经过反应及检测后，所述EGFR18、EGFR19、KRAS的结果采用这样的方式进行分析。
，则野生型基因检测数目为X＝A，突变型基因检测数目为Y＝B，其突变频率为Y/(Y+X)＝B/(A+B)。
EGFR20、EGFR21检测结果采用如下方式分析：
野生型基因检测数目为X＝B，突变型基因检测数目为Y＝C，其突变频率为Y/(Y+X)＝C/(B+C)。其中A为荧光背景值，通过设置cutoff值去除影响。
在上述方法的步骤(3)中，优选的检测平台为数字PCR平台，反应试剂buffer以配套试剂为主，如BioRad公司的微滴式数字PCR系统，可生成10000～20000个微反应液滴。结果可用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，对微滴的荧光信号逐个分析统计。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。根据阴性反应的比例对样品中的靶标分子数目进行绝对计数，而不必参照标准品或内源性对照。高灵敏度和所需样本量少，大大满足了临床珍贵样本如穿刺样本、胸腹水、外周血中靶标序列的微量检测的需求。
对于上述检测方法，作为优选，所述PCR反应体系中，DNA模板含量为0.3ng-30ng，优选为1-6ng；PCR引物包括上游引物和下游引物，含量分别为500-700nM，优选为600nM；使用TaqMan探针进行检测，探针(包括目标探针和内参探针、野生型探针和突变型探针)含量分别为200-500nM，优选为250nM。
对于上述检测方法，作为优选，所述PCR扩增的条件为：92-96℃预变性3-15分钟；92-96℃变性5-60秒，54-62℃延伸30-90秒，共进行20-40个循环，2-10℃终止反应。
进一步优选地，所述PCR扩增的条件为：93.5-95℃预变性5-10分钟；93.5-95℃变性5-30秒，54-62℃延伸30-90秒，共进行32-40个循环，6-10℃终止反应。
更进一步优选地，所述PCR扩增条件为，94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃延伸60秒，共进行40个循环，4℃终止反应。
在一个优选的具体实施方案中，本发明的检测人类EGFR基因和/或K-ras基因突变的方法包括如下步骤：
1)样本提取：采用常规方法提取样本DNA，并进行定量；
2)反应液的配制
3)运行程序及结果分析
PCR扩增条件为，94℃预变性10分钟；94℃变性30秒，56℃延伸60秒，共进行40个循环，4℃终止反应。
结果分析，采用QuantaSoft(Biorad)软件打开结果文件夹中“.qlp”后缀文档，首先分析无模板对照(NTC)和阳性质控品(STD)，只有当NTC为阴性和STD为阳性才考虑分析，其他情况考虑有污染或反应液配置有问题，需要重新检测。具体结果分析流程如附图2所示。
上述检测基因突变的方法可以在集成装置中完成，因此，在本发明的另一个方面中，还提供了检测人类EGFR基因和/或K-ras基因突变的装置，其包括：PCR混合液制备单元，数字PCR反应单元和信息处理单元。
在具体的实施方案中，所述PCR混合液制备单元配置用于将待测DNA模板，针对目标区域的上、下游PCR扩增引物，检测探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
优选地，所述上、下游PCR扩增引物覆盖约50-200bp区域，包括可能发生突变的基因检测区域，所述检测探针包括目标探针和/或内参探针，或者包括野生型探针和/或突变型探针，所述检测探针为13-29bp；
进一步优选地，当所述基因检测区域内未发生突变时，所述目标探针与引物覆盖范围内的基因检测区域结合，当所述基因检测区域内发生了突变时，则所述目标探针不与引物覆盖范围内的基因检测区域结合，所述内参探针结合引物覆盖范围内的无突变的保守区域；
优选地，所述引物及探针为如权利要求1-4任一项所述的引物及探针，或者如权利要求5-8任一项所述的引物及探针；
优选地，所述PCR混合液的每个反应体系包含：0.3-30ng、优选1-6ng的DNA模板，含量分别为500～700nM、优选为600nM的上、下游PCR扩增引物以及含量为200～500nM、优选为250nM的探针；
优选地，所述DNA模板可以从临床样本中提取获得，所述临床样本选自手术切除组织，石蜡包埋组织切片，穿刺组织，胸水，全血、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、血浆和血清。
在具体的实施方案中，所述数字PCR反应单元配置用于将所述PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：92～96℃预变性3～15分钟；92～96℃变性5～50秒，54～62℃延伸30-90秒，共进行20～40个循环，2～10℃终止反应；
进一步优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：93.5～95℃预变性5-10分钟；93.5～95℃变性5～15秒，54～62℃延伸30～90秒，共进行32～40个循环，6～10℃终止反应；
更进一步优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性10分钟；94℃变性15秒，56℃延伸30秒，共进行40个循环，4℃终止反应；
优选地，将所述PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将所述PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴。
在具体的实施方案中，所述信息处理单元配置用于收集信号并进行结果分析；
优选地，所述收集信号并进行结果分析包括：对PCR扩增产物的荧光信号进行收集，根据荧光信号类型，判断待测样品中是否含有发生基因突变的DNA模板，和/或确定发生基因突变的DNA模板的数量和含量；进一步优选地，用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，计算样品中发生基因突变的DNA拷贝数、含量和比例。
有益效果
与现有技术比较，本发明的优点在于：
1)一个反应仅包含一对引物一对探针，即可检测基因位点多种突变，该试剂盒5个反应孔即可检测EGFR\KRAS基因常见几十种突变，且无需复杂多重PCR体系，引物和探针优化简单；
2)操作方便，流程简单，只需2个小时即可得到检测结果，满足临床快速检测要求；
3)灵敏度：所需模板量微量，利于如血浆的循环肿瘤DNA、胸腹水的肿瘤DNA等微量样本的检测；同时对于目标分子检测灵敏度为0.1％，无需使用标准品，即可完成目标突变分子的绝对定量，结果不受标准品影响。
附图说明
图1显示本发明所述引物及探针的示例性设计；其中，上图显示针对EGFR基因第18、19号外显子及K-ras基因的突变的引物及探针设计，下图显示针对EGFR基因第20、21号外显子突变的引物及探针设计。
图2显示本发明的基因突变检测方法的结果分析流程。
图3显示实施例2中的模拟样本的检测结果。
图4显示实施例3中的石蜡包埋组织标准品的检测结果。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：本发明试剂盒的组成及使用方法
本发明试剂盒的组成见上文表4，其使用方法也阐述于发明内容中，详细步骤见以下实施例。
实施例2：模拟样本检测
(1)准备样品：将含有野生型EGFR基因的DNA与阳性质控品以一定比例混合。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。
本实施例中样本A、B、C是采用不同量上述阳性质粒与等量野生型DNA混合得到的，未混合前采用数字PCR仪分别对阳性质粒与野生型DNA进行绝对定量，得到理论突变率。
(2)室温融解PCR引物及对应TaqMan探针。
(3)按照试剂盒说明书配比制备PCR反应液。
(4)将配制好的20μL数字PCR混合液加入到8道的液滴制作板内，然后加入60μL液滴制作油到制作板用于制备PCR微反应液滴(QX200微滴发生器)。
(5)将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000-20000个。
(6)将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应:94℃预变性10分钟；94℃变性10秒，56℃延伸30秒，共进行40个循环，4℃终止反应。
(7)PCR扩增反应后，将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪QX200微滴荧光信号收集系统中进行信号收集，检测FAM和VIC的荧光信号。检测结果如图3所示。根据设计的探针类型、两种荧光信号的点数及比例判断样本是否含有突变基因、计算突变率等，具体结果如下：
本实施例中样本A、B、C是采用不同量上述阳性质粒与等量野生型DNA混合得到，未混合前采用数字PCR仪分别对阳性质粒与野生型DNA绝对定量，得到理论突变率。比较两者突变率，结果显示，误差一般在0.3％-5％，不超过5％。以上述方法，可以检测位于EGFR外显子19的c.2235-c.2253上任意缺失突变，检出限达到0.5％。
实施例3：石蜡包埋标准品检测
根据上述实施1使用方式，取样本为标准品QuantitativeMultiplexFFPEReferenceStandard(购于HorizonDiagnostics公司)说明书中标明含有2％的EGFR19c.2236_2250、15％的KRASc.38G>A、6％的KRASc.35G>A。检测结果如图4所示。对检测结果的分析同实施例1，突变率＝1-(Number野生型/Number总分子)＝1-(NumberFAM(+)VIC(+)/NumberVIC(+))，具体结果导出，野生型信号数与总信号数如下：
定量分析的结果显示，误差一般在0.3％-2.5％，不超过5％。以上述方法，可以检测EGFR外显子19上c.2235-c.2253缺失突变、KRAS基因外显子2上c.35、c.34、c.38多种类型点突变，检出限到达2％。
实施例4：临床样本检测
收集临床病人组织样本，送于深圳华大科技有限公司，采用二代测序仪Iontorrent平台测序，结果阳性样本采用本试剂盒检测，两者结果检测的突变率列于下表：
根据上述检测结果可知，EGFR基因的突变检测，本试剂盒的结果与Iontorrent测序结果100％一致，且每个样本的突变率相近。同时EGFR的EX19多种突变可以一管反应一并检出。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品、使用方法及用途，但本发明并不局限于上述详细的产品、使用方法及效果，即不意味着本发明必须依赖上述详细的产品、使用方法及用途才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (13)

1.用于检测人类EGFR基因第18-21号外显子突变的引物及探针，包括以下四组引物和探针或与其具有至少60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性的核苷酸序列：
(1)用于检测EGFR基因第18号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:1：5’-CCTTGTCTCTGTGTTCTTGT-3’；
下游引物SEQIDNO:2：5’-TGTGCCAGGGACCTTAC-3’；
目标探针SEQIDNO:3：5’-CCGGAGCCCAGCTCTTTGATCT-3’；
(2)用于检测EGFR基因第19号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:5：5’-TAAAATTCCCGTCGCTATCAA-3’；
下游引物SEQIDNO:6：5’-AAAGGTGGGCCTGAGGTTCA-3’；
目标探针SEQIDNO:7：5’-GTTCAGAGCCATGGACCC-3’；
(3)用于检测EGFR基因第20号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:9：5’-AGGCAGCCGAAGGGCA-3’；
下游引物SEQIDNO:10：5’-CCTCACCTCCACCGTGCA-3’；
突变型探针SEQIDNO:11：5’-TGAGCCGCGTGATGA-3’；
野生型探针SEQIDNO:12：5’-TGAGCCGCATGATGA-3’；
(4)用于检测EGFR基因第21号外显子突变的引物及探针：
上游引物SEQIDNO:13：5’-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3’；
下游引物SEQIDNO:14：5’-TTCTCTTCCGCACCCAGC-3’；
突变型探针SEQIDNO:15：5’-TTGGGCGGGCCAAACTGCTG-3’；
野生型探针SEQIDNO:16：5’-TTGGGCTGGCCAAACTGCTG-3’。
2.根据权利要求1所述的引物及探针，其特征在于，针对第(1)组引物及目标探针，使用序列如SEQIDNO:4：5’-CAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCC-3’所示的寡核苷酸为内参探针；
优选地，针对第(2)组引物及目标探针，使用序列如SEQIDNO:8：5’-AGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG-3’所示的寡核苷酸为内参探针。
3.根据权利要求1或2所述的引物及探针，其特征在于，所述第18外显子突变为c.2156G>C或c.2155G>A替换突变；
优选地，所述第19外显子突变为在c.2235-2253之间出现的任一缺失/插入/替换突变；
优选地，所述第20外显子突变为c.2369C>T替换突变；
优选地，所述第21外显子突变为c.2573TG>GT、c.2573T>G或c.2582T>A替换突变。
4.根据权利要求2-3任一项所述的引物及探针，其特征在于，所有探针均带有荧光基团和淬灭基团，所述目标探针与所述内参探针、所述野生型探针与所述突变型探针的荧光基团不同；
优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5和Cy3；
优选地，所述淬灭基团选自BQH1、MGB、TAMARA和BHQ2。
5.用于检测K-ras基因突变的引物及探针，包括以下引物和探针或与其具有至少60％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性的核苷酸序列：
上游引物SEQIDNO:17：5’-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3’；
下游引物SEQIDNO:18：5’-AATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC-3’；
目标探针SEQIDNO:19：5’-TGCCTACGCCTCCAGCTCC-3’。
6.根据权利要求5所述的引物及探针，其特征在于，其使用序列如SEQIDNO:20：5’-TAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’所示的寡核苷酸为内参探针。
7.根据权利要求5或6所述的引物及探针，其用以检测K-ras基因第2号外显子第12位和/或第13位密码子的突变，优选地，所述突变导致以下氨基酸突变类型中的任意一种或几种的组合：G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R或G12C。
8.根据权利要求5-7任一项所述的引物及探针，其特征在于，所述目标探针和/或内参探针带有荧光基团和淬灭基团，所述目标探针与所述内参探针的荧光基团不同；
优选地，所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、Cy5和Cy3；
优选地，所述淬灭基团选自BQH1、MGB、TAMARA和BHQ2。
9.一种用于检测人类EGFR和/或K-ras基因突变的试剂盒，其包括如权利要求1-4任一项所述的引物及探针，和/或如权利要求5-8任一项所述的引物及探针。
10.一种检测基因突变的装置，其包括：PCR混合液制备单元，数字PCR反应单元和信息处理单元。
11.根据权利要求10所述的装置，其特征在于，所述PCR混合液制备单元配置用于将待测DNA模板，针对目标区域的上、下游PCR扩增引物，检测探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
优选地，所述上、下游PCR扩增引物覆盖约50-200bp区域，包括可能发生突变的基因检测区域，所述检测探针包括目标探针和/或内参探针，或者包括野生型探针和/或突变型探针，所述检测探针为13-29bp；
进一步优选地，当所述基因检测区域内未发生突变时，所述目标探针与引物覆盖范围内的基因检测区域结合，当所述基因检测区域内发生了突变时，则所述目标探针不与引物覆盖范围内的基因检测区域结合，所述内参探针结合引物覆盖范围内的无突变的保守区域；
优选地，所述引物及探针为如权利要求1-4任一项所述的引物及探针，或者如权利要求5-8任一项所述的引物及探针；
优选地，所述PCR混合液的每个反应体系包含：0.3-30ng、优选1-6ng的DNA模板，含量分别为500～700nM、优选为600nM的上、下游PCR扩增引物以及含量为200～500nM、优选为250nM的探针；
优选地，所述DNA模板可以从临床样本中提取获得，所述临床样本选自手术切除组织，石蜡包埋组织切片，穿刺组织，胸水，全血、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、血浆和血清。
12.根据权利要求10或11所述的装置，其特征在于，所述数字PCR反应单元配置用于将所述PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：92～96℃预变性3～15分钟；92～96℃变性5～50秒，54～62℃延伸30-90秒，共进行20～40个循环，2～10℃终止反应；
进一步优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：93.5～95℃预变性5-10分钟；93.5～95℃变性5～15秒，54～62℃延伸30～90秒，共进行32～40个循环，6～10℃终止反应；
更进一步优选地，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性10分钟；94℃变性15秒，56℃延伸30秒，共进行40个循环，4℃终止反应；
优选地，将所述PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将所述PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴。
13.根据权利要求10-12任一项所述的装置，其特征在于，所述信息处理单元配置用于收集信号并进行结果分析；
优选地，所述收集信号并进行结果分析包括：对PCR扩增产物的荧光信号进行收集，根据荧光信号类型，判断待测样品中是否含有发生基因突变的DNA模板，和/或确定发生基因突变的DNA模板的数量和含量；进一步优选地，用QuantaSoft(Biorad)软件进行数据分析，计算样品中发生基因突变的DNA拷贝数、含量和比例。
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