CN103923975A - 一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测egfr基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体为检测人表皮生长因子受体基因EGFR外显子19缺失突变的PCR引物、TaqMan探针、PNA探针及试剂盒和检测方法；以数字PCR为平台，在反应体系中加入与野生型非突变模板序列互补的PNA探针，利用PNA探针的阻遏作用，使得只有发生了EGFR外显子19缺失突变的样本才能被扩增；并且利用TaqMan探针作为荧光定量标记，根据荧光检测判断样品中是否存在突变的模板及数量和比例。

Description

一种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域和核酸检测领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子19缺失突变的方法。
背景技术
随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因突变可以给医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶区域发生突变，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率达到80%以上。由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。
EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21～24编码C-Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21；非小细胞肺癌EGFR突变90%以上发生为exon19的缺失突变及exon21的L858R点突变。
尤其是人表皮生长因子受体（EGFR）基因外显子19发生突变的非小细胞肺癌患者，对该类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。外显子19缺失突变占约46%，主要是发生9、12、15、18、24个核苷酸的框内缺失突变。因此EGFR外显子exon19缺失突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger测序法）和ARMS法。现分别简介于下：
Sanger测序法，即Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%～20%以上的突变。
ARMS法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory MutationSystem，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展。
ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增野生型或突变型基因。
上述现有技术存在以下问题：
1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测。
2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。
3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。
目前的检测一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法，用于癌症患者，特别是肺癌患者的靶向用药指导、高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因外显子19缺失突变的试剂盒及方法，为个体化用药提供参考。
肽核酸（Peptide Nucleic Acid,PNA）是一类以中性酰胺键（假肽键）代替DNA中的糖-磷酸二酯键作为骨架的脱氧核糖核酸类似物，保留其中的碱基部位。PNA的特殊结构，使之可以不被蛋白酶或者核酸酶降解，有很高的稳定性，是一种非离子、非手性、不易被水解和酶切的分子。
PNA与DNA模板结合能力高于普通寡核苷酸，可作为阻遏物置于引物前面，并与PCR引物部分重合；若PNA与模板正确配对时可阻止聚合酶链反应，野生型模板无法扩增；若发生错配（例如模板为发生突变的DNA），则结合能力迅速下降，失去阻遏作用。此时可用来扩增突变模板。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量方法，基于单分子PCR方法来进行计数，主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。
本发明以数字PCR为平台，在反应体系中加入与野生型非突变模板序列互补的PNA探针，利用PNA探针的阻遏作用，使得只有发生了EGFR外显子19缺失突变的样本才能被扩增；并且利用TaqMan探针作为荧光定量标记，根据荧光检测判断样品中是否存在突变的模板。
本发明技术方案如下。
一种检测EGFR外显子19缺失突变的PCR扩增引物，为反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物，可扩增含有EGFR外显子19上c.2230-c.2260序列的片段；正向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.1～5）中的一种：
F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’，
F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’；
反向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.6～10）中的一种；
R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，
R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，
R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，
R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，
R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
优选的，正向PCR扩增引物为SEQ ID No.1～5之一的核苷酸序列；反向PCR扩增引物为SEQ ID No.6～10之一的核苷酸序列；
更优选的，PCR扩增引物选自以下各组序列之一：
（1）正向：F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
反向R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，或者，
（2）正向：F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’，
反向R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，或者，
（3）正向：F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
反向R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，或者，
（4）正向：F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
反向R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，或者，
（5）正向：F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’，
反向R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
一种检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，能够与缺失位点下游的DNA模板结合，是连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其中荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、Cy5（美国Life Technologies）、Cy3（美国Life Technologies）或VIC（美国Life Technologies），猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1（美国Life Technologies）、BHQ2（美国LifeTechnologies）或MGB（美国Life Technologies）；标记TaqMan探针核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种（SEQ ID No.11～15）：
P1:5’-ACTCACATCGAGGATTTCC-3’，
P2:5’-TCACATCGAGGATTTCCTT-3’，
P3:5’-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3’，
P4:5’-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3’，
P5:5’-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3’。
优选的，这种检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针的核苷酸部分是SEQ ID No.11～15核苷酸序列中的一种。
一种检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针，与野生型未突变的EGFR外显子19的DNA互补，含有以下核苷酸序列之一（SEQ ID No.16～20）：
PNA1:5’-GAATTAAGAGAAGCA-3’，
PNA2:5’-ATTAAGAGAAGCAAC-3’，
PNA3:5’-TAAGAGAAGCAACAT-3’，
PNA4:5’-AGAGAAGCAACATCT-3’，
PNA5:5’-AGAAGCAACATCTCC-3’。
优选的，这种检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针核苷酸是SEQ IDNo.16～20序列中的一种。
上述的标记TaqMan探针、PNA探针和PCR扩增引物可以用于制备试剂盒，基于数字PCR平台用来检测EGFR外显子19缺失突变，为靶向治疗筛选患者提供参考，也可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。
一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，含有以下物质中的至少一种：
（1）上述的PCR扩增引物，
（2）上述的TaqMan探针，
（3）上述的PNA探针。
上述试剂盒中还包括正向和反向的质控PCR引物和质控TaqMan探针；
所述的质控PCR引物用于扩增含EGFR基因DNA模板上保守序列（优选为EGFR外显子2）；质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合。
优选的，所述正向和反向的质控PCR引物及质控TaqMan探针的核苷酸部分选自以下各组序列中的一组：
（1）正向引物：CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC（SEQ ID No.21），
反向引物：CR1:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA（SEQ ID No.23），
质控TaqMan探针的核苷酸部分：CP1:TCACGCAGTTGGGCAC（SEQ IDNo.25）；或者，
（2）正向引物：CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC（SEQ ID No.22），
反向引物：CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT（SEQ ID No.24），
质控TaqMan探针的核苷酸部分：CP2:ACGCAGTTGGGCACTT（SEQID No.26）。
这种试剂盒可以基于数字PCR平台检测位于EGFR外显子19上c.2230-c.2260范围内的若干个碱基（通常为15～19个碱基）的缺失突变。
本发明检测EGFR外显子19缺失突变的方法，步骤包括：
1.将待测的DNA模板、正向和反向的PCR扩增引物、标记TaqMan探针、PNA探针、正向和反向的质控PCR引物、质控TaqMan探针与PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
正向和反向的PCR扩增引物可用于扩增含有EGFR外显子19上c.2230-c.2260序列的片段；
正向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列（SEQ ID No.1～5）之一：
F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’，
F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’；
反向PCR扩增引物含有以下核苷酸序列之一（SEQ ID No.6～10）：
R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，
R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，
R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，
R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，
R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’；
优选的，正向PCR扩增引物为SEQ ID No.1～5之一的核苷酸序列；反向PCR扩增引物为SEQ ID No.6～10之一的核苷酸序列；
更优选的，正向和反向PCR扩增引物选自以下各组序列之一：
（1）正向：F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
反向R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，或者，
（2）正向：F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’，
反向R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，或者，
（3）正向：F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
反向R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，或者，
（4）正向：F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
反向R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，或者，
（5）正向：F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’，
反向R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
标记TaqMan探针能够与缺失位点下游的DNA模板结合，为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其中核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种（SEQ IDNo.11～15）：
P1:5’-ACTCACATCGAGGATTTCC-3’，
P2:5’-TCACATCGAGGATTTCCTT-3’，
P3:5’-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3’，
P4:5’-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3’，
P5:5’-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3’。
优选的，TaqMan探针上的核苷酸部分为SEQ ID No.11～15核苷酸序列中的一种。TaqMan探针上的荧光基团选自6-羧基荧光素（FAM）、六氯-6-羧基荧光素（HEX）、Cy5、Cy3、VIC，荧光猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明（TAMARA）、BHQ1、BHQ2或MGB。
PNA探针与野生型未突变的EGFR外显子19的DNA互补，含有以下核苷酸序列之一（SEQ ID No.16～20）：
PNA1:5’-GAATTAAGAGAAGCA-3’
PNA2:5’-ATTAAGAGAAGCAAC-3’
PNA3:5’-TAAGAGAAGCAACAT-3’
PNA4:5’-AGAGAAGCAACATCT-3’
PNA5:5’-AGAAGCAACATCTCC-3’。
优选的，PNA探针为SEQ ID.No.16～20之一的核苷酸。
所述的正向和反向质控PCR引物用于扩增含EGFR外显子19的DNA模板上保守序列（优选为EGFR外显子2）；质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合。
所述的质控PCR引物用于扩增EGFR外显子19所在DNA模板上的保守序列，优选为，扩增EGFR外显子2；
所述的质控PCR引物及质控TaqMan探针的核苷酸部分选自以下各组序列中的一组：
（1）正向引物：CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC（SEQ ID No.21），
反向引物：CR1:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA（SEQ ID No.23），
质控TaqMan探针的核苷酸部分：CP1:TCACGCAGTTGGGCAC（SEQ IDNo.25）；或者，
（2）正向引物：CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC（SEQ ID No.22），
反向引物：CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT（SEQ ID No.24），
质控TaqMan探针的核苷酸部分：CP2:ACGCAGTTGGGCACTT（SEQID No.26）。
上述引物和探针是针对EGFR外显子19缺失设计优化的，尤其是针对数字PCR平台的检测。在数字PCR混合液中，待测样品的DNA模板含量为0.25～1ng/μL（优选为0.4～0.6ng/μL），正向和反向PCR扩增引物含量分别为500～700nM，标记TaqMan探针以及PNA探针含量分别为200～400nM；正向和反向质控PCR引物含量分别为500～700nM，质控TaqMan探针含量为200～400nM。
更优选的，数字PCR混合液中，待测样品的DNA模板的含量为0.5ng/μL，正向和反向PCR引物含量分别为600nM，标记TaqMan探针以及PNA探针含量分别为300nM，正向和反向质控PCR引物含量分别为600nM，质控TaqMan探针含量为300nM。
2.数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应，条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应；
优选的PCR扩增条件为：93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30～35个循环，6～10℃终止反应。
更优选的PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
优选的，数字PCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为，将数字PCR混合液加入微滴发生器，生成10000～20000个微反应液滴。
3.收集信号并进行结果判断：对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有EGFR外显子19缺失突变的DNA模板，还可确定其中EGFR基因外显子19缺失突变的DNA模板数量和含量。
可用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，计算样品中发生突变的拷贝数和含量，确定突变DNA样本的比例。
由于质控PCR引物的作用，PCR微反应液滴中只要含有样品DNA模板，不论是否发生缺失突变，都会发生扩增反应，并且结合了质控TaqMan探针，因此会有荧光信号。发生了缺失突变的DNA模板，加入PCR引物扩增后，还结合了标记TaqMan探针。质控与标记TaqMan探针的荧光基团类型不同，因此根据不同的荧光信号可以分辨出样品中是否含有EGFR基因外显子19缺失突变的DNA模板。再根据发生了突变的荧光信号数量以及总的荧光信号数量，可确定EGFR基因外显子19缺失突变的DNA模板含量，进行定量分析。
通过上述方法，可以检测位于EGFR外显子19上c.2230-c.2260范围内的10～19个碱基的缺失突变。
与现有技术比较，本发明的优点在于：
1.结果判读方式：以前的技术方法结果的判读需要人工参与，肉眼依据相关图形作出最后的判断，这种判读的方式严重依赖经验，速度慢且很容易产生假阳性和假阴性的判读结果。我们的技术方式给出的是数据信息，可以借助软件完全自动化的进行结果判读，从而加快了数据分析的速度，也减少了产生假阴性和假阳性判读的可能。
2.结果描述的方式：以前的技术方式对基因变异的描述是定性的方式，也就是说，只是描述某个特异的基因变异是否存在于检测样本。本技术方法对基因变异的描述是绝对定量的方式，可以给出样本所携带某种特异基因变异DNA的绝对数量和比例。而且准确率高，即使在突变样本含量较低的情况下，定量分析的误差也很小。
3.检测灵敏度（数值越小灵敏度越好）：以前技术方法的灵敏度一般在1％－50％之间，而我们提出的技术方法对基因变异的检测灵敏度提升非常明显，为1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中检测出极其微量的携带基因变异的DNA。
附图说明
图1为实施例1中，不同含量突变样本的荧光检测结果。
具体实施方式
实施例1
（1）准备待测DNA样品：含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外显子19缺失的突变阳性DNA以及野生型与突变DNA混合样本（其中突变体与野生型的含量比分别为1/100、1/1000、1/2500）。DNA来源可以是血清、血浆、外周血、口腔黏膜、胸腔积液、体液或者组织等。突变DNA来源于携带EGFR19突变的阳性细胞系。其中EGFR19外显子上c.2238－c.2255位的片段缺失突变。
（2）室温融解用于检测EGFR外显子19缺失的PCR扩增引物及对应的标记TaqMan探针和PNA探针，融解用于扩增EGFR外显子2的正向和反向质控PCR引物及质控TaqMan探针。
正向和反向PCR扩增引物的序列为：
F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’
R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’
标记TaqMan探针的序列包括荧光基团、核苷酸部分及猝灭基团，荧光基团和猝灭基团分别为FAM和MGB，核苷酸部分如SEQ ID No.11所示，标记TaqMan探针为：P1:FAM–ACTCACATCGAGGATTTCC-MGB。
PNA的序列如SEQ ID No.16所示，PNA1:5’-GAATTAAGAGAAGCA-3’。
正向和反向质控PCR引物的序列为：
CF2:5’-GCCAAGGCACGAGTAACAAGC-3’
CR2:5’-CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT-3’
质控TaqMan探针的荧光基团和猝灭基团分别为VIC和MGB，核苷酸部分如SEQ ID No.26所示，质控TaqMan探针为：
CP2:VIC-ACGCAGTTGGGCACTT–MGB。
（3）按照以下配比制备PCR反应液：2×数字PCR预混液（Biorad，#186-3022）与PCR扩增引物和质控PCR引物（600nM）、标记和质控TaqMan探针（300nM）以及PNA探针（300nM）与待检测DNA（10ng）配制成数字PCR混合液，用双蒸水补足至终体积为20μL。配制的数字PCR混合液中，正向和反向PCR扩增引物含量分别为600nM、标记TaqMan探针含量为300nM，PNA探针含量300nM；正向和反向质控PCR引物含量分别为600nM，质控TaqMan探针含量为300nM。
（4）配制好的20μL数字PCR混合液加入到8-道的液滴制作板内，然后加入60μL液滴制作油到制作板，再放入QX200微滴发生器中，用于制备PCR微反应液滴。
（5）将制备好的PCR微反应液滴转移至96孔反应板，并用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。
（6）将96孔PCR板放入PCR仪按照下面条件进行扩增反应：
94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
（7）PCR扩增反应后将PCR反应板放置于PCR微反应液滴信号读取仪（QX200微滴荧光信号收集系统）中进行信号收集，结果如图1。用QuantaSoft（Biorad）软件进行数据分析，得出样本中突变DNA的绝对含量以及相对野生型DNA的比例。
通过上述步骤检测，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变。
含有突变型DNA模板的微反应液滴中，同时出现FAM和VIC荧光信号，记为一个信号数；含未发生突变的野生型DNA模板的微反应液滴中，仅出现VIC荧光信号。
定量检测结果，突变型DNA模板含量不同的样本中，突变阳性信号数（即FAM信号数）与总信号数即总微反应液滴的数量比例如下：
1/1样品    6477/13028  计算值突变/野生=0.989/1，误差1.2%
1/100样品  186/18700   计算值突变/野生=0.01/1，误差0.2%
1/1000样品 23/19854    计算值突变/野生=0.00116/1，误差16%
1/2500样品 11/19928    计算值突变/野生=0.00055/1，误差37%
突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差低于2%。
选用以下各组之一的正向和反向PCR扩增引物时，按上述步骤检测，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变，且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量检测误差低于2%：
（1）正向F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’
反向R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’
（2）正向F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’
反向R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’
（3）正向F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’
反向R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’
（4）正向F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’
反向R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
改用以下序列之一的PNA探针时（SEQ ID No.17～20），按上述步骤检测，效果相同，在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变：
（1）PNA2:5’-ATTAAGAGAAGCAAC-3’
（2）PNA3:5’-TAAGAGAAGCAACAT-3’
（3）PNA4:5’-AGAGAAGCAACATCT-3’
（4）PNA5:5’-AGAAGCAACATCTCC-3’。
当所使用的标记TaqMan探针的核苷酸部分改用以下序列之一（SEQ IDNo.12～16）时，效果相同。在突变样本含量1/2500的情况下也能检出突变：
（1）P2:5’-TCACATCGAGGATTTCCTT-3’
（2）P3:5’-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3’
（3）P4:5’-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3’
（4）P5:5’-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3’。
通过上述方法，可以检测EGFR19外显子上c.2238－c.2255位缺失突变，检出限达到1/2500。
将突变型的DNA样品换为在EGFR19外显子上c2238－c.2250位片段缺失突变的DNA，用上述方法检测，检出限也可达到1/2500，且突变型DNA模板与野生型DNA模板比例为1/1～1/100时，定量误差低于5%。
正向和反向的质控PCR引物，以及质控TaqMan探针可改用以下序列，效果相同。
正向质控PCR引物CF1:5’-GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC-3’
反向质控PCR引物CR1:5’-TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA-3’
质控TaqMan探针CP1VIC-TCACGCAGTTGGGCAC-MGB。
对照例
一、使用不同PCR引物、PNA探针或者TaqMan探针
1、按照实施例1的方法，区别在于使用的PCR扩增引物不同，是按照荧光定量PCR技术设计的正反向引物。
正向和反向PCR扩增引物的序列分别为：
F1’:5’-GGGACTCTGGATCCCAGAAGGTG-3’
R1’:5’-CTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’
在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约一半样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
2、按照实施例1的方法，区别于在按荧光定量PCR技术设计的标记TaqMan探针的核苷酸序列为：P1’:5’-AAAGCAGAAACTCACATCG-3’。
标记TaqMan探针上连接的荧光基团和猝灭基团为FAM和MGB。
在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约一半样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
3、按照实施例1的方法，区别在于使用的PNA的序列为：PNA1’:5’-AGCAACATCTCCGA-3’。
定性检测：在突变样本含量为1/100时有检出结果，突变样本含量为1/1000时，约一半样本有检出结果；突变样本含量为1/2500时不能检出。
突变样本含量为1/100的样品进行定量检测，误差为15%以上。
二、使用不同浓度的PCR扩增引物、探针
1、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中的正向和反向PCR扩增引物分别为100nM。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。
2、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中的正向和反向PCR扩增引物含量分别为100nM，标记TaqMan探针和PNA探针含量分别为100nM。此时仅当突变含量为1/100时可检出突变，突变样本含量为1/1000和1/2500时均无法检出突变。
3、按照实施例1的方法，区别在于，数字PCR混合液中的正向和反向PCR扩增引物、正向和反向质控PCR引物标记TaqMan探针、质控TaqMan探针和PNA探针含量分别为1000nM。此时野生DNA样品出现假阳性信号，检测体系已无法给出准确结果。
三、使用荧光定量PCR的方法检测，检出限为1/100，而且在突变样本含量大于1%的情况下，定量分析的误差大于10%。

Claims (17)

1.一种检测EGFR外显子19缺失突变的PCR扩增引物，其特征在于，为反向PCR扩增引物和正向PCR扩增引物；
正向引物含有以下核苷酸序列中的一种：
F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’，
F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’；
反向引物含有以下核苷酸序列中的一种；
R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，
R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，
R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，
R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，
R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
2.权利要求1所述检测EGFR外显子19缺失突变的PCR扩增引物，其特征在于，正向PCR扩增引物选自以下核苷酸序列中的一种：
F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’，
F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’；
反向PCR扩增引物选自以下核苷酸序列中的一种：
R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，
R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，
R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，
R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，
R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
3.权利要求1所述检测EGFR外显子19缺失突变的PCR引物，其特征在于，PCR扩增引物选自以下各组引物中的一组：
（1）正向：F1:5’-GAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCT-3’，
反向R1:5’-ATGGACCCCCACACAGCA-3’，或者，
（2）正向：F2:5’-GAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTAT-3’
反向R2:5’-GGACCCCCACACAGCAAA-3’，或者，
（3）正向：F3:5’-AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA-3’，
反向R3:5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’，或者，
（4）正向：F4:5’-GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC-3’，
反向R4:5’-CCCCACACAGCAAAGCAG-3’，或者，
（5）正向：F5:5’-AAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG-3’，
反向R5:5’-CCACACAGCAAAGCAGAA-3’。
4.一种检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，其特征在于，所述标记TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其中核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一种：
P1:5’-ACTCACATCGAGGATTTCC-3’，
P2:5’-TCACATCGAGGATTTCCTT-3’，
P3:5’-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3’，
P4:5’-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3’，
P5:5’-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3’。
5.权利要求4所述检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，其特征在于，所述标记TaqMan探针的荧光基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素、Cy5、Cy3或VIC，猝灭基团选自6-羧基四甲基若丹明、BHQ1、BHQ2或MGB。
6.权利要求4所述检测EGFR外显子19缺失突变的标记TaqMan探针，所述核苷酸部分选自以下核苷酸序列中的一种：
P1:5’-ACTCACATCGAGGATTTCC-3’，
P2:5’-TCACATCGAGGATTTCCTT-3’，
P3:5’-ACATCGAGGATTTCCTTGT-3’，
P4:5’-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3’，
P5:5’-AGGATTTCCTTGTTGGCTT-3’。
7.一种检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针，其特征在于，含有以下核苷酸序列之一：
PNA1:5’-GAATTAAGAGAAGCA-3’，
PNA2:5’-ATTAAGAGAAGCAAC-3’，
PNA3:5’-TAAGAGAAGCAACAT-3’，
PNA4:5’-AGAGAAGCAACATCT-3’，
PNA5:5’-AGAAGCAACATCTCC-3’。
8.权利要求7所述检测EGFR外显子19缺失突变的PNA探针，其特征在于，选自以下核苷酸序列之一：
PNA1:5’-GAATTAAGAGAAGCA-3’，
PNA2:5’-ATTAAGAGAAGCAAC-3’，
PNA3:5’-TAAGAGAAGCAACAT-3’，
PNA4:5’-AGAGAAGCAACATCT-3’，
PNA5:5’-AGAAGCAACATCTCC-3’。
9.一种检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，含有以下物质中的至少一种：
（1）权利要求1、2或3所述的PCR扩增引物；
（2）权利要求4或5所述的标记TaqMan探针；
（3）权利要求6、7或8所述PNA探针。
10.权利要求9所述检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，还包含正向和反向的质控PCR引物和质控TaqMan探针；
所述的质控PCR引物用于扩增含EGFR基因DNA模板上保守序列；质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合。
11.权利要求10所述检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述的质控PCR引物用于扩增EGFR外显子2。
12.权利要求10或11所述检测EGFR外显子19缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述的质控PCR引物及质控TaqMan探针的核苷酸部分选自以下各组序列中的一组：
（1）正向引物：CF1:GTTTGCCAAGGCACGAGTAAC，
反向引物：CR1:TCCTCTGGAGGCTGAGAAAATGA，
质控TaqMan探针的核苷酸部分：CP1:TCACGCAGTTGGGCAC；或者，
（2）正向引物：CF2:GCCAAGGCACGAGTAACAAGC，
反向引物：CR2:CCTCCTCTGGAGGCTGAGAAAAT，
质控TaqMan探针的核苷酸部分：CP2:ACGCAGTTGGGCACTT。
13.一种检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备数字PCR混合液：将待检测样品、权利要求1～3任一项所述的PCR扩增引物、权利要求4或5所述标记TaqMan探针、权利要求6或7所述PNA探针、正向和反向质控PCR引物和质控TaqMan探针以及PCR预混液混合，制备得到数字PCR混合液；
所述的质控PCR引物用于扩增含EGFR基因的DNA模板上保守序列；质控TaqMan探针为连接荧光基团和猝灭基团的核苷酸，其荧光基团与标记TaqMan探针的荧光基团不同；质控TaqMan探针与质控PCR引物所扩增的序列结合；
（2）数字PCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；
PCR扩增条件为：93～97℃预变性3～15分钟；93～97℃变性5～50秒，65～75℃退火5～50秒，55～65℃延伸10～65秒，共进行20～60个循环，2～10℃终止反应；
（3）收集信号并进行结果判断：对PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的类型判断则待测样品中是否含有EGFR外显子19缺失突变的DNA模板及其数量和含量。
14.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，在数字PCR混合液中，DNA模板的含量为0.25～1ng/μL，正向和反向PCR扩增引物含量分别为500～700nM，标记TaqMan探针和PNA探针含量分别为200～400nM；正向和反向质控PCR引物含量分别为500～700nM，质控TaqMan探针含量分别为200～400nM。
15.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，在数字PCR混合液中，待测样品的DNA模板含量为0.5ng/μL，正向和反向PCR扩增引物含量分别为600nM，标记TaqMan探针以及PNA探针含量分别为300nM，正向和反向质控PCR引物含量分别为600nM，质控TaqMan探针含量分别300nM。
16.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：93.5～95℃预变性3～6分钟；93.5～95℃变性8～15秒，64.5～66℃退火8～15秒，55～57℃延伸40～50秒，共进行30-35个循环，6～10℃终止反应。
17.权利要求13所述检测EGFR外显子19缺失突变的方法，其特征在于，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性10秒，65℃退火10秒，56℃延伸45秒，共进行32个循环，10℃终止反应。
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