CN105734117A - 利用通用引物的核酸目标待测位点检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法，其包括向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针。本发明还提供了用于检测样品中靶核酸的突变的方法。本发明还提供了用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性的方法。本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒。

Description

利用通用引物的核酸目标待测位点检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域。更具体地说，本发明涉及使用通用引物和荧光探针在样品中检测目标核酸位点碱基的方法。

背景技术

在分子诊断领域中，检测核酸内容物中的微小差异是一项重要的工作，使用核酸扩增反应对微生物核酸进行检测和量化发挥重要的作用。针对各种病毒或细菌的常规检测是核酸扩增和检测反应大规模应用的一个例子。核酸扩增反应，例如聚合酶链式反应(PCR)的方法是本领域已知的。然而，常规的PCR检测方式存在需要对样品容器进行开盖取样，造成扩增反应环境的污染和导致测试结果的假阳性的缺陷。

使用荧光探针监测核酸扩增反应的方法是本领域已知的。基于PCR的分析的自动化系统可利用PCR过程期间对产物扩增给出的荧光信号进行实时检测。这类方法的关键是使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。

检测少量核酸最常用的方法是PCR或RT-PCR。在测定给定样品中目标序列与否存在，即定性分析时，这些方法起到了重要的作用。同样的，核酸的定量分析在例如质量控制、基因表达分析、医疗监护以及诊断中大量使用。然而，现有的荧光双标记探针的使用存在相关的缺陷。例如需要使用大量昂贵的荧光标记的寡核苷酸(包括引物和/或探针)，引物和/或探针设计复杂。

因此，本领域还需要一种更方便，精确度更高，而且能够尽量避免假阳性问题的PCR检测方法。本发明的方法通过引物和探针双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。本文所述方法显著改善了现有技术的核酸检测方法的精确度，在科学和医药领域中开辟了新的潜在应用。

发明内容

本发明提供了一种通过采用通用引物和特异性探针来检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法。本发明的方法大大简化了引物和探针设计，降低了难度。而且，本发明的方法通过引物和探针双重验证，能够增强检查结果的真实性。

具体的，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法，其包括以下几个步骤。

步骤(a)，向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针。

在本发明中，聚合酶是DNA聚合酶，参与DNA复制。它主要是以模板为基础，催化去氧核糖核苷酸的聚合。聚合后的分子将会组成模板链并再进一步参与配对。本发明使用的聚合物具有5'→3'的聚合酶活性。所述聚合酶具有5’→3’外切酶活性。5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。在本发明的其中一个方面，使用的聚合酶没有3'→5'外切酶活性。可用于本发明的方法的聚合酶包括TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶等。

在上述本发明的方法的步骤(a)中，所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测位点，该靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补(即与双链靶核酸中另一条单链上的待测位点的碱基相同)。所述靶序列识别片段与在待测位点的碱基不为目标碱基的靶核酸不能杂交。在本发明的其中一个方面，所述靶序列识别片段的核苷酸序列与靶核酸的序列完全互补。在本发明的另一个方面，所述靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，其它碱基与靶核酸可以有1％，2％，3％，5％的错配，其前提是，具有所述错配的靶序列识别片段与靶核酸可以杂交，但与在待测位点的碱基不为目标碱基的靶核酸不能杂交。

在本发明的其中一个方面，所述上游内引物为ARMS引物，即根据突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)方法设计的引物。ARMS引物设计在本领域是常用的手段，可参考EP332435中的描述。在本发明中，所述上游内引物的3’端末端(即其靶序列识别片段的靶序列识别片段)的第二至四个核苷酸与对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，优选的，所述错配是在3’端末端第二个核苷酸。

另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不能杂交，例如不互补。所述上游内引物的外引物重叠片段的序列与上游外引物的3’端的引物重叠片段相同。

所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不能杂交，例如不互补。

在上述本发明的方法的步骤(a)中，所述下游引物可与靶核酸特异性杂交，例如其具有核苷酸序列与靶核酸互补的片段。

在上述本发明的方法的步骤(a)中，所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭。所述探针可特异性与所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的位点的片段杂交。本发明中，所述探针包含对应所述待测位点的位点。探针可特异性杂交的所述扩增产物包含对应所述待测位点的位点，并且在作为其模板的靶核酸上，所述待测位点为目标碱基。在本发明的其中一个方面，所述探针的核苷酸序列与所述上游内引物和下游引物的扩增产物的序列完全相同或互补。所述探针的5’端的片段(5’端末端至包含对应所述突变的位点的片段)的序列与上游内引物的靶序列识别片段相同，即所述探针对应所述突变的位点和该位点的5’端一侧的相邻核苷酸的序列与所述内引物3’端的第1和第2个核苷酸相同。在本发明的其中一个方面，所述探针中对应靶核酸待测位点的碱基的位置位于所述探针中间，即在该碱基的两侧还具有与扩增产物杂交的片段，例如与扩增产物相同或互补的片段。在本发明的其中另一个方面，所述探针中对应靶核酸待测位点的碱基的位置可位于所述探针的3’或5’端末端。在本发明中，所述探针中5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段(包含其对应靶核酸的所述待测位点的核苷酸)的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸。由此，在上游外引物以由上游外引物(或上游内引物)和下游引物限制两侧的扩增产物为模板的延长反应中，具有5’→3’外切活性的聚合酶可水解与该扩增产物结合的探针。

在本发明的其中一个方面，所述上游内引物为ARMS引物，其3’端末端的第二至四个核苷酸与对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，例如3’端末端第二个核苷酸为错配。在这种情况下，由于所述探针的核苷酸序列与由所述上游内引物和下游引物的扩增产物相同，因此在对应所述错配的位点，所述探针的核苷酸与对应的所述靶核酸的核苷酸不同。

本发明的方法还包括步骤(b)，其中实施多个循环扩增步骤，其中每个所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤。杂交步骤包括使引物与其对应的核酸模板特异性退火杂交。核酸延长步骤包括在聚合酶的催化下,引物延伸和生成自模板衍生的扩增产物。在步骤(b)中，还包括测量报告基团的信号的步骤，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述杂交步骤在约45-72℃下进行，优选在约55-65℃下进行，最优选为在约59-62℃下进行。

在步骤(b)中，当靶核酸为双链DNA时，循环扩增步骤还可包括变性步骤，其中双链DNA模板退火，变成单链，由此引物可与模板上的靶序列特异性杂交。在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述变性步骤在约90-96℃下进行，优选在约94-96℃下进行，最优选为在约95℃下进行。

在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述核酸延长步骤在约55-78℃下进行，优选在约60-75℃下进行，最优选为在约60-72℃下进行。

在本发明中，所述多个循环扩增步骤可分为第一扩增阶段和第二扩增阶段。在第一扩增阶段中(例如为约第1-10个循环)可得到以靶核酸为模板，由上游内引物与下游引物限定的扩增产物。在第二扩增阶段中(例如为约第11-30至40个循环)可得到以第一扩增阶段得到的扩增产物为模板，由上游外引物与下游引物限定的扩增产物。

在本发明的其中一个方面，本发明的上述方法中还向所述循环扩增反应混合物中提供下游外引物，在这种情况下，所述循环扩增反应混合物中的所述下游引物包括3’端的下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补(与下游外引物的3’端的引物重叠片段相同)，所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游引物的5’端的下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补。在这种情况下，在本发明的前述方法的步骤(b)中，所述多个循环扩增步骤的第二扩增阶段可得到上游外引物与下游外引物限定的产物。

在本发明的方法中，所述3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团的探针在完整的情况下，例如游离在反应溶液中，或是虽然与靶核酸模板杂交和结合，但是未被聚合酶的外切活性将标记了报告基团或淬灭基团的碱基切除的情况下，报告基团或淬灭基团之间发生能量转移，使得从报告染料的荧光发射至少部分或完全淬灭。在本发明的方法中，在以由上游外引物和下游引物限制两侧的扩增产物为模板的退火和延长反应中，或是在前述还提供下游外引物的情况下，在以由上游外引物和下游外引物限制两侧的扩增产物为模板的退火和延长反应中，当探针可以识别和结合包含对应所述待测位点的位点的扩增产物的片段，上游外引物与模板退火，在聚合酶的作用下延伸，此时具有5’→3’外切活性的聚合酶可水解与该扩增产物结合的探针，由此释放报告基团和/或淬灭基团，产生信号。在本发明的其中一个方面，其中在所述核酸延长步骤测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

在本发明的其中一个方面，所述探针具有约15-50个碱基，优选为约18-35个碱基。

在本发明的其中一个方面，其中步骤(b)中所述核酸延长步骤和杂交步骤在相同温度下进行。例如，在杂交步骤之后即升温至进行下一个循环的变性步骤的温度，在此升温过程中即实现了引物延伸。

在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。

在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭基团选自荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX)，罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX)，和花青染料(例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。

在本发明的其中一个方面，提供了将上述本发明的方法用于检测样品中靶核酸的同一待测位点上两个目标碱基的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物包括第一上游内引物和第二上游内引物，所述第一上游内引物的3’端的靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点的第一目标碱基互补；所述第二上游内引物的3’端的靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点的第二目标碱基互补；

其中所述探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针可特异性与所述第一上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交；所述第二探针可特异性与所述第二上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交；所述第一探针的3’和5’端标记了第一报告基团和第一淬灭基团；所述第二探针的3’和5’端标记了第二报告基团和第二淬灭基团；优选的，所述第一和第二探针的核苷酸序列与其对应的所述扩增产物的片段的序列完全互补；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量第一和第二报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

在本专利中，术语“第一上游内引物”和“第二上游内引物”都符合前面描述的本发明的“上游内引物”的定义和特征。其中的表述“第一”和“第二”仅用于区别具有相同定义和特征的同一术语的不同具体对象。以此类推，术语“第一探针”和“第二探针”都符合本发明的“探针”的定义和特征。

该用于检测样品中靶核酸的同一待测位点上两个目标碱基的方法中其它条件如前述本发明的方法中定义或限定。

在本发明的其中一个方面，所述第一上游内引物和第二上游内引物为ARMS引物。优选的，所述ARMS引物的3’端末端的二至四个核苷酸与其对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，优选的，所述错配是在3’端末端第二个核苷酸。

在本发明的其中一个方面，该用于检测样品中靶核酸的同一待测位点上两个目标碱基的方法中，样品中含有同一待测位点上的所述两个目标碱基的两个靶核酸的比例大于约10:1，优选大于约20:1，更优选大于约100:1。

在本发明的其中一个方面，提供了将上述本发明的方法用于检测样品中靶核酸的突变的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测突变位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点野生型或突变碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；所述外引物重叠片段的序列与上游外引物的3’端的引物重叠片段相同；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与以所述待测位点为突变碱基或野生型碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，例如完全互补，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；

(b)实施多个循环扩增步骤，每个所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测突变进行检测。

该用于检测样品中靶核酸的突变的方法中其它条件如前述本发明的方法中定义或限定。

在本发明的其中一个方面，提供了将上述本发明的方法用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测单核苷酸多态性位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测单核苷酸多态性位点的目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；所述外引物重叠片段的序列与上游外引物的3’端的引物重叠片段相同；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物结合片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与以在所述待测单核苷酸多态性位点为目标碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测单核苷酸多态性位点的片段杂交，例如完全互补，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；

(b)实施多个循环扩增步骤，每个所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测单核苷酸多态性进行检测。

该用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性的方法中其它条件如前述本发明的方法中定义或限定。

本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的试剂盒。

在本发明的其中一方面，提供了上述用于检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的试剂盒，其包括：上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；所述外引物重叠片段的序列与上游外引物的3’端的引物重叠片段相同；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同(即也与靶核酸的序列不互补)，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，例如完全互补，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸。

在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中还包括下游外引物，在这种情况下，所述循环扩增反应混合物中的所述下游引物包括3’端的下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补而与下游外引物的3’端的引物重叠片段相同，所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游引物的5’端的下游外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端与靶核酸不互补。

在本发明的其中一个方面，所述试剂盒中还包括具有5’→3’外切活性的聚合酶。在本发明的其中一个方面，所述聚合酶没有3'→5'外切酶活性。

本发明的试剂盒可用于检测核酸突变、SNP检测或微生物分型。所述微生物可选自病毒或细菌，例如HBV、HPV等。

该用于检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的试剂盒中其它组成如前述本发明的方法中定义或限定。

定义：

术语"引物"一般指的是在具有催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件(例如具有聚合酶和互补序列的模板，以及在合适的温度)下能够作为沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以为一条或多条。术语“引物对”表示一组或一对引物，其包括与扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为“正向”或“上游”)以及与扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为“反向”或“下游”)。

术语“碱基配对”或"互补"是指公知的Watson-Crick碱基配对，包括双链DNA中碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间，或者RNA/DNA杂交分子中腺嘌呤-尿嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间的配对，以及非常规核苷酸或衍生物之间的类似组合。术语核酸序列的互补物指的是当与核酸序列对应以便一条序列的5'末端与另一条的3'末端配对时处于"反向平行结合"的寡核苷酸。例如，序列5'-AGTTC-3'与序列5'-GAACT-3'是互补的。术语"完全互补的"等指的是在反向平行链之间具有完美的Watson-Crick碱基配对(在多核苷酸双螺旋中没有错配)的互补序列。然而，互补有时不是完全的，例如可以包含错配碱基对或不匹配碱基。术语"部分互补"、"部分互补的"、"非完全互补"或"非完全互补的"等指的是反向平行多核苷酸链之间的任何碱基比对小于100％完全的(例如，在多核苷酸双螺旋中存在至少一个错配或不匹配碱基)，但仍能形成比较稳定的双链结构的情况。例如，反向平行多核苷酸链之间的碱基比对可以是至少99％、95％、90％，或之间的任何值。

术语"靶核酸"、"靶序列"或"靶核酸序列"指的是要扩增、检测的寡核苷酸区域。靶序列通常具有与引物或探针互补的序列，或为位于用于扩增的两引物序列之间的序列。在本专利中，靶核酸通常是指DNA双链中的其中一条链。当描述引物或探针与靶核酸互补或相同时，其与靶核酸的DNA双链中的另外一条链是相同或互补的。

术语“模板”或“模板核酸分子”是指通过聚合酶(例如DNA聚合酶)从其合成互补核酸链的核酸链。例如，在PCR反应中引物互补、识别和结合，然后从其合成互补核酸链的核酸链。

术语"标记"指的是可用于提供可检测的信号，并且能够附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子，或是将该信号附着核酸或蛋白质。标记可以为可被荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。

术语"FRET"(荧光共振能量转移或型共振能量转移)通常指的是两个染料分子的电子状态之间的动态距离依赖的相互作用，其中能量从供体染料分子转移到受体染料分子而没有来自供体分子的光子发射。通常，FRET要求，(a)供体和受体分子必须紧密地接近(一般，例如)，(b)受体的吸收光谱必须与供体的荧光发射光谱重叠，以及(c)供体和受体跃迁偶极取向必须是大致并行的。

在大部分FRET应用中，供体和受体染料或报道分子和猝灭剂是不同的，在该情况下FRET可以通过受体敏化荧光的出现或供体荧光的猝灭来检测。在某些情况下，供体和受体或报道分子和猝灭剂是相同的，而FRET可以通过产生的荧光消偏振来检测。

术语"报告基团"或“报告分子”一般指的是产生可检测的辐射，例如荧光或发光辐射，的发射的部分，该发射可以被转移给足够接近的适当的FRET猝灭剂。通常，这样的分子是染料。表述"报告分子"可以与"报告分子"或"报告标记"或"FRET标记部分"可互换地使用。

术语"猝灭基团"或“猝灭分子”通常指的是减少和/或能够减少可检测的辐射，例如但不限于荧光或发光辐射，的发射的部分。表述"猝灭分子"可以与"淬灭基团"可互换地使用。通常，猝灭剂指的是能够减少光发射的任何部分。在某些方面，猝灭剂减少来源发射的可检测的辐射至少50％，可选择地至少80％，并且可选择地和最优选至少90％。一般来说，猝灭分子导致来自报道分子的荧光发射减少，由此报道分子/猝灭分子形成FRET对，并且该猝灭剂被称为"FRET猝灭剂"而该报道分子为"FRET报道分子"。术语"猝灭剂"不限于FRET猝灭剂。在一些实施方案中，猝灭剂指的是能够减少光发射的分子。如本文使用的，"猝灭"包括任何类型的猝灭，包括动态(-Dexter能量转移等)和静态的(基态复合物)。还可选择地，猝灭剂可以为除光外的形式，例如热，散失从荧光染料中吸收的能量。在一些实施方案中，某些猝灭剂能够以可同FRET报道分子发射区分的波长或信号类型，和以该猝灭剂特征的波长或信号类型重新发射从FRET报道分子吸收的能量。从这方面来说，猝灭剂也可以是"标记"。

如本文所使用的，术语“相应于”指当一个核酸和与之比较的核酸序列比对时，第一核酸序列中的核苷酸与参比核酸序列中的给定核苷酸对准。

如本文所使用的，“聚合酶链反应”或“PCR”指一种用于扩增特定多核苷酸模板序列的体外方法。PCR反应包括一系列重复的温度循环，且通常在10-100μl的体积中进行。反应混合物包含dNTPs(四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一种)、引物、缓冲液、DNA聚合酶如热稳定的DNA聚合酶以及多核苷酸模板。一次PCR反应可由例如多核苷酸分子的5-100次变性和合成的“循环”组成。

本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的各种缺陷，获得了更大的信号动力学和更好的准确度，并且还具有以下优点：只需要考虑通用引物，特别是内引物的识别序列，大大简化了引物和探针设计，降低了难度。而且，本发明的方法通过引物和探针双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。

附图说明

附图1扩增反应模板之一的核酸序列

附图2扩增反应模板之二的核酸序列

附图3荧光PCR测试结果。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但这些实施例不在任何方面限制本发明。

实施例1

1.扩增反应模板

本发明的方法用来扩增以下合成的野生型和突变型模板，其分别包含如SEQIDNO.1所示的核酸序列(如图1所示)和SEQIDNO.2所示的核酸序列(如图2所示)，并将其克隆到商购的pET30a质粒中。

其中突变型模板与野生型模板比较，具有单碱基突变，其中在SEQIDNO.2的第213位的G突变为C(图1和图2所示序列中下划线标示的碱基)。

2.引物和带荧光标记探针的合成和标记

人工合成和标记得到以下引物或探针：

左侧引物:5’-TGGCTCAGTTTACTAGTG-3’

探针：5’-FAM-CCACATCATGGATATAACTG–TAMRA-3’

右侧外引物：5’-ACCTGTCAGTTAACCAAG-3’

右侧内引物:5’-CCCAATACCACATCATGG-3’

其中，探针为以下标记：

TAMRA：四甲基罗丹明标记

FAM：羧基荧光素标记。

其中带单下划线的碱基为错配碱基设计。在本实施例中，右侧内引物的-3’末端第一个碱基与待检测的突变型模板的碱基(C)互补，与野生型模板的碱基(G)不互补。右侧内引物的-3’末端第二个碱基与对应的突变型模板和野生型模板的碱基都不互补，即为ARMS引物的错配设计的碱基。

右侧外引物和右侧内引物中带双下划线的序列为其重叠的序列部分。

所述探针的5’端的序列CCACATCATGG与右侧内引物的靶序列识别片段相同，也就是说，所述探针对应所述突变的位点和该位点的5’端一侧的相邻核苷酸的序列与所述内引物3’端的第1和第2个核苷酸相同(都是GG)。右侧内引物与左侧引物可以突变型模板中包括待测突变碱基的片段为模板得到扩增产物，但不能得到野生型模板扩增产物。所述探针的核苷酸序列与右侧内引物与左侧引物以突变型模板中包括待测突变碱基的片段为模板得到的扩增产物对应的片段互补，能够特异性识别和结合突变型模板的扩增产物，但是不能识别和结合野生型模板的扩增产物(如有)。

PCR条件

使用ABI7500FAST荧光定量PCR仪进行PCT和荧光检测。

使用的DNA聚合酶为：TaqDNA聚合酶。

分别以不同浓度的前述DNA质粒作为模板进行PCR。

PCR反应混合物：

PCR循环设置：

94℃，2分钟，1个循环；

95℃，10秒，然后56℃，30秒，40个循环。

根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个56℃步骤期间采集数据。

实验结果显示于图3。图3为前述分别以不同浓度的前述DNA质粒作为模板进行PCR的四个PCR扩增反应采集的信号的合并图。PCR反应中分别采用的模板为：突变型模板质粒(106拷贝)，突变型模板质粒(104拷贝)，野生型模板质粒和水。

图3中显示出4条曲线，其显示在PCR过程中采集到的羧基荧光素信号。其中，信号最强的曲线(图中位置最高的曲线)采用的模板为突变型模板质粒(106拷贝)，信号次强的曲线(图中位置第二的曲线)采用的模板为突变型模板质粒(104拷贝)。如图所示，采用野生型模板质粒和水为模板的反应的信号与基线基本相同，没有显著区别。

在本实施例中，报道分子和猝灭剂是在同一探针上，在游离状态下，该探针的所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭。当右侧内引物可以识别、结合和扩增突变型样品时，即右侧内引物的3’端第一个核苷酸与突变型模板的对应碱基互补，第二个核苷酸与模板不互补时，在上游外引物以由右侧外引物和左侧引物限制两侧的扩增产物为模板的退火和延长反应中，具有5’→3’外切活性的聚合酶可水解与该扩增产物结合的探针，即聚合酶可识别和切割掉标记在探针上的FAM基团，由此检测到极强的荧光信号。而另一方面，由于右侧内引物的3’端第一和第二个核苷酸与野生型模板的对应碱基都不互补，右侧内引物不可以结合和扩增野生型序列时，因此没有出现探针被水解的反应，由此不能检测到荧光信号。

实验证明本发明的设计能非常有效的区分碱基突变，并且由于有内引物特异识别模板以及探针特异性识别内引物的扩增产物，大大降低了假阳性出现的几率。

本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的许多缺陷，获得了更大的信号动力学和更好的准确度，并且还具有以下优点：只需要考虑通用引物，特别是内引物的识别序列，大大简化了引物和探针设计，降低了难度。而且，本发明的方法通过引物和探针双重验证，能够大大增强检查结果的真实性。

其他实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见。很清楚以上详述只为澄清所设且仅作为例证。本发明的精神和范围不限于上述实施例，但为权利要求所包含。

Claims (17)

1.一种检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

2.权利要求1的方法，其中所述上游内引物为ARMS引物，其3’端末端的第二至四个核苷酸与对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，优选的，所述错配是在3’端末端第二个核苷酸。

3.权利要求1或2的方法，其中所述探针的核苷酸序列与以所述待测位点为目标碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段互补。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述探针的5’端末端至包含对应所述突变的位点的片段的序列与所述上游内引物的靶序列识别片段相同。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多个循环扩增步骤包括第一扩增阶段和第二扩增阶段，在第一扩增阶段中可得到以靶核酸为模板，由上游内引物与下游引物限定的扩增产物，第二扩增阶段中可得到以第一扩增阶段得到的扩增产物为模板，由上游外引物与下游引物限定的扩增产物。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中还向所述循环扩增反应混合物中提供下游外引物，

其中，所述循环扩增反应混合物中的所述下游引物包括3’端的下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补，

所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游引物的5’端的下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补。

7.权利要求6的方法，当循环扩增反应混合物中具有下游外引物时，第二扩增阶段可得到上游外引物与下游外引物限定的产物。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述核酸延长步骤测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述探针中对应靶核酸待测位点的碱基的位置位于所述探针中间。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述聚合酶具有5’→3’外切活性，更优选的，所述聚合酶没有3'→5'外切酶活性。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其用于检测样品中靶核酸的同一待测位点上两个目标碱基的方法，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物包括第一上游内引物和第二上游内引物，所述第一上游内引物的3’端的靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点的第一目标碱基互补；所述第二上游内引物的3’端的靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点的第二目标碱基互补；

其中所述探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针可特异性与所述第一上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交；所述第二探针可特异性与所述第二上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交；所述第一探针的3’和5’端标记了第一报告基团和第一淬灭基团；所述第二探针的3’和5’端标记了第二报告基团和第二淬灭基团；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量第一和第二报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。

12.权利要求11的方法，其中所述第一上游内引物和第二上游内引物为ARMS引物，优选的，所述ARMS引物的3’端末端的第二至四个核苷酸与其对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，更优选的，所述错配是在3’端末端第二个核苷酸。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其用于检测样品中靶核酸的突变，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测突变位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点野生型或突变碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补而与上游外引物的3’端的引物重叠片段相同；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与以所述待测位点为突变碱基或野生型碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测突变进行检测。

14.权利要求1-12中任一项的方法，其用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性，其包括以下步骤：

(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测单核苷酸多态性位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测单核苷酸多态性位点的目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补而与上游外引物的3’端的引物重叠片段相同；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与以在所述待测单核苷酸多态性位点为目标碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测单核苷酸多态性位点的片段杂交，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；

(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测单核苷酸多态性进行检测。

15.一种用于如权利要求1-14中任一项所述的检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法的试剂盒，其包括：上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，

其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；

其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；

其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸。

16.权利要求15的试剂盒，其中还包括下游外引物，

其中，所述循环扩增反应混合物中的所述下游引物包括3’端的下游引物靶序列识别片段，其核苷酸序列与靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补而与下游外引物的3’端的引物重叠片段相同，

所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游引物的5’端的下游外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端与靶核酸不互补。

17.权利要求15或16的试剂盒，其中还包括具有5’→3’外切活性的聚合酶，优选的，所述聚合酶没有3'→5'外切酶活性。