CN104561248A - 用于检测靶核酸的引物和其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种扩增、检测和定量靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)将样品在聚合酶的存在下与一对引物接触，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，并且所述报告引物的3’端的一个或一个以上核苷酸与靶核酸的序列错配；(b)实施一个或多个循环扩增步骤；(c)测量报告基因的信号，由此对靶核酸进行检测和定量。本发明还提供了用于本发明方法的试剂盒和反应混合物。

Description

用于检测靶核酸的引物和其应用

技术领域

本发明涉及在样品中检测靶核酸的方法。更具体地说，本发明涉及使用聚合酶和荧光探针在样品中检测目标核酸的引物和其应用。

背景技术

在分子诊断学领域中，使用核酸扩增反应对微生物核酸进行检测和量化发挥重要的作用。针对各种病毒或细菌的常规检测是核酸扩增和检测反应大规模应用的一个例子。核酸扩增反应，例如聚合酶链式反应（PCR）的方法是本领域已知的。然而，常规的PCR检测方式存在需要对样品容器进行开盖取样，造成扩增反应环境的污染和导致测试结果的假阳性的缺陷。

使用荧光探针监测核酸扩增反应的方法是本领域已知的。基于PCR的分析的自动化系统可利用PCR过程期间对产物扩增给出的荧光信号进行实时检测。这类方法的关键是使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。

荧光探针的一个实例是双标记探针，一般由两种不同染料，也就是报道分子和猝灭剂标记的寡核苷酸组成，能与特定的目标核酸序列杂交。报道分子是被光激发时能够发射荧光的分子，而猝灭剂是能够吸收报道分子发射的荧光的分子。PCR反应的监测基于当PCR反应进行时监测荧光随时间的强度。现在最常用的荧光检测利用的是荧光共振能量转移（FRET)，这是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。在这种情况下，当报道分子被适当波长的光激发时，报道分子发射的荧光被猝灭剂"猝灭"而观察到相对低的荧光强度。如果在PCR的延伸阶段期间探针被DNA聚合酶裂解，报道分子与探针隔断，这样在报道分子和猝灭剂之间没有FRET发生。监测荧光强度的变化可以用来定量地监测PCR反应。

然而，现有的荧光双标记探针的使用存在相关的缺陷。例如需要使用大量昂贵的荧光标记的寡核苷酸（包括引物和/或探针），引物和/或探针设计复杂。

因此，本领域还需要一种更方便，精确度更高，而且能够尽量避免假阳性问题的PCR检测方法。

发明内容

本发明提供了一种扩增、检测和定量靶核酸的方法，其包括以下步骤：

(a)将样品在聚合酶的存在下与一对引物接触，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的一个或以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上；

(b)实施一个或多个循环扩增步骤，其中循环步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤，所述杂交步骤包括使由所述引物与靶核酸特异性杂交，所述核酸延长步骤包括在所述聚合酶的催化下,引物延伸和生成自所述靶核酸衍生的扩增产物；

(c)测量报告基因的信号，由此对靶核酸进行检测和定量。

在本发明的方法中，所述报告引物在完整的情况下，例如游离在反应溶液中，或是虽然与靶核酸模板杂交和结合，但是未被聚合酶的外切活性将标记了报告基团或淬灭基团的碱基切除的情况下，报告基团或淬灭基团之间发生能量转移，使得从报告染料的荧光发射至少部分或完全淬灭。

在步骤(b)中，当靶核酸为双链DNA时，循环步骤还可包括杂交步骤前的变性步骤，其中双链DNA模板退火，变成单链，由此引物可与模板上的靶序列特异性杂交。

在步骤(b)中，所述聚合酶的催化作用包括在模板和与模板杂交的引物的存在(引物提供3'-OH)的条件下,识别碱基和按5'→3'的方向合成和延伸核酸，当所述聚合酶识别到碱基存在不配对时，由于聚合酶的3’-5’外切活性，3’端错配的碱基被水解。

当样品中存在靶核酸时，在步骤(b)中，报告引物与靶核酸发生特异性杂交，在聚合酶的作用下延伸，同时，由于聚合酶的3’-5’外切活性，3’端错配的碱基被水解，标记在所述错配的碱基上的报告基团脱落和离开淬灭基团；如果样品中不存在靶核酸，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，检测不到荧光信号；用光源激发报道分子；测量将报告引物与靶核酸杂交和延伸的条件下获得的荧光，或者将其与在对照核酸存在的条件下获得的荧光比较。

在本发明中,有关术语具有现有的生物技术、有机化学、无机化学等领域的常规定义。具体的，有关术语可如如下说明和定义。

术语"样品"指的是包含或推测包含核酸的任何物质。例如从个体分离的组织或液体样品，包括但不限于，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官、肿瘤，以及体外细胞培养组分样品。

术语"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互换地使用。这些术语仅仅涉及核酸分子的一级结构。"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"可以为双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。寡核苷酸一般具有至少大约6个核苷酸的序列，例如至少大约10-12个核苷酸，或至少大约15-20个核苷酸。"相应"表示与指定序列一致或互补。寡核苷酸可以是来自天然的，也可以是合成的，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。

术语“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合(即聚合酶活性)的酶，一般是指DNA聚合酶。通常，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3’-端开始合成，并将继续朝向模板链的5’端。“DNA聚合酶”可催化脱氧核苷酸的聚合。

术语"引物"一般指的是在具有催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件（例如具有聚合酶和互补序列的模板，以及在合适的温度）下能够作为沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以为一条或多条。术语“引物对”表示一组或一对引物，其包括与扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为“正向”或“上游”)以及与扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为“反向”或“下游”)。

术语“碱基配对”或"互补"是指公知的Watson-Crick碱基配对，包括双链DNA中碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间，或者RNA/DNA杂交分子中腺嘌呤-尿嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间的配对，以及非常规核苷酸或衍生物之间的类似组合。术语核酸序列的互补物指的是当与核酸序列对应以便一条序列的5'末端与另一条的3'末端配对时处于"反向平行结合"的寡核苷酸。例如，序列5'-AGTTC-3'与序列5'-GAACT-3'是互补的。术语"完全互补的"或"100%互补的"等指的是在反向平行链之间具有完美的Watson-Crick碱基配对（在多核苷酸双螺旋中没有错配）的互补序列。然而，互补有时不是完全的，例如可以包含错配碱基对或不匹配碱基。术语"部分互补"、"部分互补的"、"非完全互补"或"非完全互补的"等指的是反向平行多核苷酸链之间的任何碱基比对小于100%完全的（例如，在多核苷酸双螺旋中存在至少一个错配或不匹配碱基），但仍能形成比较稳定的双链结构的情况。例如，反向平行多核苷酸链之间的碱基比对可以是至少99%、95%、90%，或之间的任何值。

术语"靶核酸"、"靶序列"或"靶核酸序列"指的是要扩增、检测的寡核苷酸区域。靶序列通常具有与引物或探针互补的序列，或为位于用于扩增的两引物序列之间的序列。

术语“模板”或“模板核酸分子”是指通过聚合酶（例如DNA聚合酶）从其合成互补核酸链的核酸链。例如，在PCR反应中引物互补、识别和结合，然后从其合成互补核酸链的核酸链。

术语"标记"指的是可用于提供可检测的信号，并且能够附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子，或是将该信号附着核酸或蛋白质。标记可以为可被荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。

术语"FRET"（荧光共振能量转移或型共振能量转移）通常指的是两个染料分子的电子状态之间的动态距离依赖的相互作用，其中能量从供体染料分子转移到受体染料分子而没有来自供体分子的光子发射。通常，FRET要求，(a)供体和受体分子必须紧密地接近（一般，例如），(b)受体的吸收光谱必须与供体的荧光发射光谱重叠，以及(c)供体和受体跃迁偶极取向必须是大致并行的。

在大部分FRET应用中，供体和受体染料或报道分子和猝灭剂是不同的，在该情况下FRET可以通过受体敏化荧光的出现或供体荧光的猝灭来检测。在某些情况下，供体和受体或报道分子和猝灭剂是相同的，而FRET可以通过产生的荧光消偏振来检测。

术语"报告基团"或“报告分子”一般指的是产生可检测的辐射，例如荧光或发光辐射，的发射的部分，该发射可以被转移给足够接近的适当的FRET猝灭剂。通常，这样的分子是染料。表述"报告分子"可以与"报告分子"或"报告标记"或"FRET标记部分"可互换地使用。

术语"猝灭基团"或“猝灭分子”通常指的是减少和/或能够减少可检测的辐射，例如但不限于荧光或发光辐射，的发射的部分。表述"猝灭分子"可以与"淬灭基团"可互换地使用。通常，猝灭剂指的是能够减少光发射的任何部分。在某些方面，猝灭剂减少来源发射的可检测的辐射至少50%，可选择地至少80%，并且可选择地和最优选至少90%。一般来说，猝灭分子导致来自报道分子的荧光发射减少，由此报道分子/猝灭分子形成FRET对，并且该猝灭剂被称为"FRET猝灭剂"而该报道分子为"FRET报道分子"。术语"猝灭剂"不限于FRET猝灭剂。在一些实施方案中，猝灭剂指的是能够减少光发射的分子。如本文使用的，"猝灭"包括任何类型的猝灭，包括动态（能量转移等）和静态的（基态复合物）。还可选择地，猝灭剂可以为除光外的形式，例如热，散失从荧光染料中吸收的能量。在一些实施方案中，某些猝灭剂能够以可同FRET报道分子发射区分的波长或信号类型，和以该猝灭剂特征的波长或信号类型重新发射从FRET报道分子吸收的能量。从这方面来说，猝灭剂也可以是"标记"。

术语“聚合酶的3’-5’外切活性”或“聚合酶的3’-5’核酸酶活性”是指聚合酶具有的从3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸的活性。测定聚合酶的3’-5’核酸酶活性的方法在本领域中是已知的，例如描述于PCT/JP96/03869中的方法。

术语"具有3’-5’外切活性的聚合酶"是指具有从3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸的活性的聚合酶。任何具有3’-5’外切活性的聚合酶可以用于本发明。

术语DNA聚合酶的“保真性”是指通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA聚合的精确度。本领域可通过错误率(加入不准确的核苷酸，即，并不互补于模板核苷酸的核苷酸的频率)来测量DNA聚合酶的保真性。错误率的单位通常为每延伸一个碱基，聚合酶加入不准确的核苷酸的比例。通过聚合酶活性和DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性可以维持DNA聚合的精确度或保真性。因此，可通过DNA聚合酶的“保真性”来评估或定义DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性。DNA聚合酶的保真性或错误率可以利用本领域已知的测定方法来测量。例如，可以利用在Cline，J.et al.(96)NAR24：3546-3551所描述的lacI PCR保真性分析(测定)或Fujii S等在J.Mol.Biol.,289:835-850(1999)中描述的方法来测试DNA聚合酶的错误率。优选的，用于本发明的聚合酶的保真性为错误率小于约1%，更优选为小于0.1%。在本发明的其中一个方面，用于本发明的聚合酶的保真性为Taq DNA聚合酶的约20倍，优选为约50倍，更优选为约80倍以上。

可用于本发明的具有3’-5’外切活性的聚合酶的例子包括pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Vent DNA聚合酶等。优选的，可用于本发明的具有3’-5’外切活性的聚合酶为KOD DNA聚合酶。

术语"Tm"或"解链温度"是指同源双链或异源双链中的双链多核苷酸解离成单链的温度。预测和测定Tm的方法是本领域已知的。例如，传统上通过解链曲线确定Tm，其中双链体核酸分子在控制温度程序中加热，监测该双链体中的两条单链的结合/解离状态并图示直到达到两条链完全解离的温度。Tm从该解链曲线中读出。

在本发明的其中一个方面，其中所述具有3’-5’外切活性的聚合酶的保真性为错误率小于5.0×10^-5突变/nt/复制，优选为小于1.0×10^-5突变/nt/复制，更优选为小于1.0×10^-6突变/nt/复制。

在本发明的其中一个方面，其中所述具有3’-5’外切活性的聚合酶选自pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Vent DNA聚合酶，优选为KOD DNA聚合酶。

在本发明的其中一个方面，其中所述报告引物的3’端的两个核苷酸与靶核酸的序列错配。

在本发明所述报告引物中，所述报告基团标记在错配的核苷酸上。其中，可以在多个所述错配的核苷酸标记多个报告引物。在本发明的其中一个方面，所述报告引物的3’端的错配的两个或两个以上核苷酸上标记一个所述报告基团。

在本发明的其中一个方面，其中所述一对引物中的一个为报告引物。

在本发明的其中一个方面，其中所述一对引物中的两个为报告引物。

在本发明的其中一个方面，其中步骤（b）中所述杂交步骤在约45-72℃下进行，优选在约55-65℃下进行，最优选为在约59-62℃下进行。

在步骤(b)中，当靶核酸为双链DNA时，循环扩增步骤还可包括变性步骤，其中双链DNA模板退火，变成单链，由此引物可与模板上的靶序列特异性杂交。在本发明的其中一个方面，其中步骤（b）中所述变性步骤在约90-96℃下进行，优选在约94-96℃下进行，最优选为在约95℃下进行。

在本发明的其中一个方面，其中步骤（b）中所述核酸延长步骤在约55-78℃下进行，优选在约60-75℃下进行，最优选为在约60-72℃下进行。

在本发明的其中一个方面，其中步骤（b）中所述核酸延长步骤和杂交步骤在相同温度下进行。例如，在杂交步骤之后即升温至进行下一个循环的变性步骤的温度，在此升温过程中即实现了引物延伸。

在本发明的其中一个方面，其中所述报告基团为荧光报告基团。在本发明的其中一个方面，所述报告基团选自荧光素染料（例如FAM、JOE和HEX），罗丹明染料（例如R6G、TAMRA、ROX），和花青染料（例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）。

在本发明的其中一个方面，其中所述淬灭基团选自荧光素染料（例如FAM、JOE和HEX），罗丹明染料（例如R6G、TAMRA、ROX），和花青染料（例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）。

本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的试剂盒。在本发明的其中一个方面，所述试剂盒包括包括前面所述聚合酶和所述一对引物，所述引物与靶核酸的独特序列部分可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物标记了报告基团和淬灭基团，在游离状态下，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的一个或一个以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在所述错配核苷酸上。任选地，试剂盒可以包含纸制的或电子的说明书以及包括用于操纵荧光监测的软件的电脑可读的介质。电脑可读的介质可以是能够通过电脑或包含例如微处理器的其它仪器读出或解码的类型。

本发明还提供了用于实施前述本发明的方法的反应混合物。在本发明的其中一个方面，反应混合物包括待测样品（样品中含有或不含有目标核酸），包括前面所述聚合酶和所述一对引物，所述引物与靶核酸的独特序列部分可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物标记了报告基团和淬灭基团，在游离状态下，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的一个或一个以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在所述错配核苷酸上。本发明的反应混合物还可以包括各种用于核酸扩增的组分。

附图说明

附图1  扩增反应模板之一的核酸序列；

附图2  荧光PCR测试结果一。其中引物3’端不引入错配碱基，聚合酶无法直接切割掉标记在引物3’端的FAM基团，不能检测到信号；

附图3  荧光PCR测试结果二。其中一个引物3’端引入一个错配碱基，聚合酶可识别和切割掉标记在引物3’端错配碱基上的FAM基团，检测到荧光信号。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但这些实施例不在任何方面限制本发明。

实施例1

1.扩增反应模板

本发明的方法用来扩增pET30a质粒的核苷酸片段，即以pET30a质粒作为待扩增的DNA模板一。其中，pET30a质粒为可商购的质粒，包含如SEQ ID NO.1所示的核酸序列（如图1所示）。

2.带荧光标记引物的合成和标记

人工合成和标记得到以下引物：

上游引物：

TAMRA：四甲基罗丹明标记

FAM：羧基荧光素标记

其中，F-2的3’端的一个（A）为引入的错配碱基（带下划线）。

下游引物：

3.PCR条件

使用ABI7500FAST荧光定量PCR仪进行PCT和荧光检测。

使用的DNA聚合酶为：KOD-Plus-neo（TOYOBO）。经测试，所述KOD DNA聚合酶的错误率小于0.1%，同条件下Taq DNA聚合酶的错误率为约7.0%。

以前述pET30a质粒作为模板,分别以上游引物F-1、F-2与下游引物R-1为引物对进行PCR。

PCR反应混合物：

PCR循环设置：

94℃，2分钟，1个循环；

95℃，5秒，然后60℃，60秒，40个循环。

根据仪器和使用的荧光标记进行自动检测。其中设定在每个60℃步骤期间采集数据。

实验结果分别显示于图2和图3。图中的FAM为羧基荧光素标记，ROX为参比染料。

在本实施例中，报道分子和猝灭剂是在同一引物上，在游离状态下，该引物的所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭。图2显示，引物3’端不引入错配碱基，聚合酶无法直接切割掉标记在引物3’端的FAM基团，不能检测到信号。图3显示，其中一个引物3’端引入一个错配碱基，聚合酶可识别和切割掉标记在引物3’端错配碱基上的FAM基团，可检测到荧光信号。

在引物、模板和PCR循环设置等条件相同的条件下，用Taq DNA聚合物重复上述实验，未能检测到荧光信号。

本发明意外地发现，通过在PCR反应体系中，采用本发明的方法能够非常有效地和方便地检测样品中的目标核酸。具体的，在具有3’-5’外切活性的聚合酶存在下，采用3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团的报告引物，并且所述报告引物的3’端的两个或两个以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上;当样品中存在靶核酸时，报告引物与靶核酸发生特异性杂交，在聚合酶的作用下延伸，同时，由于聚合酶的3’-5’外切活性，5’端错配的碱基被水解，标记在所述错配的碱基上的报告基团脱落和离开淬灭基团；由此检测到报告基团的信号。

本发明提供的方法克服了现有技术的检测方法的许多缺陷，获得了更大的信号动力学和更好的准确度，并且还具有以下优点：简化设计，可以在常规引物末端加上荧光基团和错配碱基，作为对比，Taqman探针需要上下游引物和探针，对设计区域的选择和序列要求较高；其次，反应体系和材料简化：在相同情况下，在PCR反应体系中，寡核苷酸（包括引物和探针）比Taqman减少了约1/3，降低了体系内寡核苷酸相互作用的复杂程度；另外，本发明的方法使得产物检测方法可以抛弃备受诟病的开盖取样电泳，而改为闭管进行，避免了核酸样品污染和大大减少了假阳性，实现了可定量。

除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

Claims (12)

1.一种扩增、检测和定量靶核酸的方法，其包括以下步骤：

(a)将样品在聚合酶的存在下与一对引物接触，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端具有一个或一个以上与靶核酸的序列错配的核苷酸，所述报告基团标记在错配的核苷酸上；

(b)实施一个或多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤，所述杂交步骤包括使由所述引物与靶核酸特异性杂交，所述核酸延长步骤包括在所述聚合酶的催化下,引物延伸和生成自所述靶核酸衍生的扩增产物；

(c)测量报告基因的信号，由此对靶核酸进行检测和定量。

2.权利要求1的方法，其中所述具有3’-5’外切活性的聚合酶的保真性为错误率小于约1%，更优选为小于0.1%。

3.权利要求1的方法，其中所述具有3’-5’外切活性的聚合酶选自pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和Vent DNA聚合酶，优选为KOD DNA聚合酶。

4.权利要求1或2的方法，其中所述报告引物的3’端的一个核苷酸与靶核酸的序列错配。

5.权利要求1或2的方法，其中所述一对引物中的一个为报告引物。

6.权利要求1或2的方法，其中所述一对引物中的两个为报告引物。

7.权利要求1或2的方法，其中所述报告引物具有15-50个碱基，优选为18-35个碱基。

8.权利要求1或2的方法，其中所述报告基团为荧光报告基团。

9.权利要求8的方法，其中所述报告基团选自荧光素染料（例如FAM、JOE和HEX），罗丹明染料（例如R6G、TAMRA、ROX），和花青染料（例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）。

10.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭基团选自荧光素染料（例如FAM、JOE和HEX），罗丹明染料（例如R6G、TAMRA、ROX），和花青染料（例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）。

11.一种用于扩增、检测和定量靶核酸的试剂盒，其中包括聚合酶和一对引物，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的一个或以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上。

12.一种用于扩增、检测和定量靶核酸的反应混合物，其中包括待测样品，聚合酶和一对引物，所述引物与靶核酸的序列可特异性杂交，其中所述聚合酶为具有3’-5’外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3’和5’端分别标记了报告基团或淬灭基团，所述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3’端的一个或以上核苷酸与靶核酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上。