CN102399858A - 一种基于荧光淬灭解除的dna点突变检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，步骤如下：步骤1，提取待测样品的总基因组DNA；步骤2，确定待测基于的已知点突变位点，分析所要检测点突变的序列，并设计、合成标记有淬灭荧光基团的正向和反向引物；步骤3，用所述正向和反向引物对待测DNA样品进行PCR扩增，并以已知正常的DNA样品作为对照；步骤4，检测荧光基团发射波长的荧光。本发明采用具有3’~5’DNA外切活性的高保真DNA聚合酶进行PCR反应，在检测基因的点突变方面更加可靠和稳定。在多种肿瘤疾病的早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的现实意义。

Description

一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法

技术领域

本发明涉及一种DNA点突变检测方法，尤其涉及一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法。

背景技术

DNA的点突变（point mutation），也称为单碱基替换（single base substitution），是指由单个碱基改变发生的突变，在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中。人类的许多遗传性疾病都是由于基因的变异引起的，其中尤以单碱基的突变、即单碱基多态性最为普遍，所以DNA点突变与遗传疾病的关系日益受到重视。另外，随着医学科学的发展，人们已经发现许多肿瘤等疾病也起因于DNA的点突变。由于目前对这些疾病基本没有有效的治疗方法，因此，及时诊断非常重要。

因此，实现对这些DNA单碱基突变的早期、准确、简便、快速的确认，对于人类相关疾病的发病机理研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前，为了准确的检测DNA点突变，医学科学工作者作了大量的研究，并取得了瞩目的成绩，有关单碱基突变的检测方法已有许多报道。

单链构型多态性分析技术（single-strand conformation polymorphism，SSCP）是最为广泛使用的，另外还有变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient  electrophoresis，DGGE）、错配裂解法（dismate cleavage，DC）、变性高效液相色谱分析（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC）、毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）、碱基切割序列扫描（base excision sequence scanning，BESS）、等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide hybridization，ASOH）、测序（sequencing）、等位基因特异性扩增（allele-specific amplification，ASA）等技术。这些技术是通过建立一系列电泳，分析DNA构象或接连特性，或者利用DNA变性和复性等特性，来进行DNA突变的分析。

但是这些传统的方法普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵、且对工作人员要求较高的专业技能，因此仅能在少数实验室应用。开发一些简便、价廉、精确且易于临床推广的方法有着重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，通过设计合适的PCR引物，使引物靠近3’末端的碱基上标记报告荧光团，使3’末端标记有淬灭荧光基团，DNA发生点突变时，使用高保真DNA聚合酶将淬灭荧光基团移除，使这一引物上的报告荧光团发光。

本法明基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，步骤如下：

步骤1，提取待测样品的总基因组DNA；

步骤2，确定待测基因的已知点突变位点，在待测基因的已知点突变的位点的上游和下游区域分别选择一段序列设计正向和反向PCR引物，使其中一侧引物3’端的最后一个碱基正好在要检测的点突变的位置，使这一碱基与这一位置的正常序列一致或相匹配，并在这一引物3’端上标记淬灭荧光基团，在这一引物靠近3’端的碱基上标记报告荧光基团；

步骤3，以具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶，用所述正向和反向引物对待测DNA样品进行PCR扩增；并以已知正常的DNA样品作为对照；

步骤4，检测报告荧光基团发射波长的荧光；若检测到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中存在点突变；若检测不到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中不存在点突变。

所述步骤2中，优选地，在所要检测的点突变位置的上游区域选择一段序列作为PCR的正向引物，使这一引物长18~32碱基长；在所要检测的DNA变异碱基下游区域选择一段序列并以该序列的互补序列作为反向引物，使反向引物序列长度为18~32碱基，以使PCR扩增的片段长60~180碱基。

进一步，使反向引物3’端的最后一个碱基正好在所述要检测的DNA变异碱基的位置且与所述要检测的DNA变异碱基的位置的正常序列相匹配；在反向引物中，将靠近3’末端的一个碱基标记为报告荧光基团；将 3’末端最后一个碱基的3’碳原子标记一个淬灭荧光基团。或者使正向引物3’端的最后一个碱基正好在所述要检测的DNA变异碱基的位置且与所述要检测的DNA变异碱基的位置的正常序列相一致；在正向引物中，将靠近3’末端的一个碱基标记为报告荧光基团；将 3’末端最后一个碱基的3’碳原子标记一个淬灭荧光基团。

所述步骤3中，具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶优选为Vent DNA 聚合酶。 并优选为实时定量PCR仪进行PCR反应；

所述步骤1中，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

其中，待测DNA样品为人类正常细胞DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。如：

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。

本发明采用具有3’~5’DNA外切活性的高保真DNA聚合酶进行PCR反应，在检测基因的点突变方面更加可靠和稳定，与现有所有用于检测基因点突变方面的技术相比，本发明的检测灵敏度均具有明显优越性。在多种肿瘤疾病的早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的现实意义。

附图说明

图1为本发明DNA点突变检测方法流程图。

具体实施方式

参照图1，对本发明DNA点突变检测方法介绍如下：

实施方式（一）

    设计并合成PCR引物。

KRAS基因第12位密码子的突变能在多种癌细胞中发现。以KRAS基因第12位密码子的第一个碱基突变的检测为例，在正常序列中为G，可突变为C、A、T中任一个。

KRAS基因的部分序列，其中方框内黑体字标出的碱基（10570）为所要检测的点突变的位置。

Homo sapiens v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) on chromosome 12.

ACCESSION：NG_007524

10501 acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa acttgtggta

10561 gttggagct g  gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca gaatcatttt

10621 gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat attactggtg

在KRAS基因第12位密码子的上游选择一段序列设计正向引物；在KRAS基因第12位密码子的下游选择一段序列设计反向PCR引物，使这一侧引物3’端的最后一个碱基正好在要检测的点突变的位置，即在KRAS基因第12位密码子的第一个碱基的位置；使这一侧引物3’端的最后一个碱基是C，即使这一侧引物3’端的最后一个碱基与基因的正常序列相匹配。在这一引物3’端上标记淬灭荧光基团TAMRA，在这一引物靠近3’端的碱基上标记报告荧光基团FAM。

所设计的反向引物序列（能量转移荧光淬灭解除PCR引物）

其中，FAM为荧光基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

所设计的正向引物序列（普通引物）

5’-GAAAATGACTGAATATAAACTTGTGG-3’

实施方式（二）

用已知携带有KRAS基因第12位密码子第一个碱基突变的DNA样品作为标准样品，验证本发明的灵敏度和特异性。

步骤1，用已知正常人的基因组DNA与梯度稀释的已知携带有KRAS基因第12位密码子第一个碱基突变的DNA样品混合，作为待测DNA样品。

步骤2，设计并合成PCR引物。

    PCR引物设计方法如实施方式（一）所述。

步骤3，用步骤1所混合的DNA样品为模板，用实施方式（一）所设计并合成PCR引物，用具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶，用实时定量PCR仪进行PCR扩增；

其中，PCR扩增反应所用具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶优选为Vent DNA 聚合酶。

步骤4，检测报告荧光基团发射波长的荧光；若检测到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中存在点突变；若检测不到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中不存在点突变。

实施方式（三）

在实施方式（二）的基础上，除用实际的人类临床样品作为待测DNA样品外，其余实施与实施方式（二）一致。

所述待测DNA样品可以是人类正常细胞DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。如：

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等等。

嗜热性古核菌属（thermophilic archaea）来源的DNA聚合酶和其他一些高保真DNA聚合酶（proof reading DNA polymerase），具有3’~5’的DNA外切酶活性，最常用的如pfu DNA 聚合酶(pfu DNA polymerase)。当引物与模板DNA完全相配时，这些DNA聚合酶使引物延伸，完成PCR反应。由于引物的3’端最后一个碱基标记有荧光淬灭基团，这些荧光淬灭基团对荧光基团的淬灭作用而使荧光基团不能正常发光。当引物的3’端最后一个碱基与模板DNA不相配时，这些DNA聚合酶具有切除引物的3’端最后一个碱基的作用，然后使引物得以继续延伸。当模板DNA在要检测的位置存在突变时，引物3’端最后一个碱基与模板DNA在要检测的位置不匹配，这些DNA聚合酶就会切除引物3’端的最后一个碱基，然后使引物得以继续延伸。由于引物的3’端最后一个碱基标记有荧光淬灭基团，这些DNA聚合酶切除引物3’端的最后一个碱基的同时，也解除了荧光淬灭基团对荧光基团的淬灭作用而使荧光基团可以正常发光。并且由于PCR的扩增作用，使得荧光信号逐渐增强。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种基于荧光淬灭解除的DNA点突变检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，提取待测样品的总基因组DNA；

步骤2，确定待测基因点突变位点，在所述位点的上游和下游区域分别选择一段序列设计正向和反向PCR引物，使其中一侧引物3’端的最后一个碱基正好在要检测的点突变的位置，并使这一碱基与这一位置的正常序列一致或相匹配；在所述引物3’端上标记淬灭荧光基团，在靠近所述引物3’端的碱基上标记报告荧光基团；

步骤3，加入具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶，用所述正向和反向引物对待测DNA样品进行PCR扩增；并以已知正常的DNA样品作为对照；

步骤4，检测报告荧光基团发射波长的荧光；若检测到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中存在点突变；若检测不到所述报告荧光基团的发射波长的荧光，则所述待测DNA中不存在点突变。

2.根据全力要求1所述的检测方法，其特征在于，在所要检测的点突变位置的上游区域选择一段序列作为PCR的正向引物，使这一引物为18~32碱基长度；在所要检测的DNA变异碱基下游区域选择一段序列并以该序列的互补序列作为反向引物，使反向引物序列长度为18~32碱基；使PCR扩增的片段长80~180碱基。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，使反向引物3’端的最后一个碱基正好在所要检测的DNA变异碱基的位置且与所要检测的DNA变异碱基的位置的正常序列相匹配，并将反向引物靠近3’末端的一个碱基标记为报告荧光基团，将反向引物 3’末端最后一个碱基的3’碳原子标记一个淬灭荧光基团。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，使正向引物3’端的最后一个碱基正好在所述要检测的DNA变异碱基的位置且与所述要检测的DNA变异碱基的位置的正常序列相一致，并将正向引物靠近3’末端的一个碱基标记为报告荧光基团，将正向引物 3’末端最后一个碱基的3’碳原子标记一个淬灭荧光基团。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述具有3’~5’DNA外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA 聚合酶。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，用实时定量PCR仪进行PCR反应。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA为人类基因组DNA，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常细胞DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。