CN110699446B - 一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其应用 - Google Patents
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Abstract
本专利公开了一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其应用,rs3174298存在C/T多态性,基因型为TT时,可判断为非综合征型唇腭裂易感性个体,并在此基础上开发了其在非综合征型唇腭裂易感性诊断试剂盒中的应用。本专利所述的标志物和应用可使得非综合征型唇腭裂的诊断更加快速简便高效,可在孕早期或孕前预测高危人群,并为发现可能具有治疗价值的新型小分子药物靶标提供依据。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物医学领域,涉及一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其相关试剂盒的应用。
背景技术
唇腭裂(Orofacial clefts),是人类最常见的先天性发育缺陷之一,给患者及其家庭带来沉重的经济和心理压力。据统计,唇腭裂的发病率因民族和地区而异,其中亚洲和美洲印地安人发病率高达1/500,欧洲人为1/1000,而非洲人最低,约为1/2500。我国是世界上唇腭裂患者最多的国家之一,发病率约 1/700,位于新生儿出生缺陷的第二位,每年约有2.5万名新生唇腭裂患儿,形势非常严峻。
唇腭裂分两类:30%为伴有全身其他组织器官畸形的综合征型唇腭裂(Syndromic orofacial clefts,SOCs),由染色体异常、单基因突变及某些特定致畸剂所致;70%不伴有其他系统、器官畸形,为非综合征型唇腭裂 (Non-syndromic cleft lipwith or without cleft palate,NSCL/P),NSCL/P 属于复杂疾病,是遗传因素(家族连锁研究和双生子分析则证实NSCL/P的遗传度达到70%)和环境因素(如孕妇早期主动或被动吸烟、饮酒、维生素缺乏、病毒感染和接触射线等)共同作用的结果。NSCL/P包含非综合征型唇裂合并腭裂(Non-syndromic cleft lip with cleft palate,NSCLP)和非综合征型单纯腭裂(Non-syndromic cleft lip only,NSCLO)。
基因多态性(Genetic polymorphism)是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型(Varient)或基因型(Genotype)或等位基因(Allele),亦称遗传多态性。在已识别的遗传变异中,单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)是最为常见的变异类型,主要是指由于单个核苷酸的变异所引起的基因组DNA序列的变化。SNP一般只涉及到单个碱基的变异,这种变异可由单个碱基的转换(Transition)、颠换(Transversion) 或缺失(Deletion)等所引起,占所有己知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在,估计其总数超过300万个。
流行病学调查结果显示,环境因素对个体的影响并不完全相同,不同个体对唇腭裂具有不同的遗传易感性。这种遗传易感性往往与个体基因组中存在的遗传变异相关,大部分是由SNPs引起。因此,探寻SNPs与唇腭裂的关联来进一步寻找其易感标志,具有潜在的生物和临床意义。
发明内容
针对上述技术问题,发明人发现了rs3174298位点T等位基因与非综合征型唇腭裂的相关性,并据此开发了其在非综合征型唇腭裂易感性的辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之一是提出一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的SNP标志物。
本发明的目的之二是提供检测上述SNP标志物的特异性引物对和探针。
本发明的目的之三是提供上述SNP标志物在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之四是提供上述特异性引物对和探针在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的之五是提供非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒。
发明人通过提供一组与非综合征型唇腭裂高度相关的高特异性和敏感性的 SNP,并研制出可便于临床应用的非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒,为非综合征型唇腭裂的筛查和诊断提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
一种与非综合征型唇腭裂辅助诊断相关的SNP标志物rs3174298。
本发明提供的用于诊断非综合征型唇腭裂易感性的位点rs3174298,存在C /T多态性,当其基因型为TT时,判断个体为唇腭裂易感性个体。
本发明还提供了用于检测SNP位点基因型的试剂,所述试剂可以是采用本领域己知的任何技术检测SNP的试剂,只要其能够检测样本中rs3174298位点基因型即可。
本发明提供了一种检测rs3174298位点的方法,所述检测方法步骤如下:
(1)提取基因组DNA;
(2)使用TaqMan检测法检测rs3174298位点基因型。
本发明还提供检测所述SNP标志物的特异性引物对:正向引物序列如SEQ ID No.1所示,反向引物序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供检测所述SNP标志物的探针:探针FAM序列如SEQ ID No.3 所示,探针VIC序列如SEQ ID No.4所示。
所述SNP标志物在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
所述SNP标志物的特异性引物对在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
所述SNP标志物的探针在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用。
一种非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒,该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs3174298。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒还含有上述SNP标志物的特异性扩增引物。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒还含有上述SNP标志物的探针。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒还可以包括DNA提取常用试剂,如异丙醇或乙醇等。
在本发明的一个具体实施方案中,所述的诊断试剂盒包括:使用TaqMan检测SNP基因型所需的试剂,包括用于扩增SNP位点在内的核苷酸序列的引物,如下表所示:探针FAM为5’-CTACTAAATTTGCTTTTAATCT-3’,探针VIC为 5’-CTACTAAATTTGCCTTTAAT-3’,正向引物为5’-CCATATGTTGCAGGAAGTCAAACT-3’,反向引物为 5’-TGCAGATTTTCATACTTGATTCCAA-3’。
本发明提供的SNP标志物作为非综合征型唇腭裂辅助诊断的标志物的优越性在于:
(1)SNP是一种新型基因生物标志物,区别于传统生物标志物,稳定、微创、易于检测,将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性;
(2)SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒,可用于非综合征型唇腭裂的辅助诊断,有助于反映患者的疾病状态,为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持;
(3)通过SNP生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用,可使得非综合征型唇腭裂的诊断更加方便易行,为临床治疗效果评价奠定基础,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1表示TaqMan基因分型。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
实施例1
1.样本的选择(均为中国汉族)
发明人从徐州市第一医院、南京市儿童医院和南京医科大学附属口腔医院收集了诊断明确的无家族史散发非综合征型唇腭裂患者1,242例和无唇腭裂家族史的健康对照1,386例。所有研究对象均签署知情同意书(18岁以下者,由其监护人代签),完成相应流行病学调查,并提供1-3mL外周血标本。
2.基因组DNA提取
采用QIAGEN试剂盒提取每个研究对象的基因组DNA,经异丙醇沉淀后得到基因组DNA,DNA沉淀经AE溶解测定浓度后,稀释分装存入-20℃冰箱保存备用。
具体步骤:
(1)400μl抗凝血中加入500μl细胞裂解液CL,颠倒混匀5次;
(2)12,000rpm(13,400×g)离心1min,弃上清;
(3)重复上述1,2步骤,充分裂解细胞;
(4)加入200μl缓冲液FG与Protease K混合液,立即涡旋混匀至溶液无团块;
(5)65℃水浴15min,期间颠倒混匀数次;
(6)加入200μl异丙醇,颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA;
(7)12,000rpm(13,400×g)离心5min,弃上清;
(8)加入200μl70%乙醇,涡旋震荡5s,12,000rpm(13,400×g)离心 2min,弃上清;
(9)将离心管倒置在干净的吸水纸上至少5min,确保沉淀在管中;
(10)空气干燥DNA沉淀直至所有液体挥发干净;
(11)加入AE 50μl,4℃冰箱保存10天后,使用紫外分光计检测DNA 的浓度和纯度,依据所测浓度稀释分装,分装完成后将三种液体(原液即母液、次级母液、使用液)置于-20℃冰箱中保存备用。
3.本研究在1,242例非综合征性唇腭裂病例和1,386例对照中采用TaqMan 方法进行基因分型。
TaqMan等位基因分型技术是美国ABI公司研发的SNP分型技术,是目前较为公认的基因分型的标准之一,检测灵敏度高,分型准确,操作便捷。主要原理在PCR反应时加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因,探针的5’端标记有报告基团,为FAM、VIC,3’端标记有荧光淬灭基团。当探针序列完整的时候,报告荧光基团被淬灭,荧光基团抑制而无信号发出。随着PCR的进行,只有一条探针能特异性地与相应的模板结合,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。因此可以根据检测到的不同荧光,可以判断相应样本的SNP等位基因型。
3.1反应及质量控制
3.1.1采用TaqMan Universal PCR Master Mix(TaqMan通用PCR扩增预混试剂)和合适浓度的引物及探针进行PCR反应,使用ABI Prism 7900仪器完成目的片段扩增和基因型检测。
3.1.2探针与引物
探针及引物由南京骥骜生物公司合成。探针FAM为5’- CTACTAAATTTGCTTTTAATCT-3’,探针VIC为5’-CTACTAAATTTGCCTTTAAT-3’,正向引物为5’-CCATATGTTGCAGGAAGTCAAACT-3’,反向引物为 5’-TGCAGATTTTCATACTTGATTCCAA-3’。
3.1.3实时定量PCR扩增
使用ABI 7900HT型荧光定量PCR仪进行基因分型。每个384孔反应平板中 5μl反应体系,含有MasterMix 2.0μl,正反向引物各0.25μl,TaqMan探针各0.125μl,DNA样本0.3-0.5μl,去离子水1.25μl。采用高度透光度盖膜覆盖384板,短暂离心去泡,放入ABI 7900HT荧光足量PCR仪上进行分型检测。
反应程序为:
50℃,2min仪器启动预热;95℃,10min使DNA聚合酶活化;95℃,15sec 使DNA变性;60℃,1min使引物和探针退火及延伸,共45个循环。
扩增循环结束后,读取扩增后荧光信号,运用SDS 2.0软件进行基因型判读,分型结果如图1所示。
4.结果
根据检测结果,病例组分型成功率为95.5%(1,186/1,242),对照组分型成功率为97.3%(1,348/1,386)。对照组样本中基因型CC、CT、TT基因型分布情况为40.88%、44.96%和14.17%三种基因型的分布情况符合HWE (Hardy–Weinberg equilibrium,P=0.241)。病例组中基因型CC、CT、TT基因型分布情况为36.17%、47.89%和15.94%。相加模型分析显示T等位基因显著提高了罹患非综合征型唇腭裂的风险,OR=1.14,95%Cl=1.02-1.28,与对照组相比存在显著统计学差异(P=0.019)。根据显性遗传模型发现,TT+CT基因型与CC基因型相比,提高了非综合征型唇腭裂易感性(P=0.015,OR=1.22, 95%CI=1.04-1.43)。
我们根据非综合征型唇腭裂不同的临床亚型进行了分层分析。相加模型分析发现rs3174298与非综合征型唇裂合并腭裂易感性存在关联(唇裂伴/不伴腭裂:P=0.031,OR=1.15,95%Cl=1.01-1.31)。非综合征型单纯唇裂显性模型显示,TT+CT基因型与CC基因型相比,提高了非综合征型单纯唇裂易感性(P=0.021, OR=1.29,95%CI=1.04-1.61)。从而证实位点rs3174298突变能够显著增加中国汉族人群唇裂伴/不伴腭裂的患病风险,该位点的检测可用于对个体罹患唇裂伴/不伴腭裂风险的预测。
表1 rs3174298与非综合征型唇腭裂及其亚型的关联研究
序列表
<110> 南京医科大学附属口腔医院
<120> 一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctactaaatt tgcttttaat ct 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctactaaatt tgcctttaat 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatatgttg caggaagtca aact 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcacatttt catacttgat tccaa 25
Claims (3)
1.检测标志物rs3174298的引物对或检测标志物rs3174298的探针在制备非综合征型唇腭裂辅助诊断试剂盒中的应用,SNP标志物rs3174298存在C/T多态性,当基因型为TT时,判断个体为非综合征型唇腭裂易感性个体。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,检测标志物rs3174298的引物对:正向引物序列如SEQ ID No.1所示;反向引物序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,检测标志物rs3174298的探针:探针FAM序列如SEQ ID No.3所示,探针VIC序列如SEQ ID No.4所示。
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