CN109207570B - 一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法 - Google Patents

一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法，包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO.1‑8、SEQ ID NO.10‑11所示片段中的至少一种，所述反向引物包括如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12所示片段中的至少一种。本发明成功构建了免DNA提取的基于等位特异性DNA酶自组装的比色新方法用于SNPs基因型快速、即时检测，并成功用于口腔拭子中MTHFR基因第677位点基因型的快速分子检测。该方法是一种快速、简便的SNPs基因分型新方法，可为个体化用药分子诊断的推广应用提供新的技术支持，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法。
背景技术
个体化用药(personalized medicine)，即药物治疗“因人而异”、“量体裁衣”，在充分考虑每个病人的遗传因素(即药物代谢基因类型)、性别、年龄、体重、生理病理特征以及正在服用的其它药物等综合情况的基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。因此，个体化用药必须依赖于药物代谢相关的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)基因型来指导合理用药。
目前，SNPs基因型的检测方法有金标准的DNA测序、高分辨率溶解曲线、限制性酶切片段多态性和一些DNA传感技术。但这些方法均需提取外周血细胞DNA，增加了交叉污染的可能性，并且该操作需要专业的实验操作人员和高要求的实验室条件，因此限制了个体化用药在基层医院或诊所的开展。为了解决以上问题，逐渐出现一些直接用全血进行PCR扩增来检测SNPs基因型，比如利用荧光共振能量转移原理的实时荧光PCR的方法，但该方法需要设计价格昂贵的荧光探针以及需要专业的荧光PCR仪进行检测。还有的方法则为直接用全血PCR后进行限制性酶切电泳检测，该方法步骤繁琐，更重要的限制条件是需要有特殊的酶切位点才能利用此方法。虽然直接利用全血进行PCR扩增减少了实验步骤，但抽血的过程仍会引起身体的不适。
因此，研究开发简单、快速、无创的SNPs基因型检测技术对个体化用药和精准治疗具有重要的临床意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法，用于解决现有技术中SNPs基因型检测方法操作繁琐、需要提取外周血细胞DNA、成本高昂等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种免DNA提取的快速SNPs基因型检测引物，包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO.1-8、SEQID NO.10-11所示片段中的至少一种，所述反向引物包括如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12所示片段中的至少一种。
本发明第二方面提供一种用于检测SNPs基因型的试剂盒，包括上述引物。
在本发明的一些实施例中，还包括DNA聚合酶。
在本发明的一些实施例中，所述DNA聚合酶选自KOD FX DNA聚合酶。
在本发明的一些实施例中，还包括酶缓冲液、dNTPs。
本发明第三方面提供上述引物或试剂盒在免DNA提取的SNPs基因型检测中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述SNPs基因型包括MTHFR基因第677位点基因型。
本发明第四方面提供免DNA提取的SNPs基因型检测的方法，包括如下步骤：
1)设计引物序列；
2)将靶物质加入到含有正向引物、反向引物、DNA聚合酶、酶缓冲液、dNTPs、水的混合液中进行PCR反应；
3)测定步骤2)所得反应液的比色信号。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，所述正向引物包括如SEQ ID NO.1-8、SEQ ID NO.10-11所示片段中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，所述反向引物包括如SEQ ID NO.9、SEQID NO.12所示片段中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，所述靶物质可选自基因组DNA、全血、白细胞、口腔上皮细胞中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，所述靶物质来源于口腔拭子。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，PCR循环条件包括预变性，然后变性、退火、延伸循环，再次延伸。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，预变性条件为95℃，5min。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，包括如SEQ ID NO.1-9所示片段的引物预变性后，按变性98℃、2min；退火68℃、30s，延伸68℃、30s，35个循环进行。
在本发明的一些实施例中，所述步骤2)中，包括如SEQ ID NO.10-12所示片段的引物预变性后，按变性98℃、2min；退火63℃-67℃、30s，延伸68℃、30s，35-45个循环进行。
在本发明的一些实施例中，所述步骤3)中，包括如SEQ ID NO.10-12所示片段引物的PCR扩增反应后，向反应液中加入hemin溶液，在室温下反应5-30分钟，形成G4/hemin DNA酶结构，加入新鲜配置的ABTS2-和30％H2O2作为底物催化显色，用紫外分光光度计测定比色信号。
在本发明的一些实施例中，所述步骤3)中，加入hemin溶液后，其终浓度为1μM。
如上所述，本发明的一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法，具有以下有益效果：本发明成功构建了免DNA提取的基于等位特异性DNA酶自组装的比色新方法，用于SNPs基因型快速、即时检测，并成功用于口腔拭子中MTHFR基因第677位点基因型的快速分子检测。该方法是一种快速、简便的SNPs基因分型新方法，可为个体化用药分子诊断的推广应用提供新的技术支持，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1-A显示为本发明实施例2中不含G4-DNA酶的等位特异性引物3’末端倒数第三个碱基错配优化的琼脂糖电泳图。
图1-B显示为本发明实施例3中采用优化后不含G4-DNA酶的等位特异性引物(WP(TT mismatch)、MP(TT mismatch)、Reverse primer)扩增基因组DNA、全血、白细胞、口腔上皮细胞的PCR产物琼脂糖电泳图。
图2-A显示为本发明实施例4中含G4-DNA酶的等位特异性引物PCR扩增产物的琼脂糖电泳图。
图2-B显示为本发明实施例4中野生型模板的比色吸光强度图。
图2-C显示为本发明实施例4中杂合子模板的比色吸光强度图。
图2-D显示为本发明实施例4中突变型模板的比色吸光强度图。
图2-E显示为本发明实施例4中野生型、杂合子、突变型模板相对应的DNA测序图。
图3-A显示为本发明实施例5中PCR循环数对检测结果的影响图。
图3-B显示为本发明实施例5中PCR退火温度对检测结果的影响图。
图3-C显示为本发明实施例5中hemin孵育时间对检测结果的影响图。
图4-A显示为本发明实施例6中野生型引物反应管中不同细胞数对检测结果的影响图。
图4-B显示为本发明实施例6中突变型引物反应管中不同细胞数对检测结果的影响图。
图5-A、5-C、5-E显示为本发明实施例7中30例口腔上皮细胞用PCR-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测的结果图。
图5-B、5-D、5-F显示为本发明实施例7中30例口腔上皮细胞用本发明方法检测的结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
等位基因特异PCR(AS-PCR)，其基本原理是根据已知点突变设计引物，其3’端碱基与突变或正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。此法已用于多种疾病的点突变的检测。
DNA酶(DNAzyme)是指具有催化性能的DNA分子，由于其具有易于复制、合成、修饰及热稳定性好、不易水解等优势，在生物模拟酶的研究中占有重要的地位。G-四链体-heminDNA酶是其中一种DNA酶，由一段富含鸟嘌呤的DNA序列，通过氢键作用形成四链螺旋结构。该结构可与氯高铁血红素(Hemin)结合形成具有辣根过氧化物酶活性的G4-DNA模拟酶，催化底物ABTS2-产生比色信号。
实施例1
构建比色生物传感器并检测SNPs基因型
1、材料与方法
(1)材料
KOD FX DNA polymerase,deoxynucleotide solution mixture(dNTPs)、PCR缓冲液购于东洋纺(日本，大阪)，chloro(protoporphyrinato)iron(III)(Hemin)和2,2′-azino-bis(3-ethylben-zothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS2-)购于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)，30％hydrogen peroxide solution(H2O2)、diethylpyrocarbonate(DEPC)、DNA oligonucleotides购于生工生物工程(上海)股份有限公司。HPLC纯化的DNA链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成修饰。实验中所用到的基因组DNA、全血、白细胞来源于重庆医科大学附属第一医院；口腔上皮细胞来源于社会人群随机抽样。
(2)检测仪器
采用美国应用生物系统公司的PCR仪进行PCR扩增；比色信号由日本岛津的UV-vis可见分光光度计检测。
(3)检测原理
针对亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)C677T多态性设计了两对含有G4-DNA酶茎环结构的等位基因特异性引物，一对引物的3’末端核苷酸与正常基因完全匹配来扩增产物，同时阻止突变基因的扩增；而另一对引物的3’末端核苷酸则与突变基因完全匹配来扩增产物，同时阻止正常基因的扩增。使用KOD FX DNA聚合酶直接扩增口腔上皮细胞。在PCR扩增的过程中打开茎环，释放出G4-DNA酶结构，可与hemin结合形成具有辣根过氧化物酶活性的DNA酶，催化底物ABTS2-产生比色信号。
2、引物的设计
引物的序列均由Primer 5引物设计软件设计，再由BLAST进行序列比对。
WP(Match)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GAG C-3’(SEQ ID NO.1)；
MP(Match)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GAG T-3’(SEQ ID NO.2)；
WP(TT mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GTG C-3’(SEQ ID NO.3)；
MP(TT mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GTG T-3’(SEQ ID NO.4)；
WP(TC mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GCG C-3’(SEQ ID NO.5)；
MP(TC mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GCG T-3’(SEQ ID NO.6)；
WP(TG mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GGG C-3’(SEQ ID NO.7)；
MP(TG mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GGG T-3’(SEQ ID NO.8)；
Reverse primer：5’-GCC CCT CAC CTG GAT GGG AAA G-3’(SEQ ID NO.9)；
G4-WP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AAGGAG AAG GTG TCT GCG GGT GC-3’(SEQ ID NO.10)；
G4-MP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AAGGAG AAG GTG TCT GCG GGT GT-3’(SEQ ID NO.11)；
G4-RP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AGCC CCT CAC CTG GAT GGG AAA G-3’(SEQ ID NO.12)。
上述序列中，下划直线部分为茎环的茎部结构碱基；倾斜碱基为额外加入的错配碱基(正向引物3’端倒数第三个碱基)；“GGG TAG GGC GGG TTG GG”为G4-DNA酶结构。
3、PCR扩增
(1)PCR反应液体系如表1所示。
表1
Figure BDA0001819113910000051
Figure BDA0001819113910000061
(2)PCR循环条件
不含G4-DNA酶引物：预变性95℃、5min；变性98℃、2min，退火/延伸68℃、30S，35个循环；延伸68℃、5min。
含G4-DNA酶引物：预变性95℃、5min；变性98℃、2min，退火65℃、30S，延伸68℃、30S，40个循环；延伸68℃、5min。
4、比色信号检测
PCR扩增反应后，向反应液中加入hemin溶液(终浓度为1μM)，在室温下反应5分钟，形成G4/hemin DNA酶结构。加入新鲜配置的ABTS2-和30％H2O2作为底物催化显色，用紫外分光光度计测定比色信号。
实施例2
等位基因特异PCR引物中额外加入的错配碱基类型的优化及其验证：
对实施例1中所设计的等位特异性引物用琼脂糖电泳进行特异性分析验证，如图1-A中第5-8条带显示，当3’末端倒数第三个碱基额外加入TT错配时，引物可特异的区分野生型模板和突变性模板；而未加错配碱基(条带2)显示突变型引物非特异扩增野生型模板；加入TC或TG错配的引物均出现副产物(条带9-16)。
如图1所示，最左边和最右边条带为DNA Marker；
条带1为3’末端倒数第三个碱基未加入错配时的野生型引物加入野生型模板；
条带2为3’末端倒数第三个碱基未加入错配时的突变型引物加入野生型模板；
条带3为3’末端倒数第三个碱基未加入错配时的野生型引物加入突变型模板；
条带4为3’末端倒数第三个碱基未加入错配时的突变型引物加入突变型模板；
条带5为3’末端倒数第三个碱基加入TT错配时的野生型引物加入野生型模板；
条带6为3’末端倒数第三个碱基加入TT错配时的突变型引物加入野生型模板；
条带7为3’末端倒数第三个碱基加入TT错配时的野生型引物加入突变型模板；
条带8为3’末端倒数第三个碱基加入TT错配时的突变型引物加入突变型模板；
条带9为3’末端倒数第三个碱基加入TC错配时的野生型引物加入野生型模板；
条带10为3’末端倒数第三个碱基加入TC错配时的突变型引物加入野生型模板；
条带11为3’末端倒数第三个碱基加入TC错配时的野生型引物加入突变型模板；
条带12为3’末端倒数第三个碱基加入TC错配时的突变型引物加入突变型模板；
条带13为3’末端倒数第三个碱基加入TG错配时的野生型引物加入野生型模板；
条带14为3’末端倒数第三个碱基加入TG错配时的突变型引物加入野生型模板；
条带15为3’末端倒数第三个碱基加入TG错配时的野生型引物加入突变型模板；
条带16为3’末端倒数第三个碱基加入TG错配时的突变型引物加入突变型模板。
实施例3
KOD FX DNA聚合酶扩增不同类型的标本验证：
由实施例2得出最适的引物序列为：WP(TT mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTGCGG GTG C-3’，MP(TT mismatch)：5’-AGG AGA AGG TGT CTG CGG GTG T-3’。下面的实验使用该引物验证KOD FX DNA聚合酶的扩增性能，如图1-B所示，KOD FX DNA聚合酶可以特异性地扩增基因组DNA(Genomic DNA)、全血(Whole Blood)、白细胞(Leukocyte)、口腔上皮细胞(Epithelial cells)。
实施例4
验证加入G4-DNA酶引物的比色方法检测SNPs基因型的可行性：
实施例2、3验证了引物的特异性和DNA酶的扩增性能，下面的实验则为将最适引物加入含有G4-DNA酶的茎环结构，验证比色方法的可行性。
G4-WP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AAGGAG AAG GTG TCT GCG GGT GC-3’；
G4-MP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AAGGAG AAG GTG TCT GCG GGT GT-3’；
G4-RP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AGCC CCT CAC CTG GAT GGG AAA G-3’。
如图2-A为加入含有G4-DNA酶茎环结构的引物特异性扩增的PCR产物用琼脂糖电泳进行分析验证，结果显示野生型引物(WP)只扩增野生型模板(WT)；突变型引物(MP)只扩增野生突变型模板(MT)；而杂合子(HT)则出现两条带；比色吸光强度图的结果进一步证明了本发明的可行性，如图2-B所示，野生型引物扩增野生型模板时才会出现比色信号(曲线a)；如图2-D所示，突变型引物扩增突变型模板时才会出现比色信号(曲线b)；而杂合子模板则均出现比色信号(如：图2-C)。图2-E显示为三种模板相对应的DNA测序图(左：野生型；中：杂合子；右：突变型)。
实施例5
检测方法的条件研究
课题组还对实验过程中几个重要的条件即PCR循环数、PCR退火温度、hemin孵育时间等进行了进一步的研究。
1.为考察PCR循环数对本方法检测结果的影响，本实验进行了不同循环数(35、40、45个循环)的PCR扩增，然后进行比色信号的检测。如图3-A可见，信噪比随着循环数的不同而不同，当循环数为40时，信噪比为最大值，说明40个循环数为最佳循环数。
2.同理，为考察PCR退火温度对本方法检测结果的影响，本实验进行了不同退火温度(63、65、67℃)的PCR扩增，然后进行比色信号的检测。如图3-B可见，PCR扩增的最佳退火温度为65℃。
3.同理，为考察hemin孵育时间对本方法检测效果的影响，本实验进行了不同的孵育时间(5、10、30min)，然后进行比色信号的检测。如图3-C可见，hemin孵育的反应时间为5min即可。
实施例6
检测方法的性能分析:
为了更好的评估本发明的检测性能，在最优实验条件下，我们将野生型引物和突变型引物的反应管分别进行了不同细胞数的比色检测。具体的，最优实验条件如下：
1.利用实施例4的引物序列：
G4-WP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AAGGAG AAG GTG TCT GCG GGT GC-3’；
G4-MP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AAGGAG AAG GTG TCT GCG GGT GT-3’；
G4-RP：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GGT T spacer18A ACC CGC CCT ACC CAA AGCC CCT CAC CTG GAT GGG AAAG-3’。
2、PCR扩增
(1)PCR反应液体系
表2
Figure BDA0001819113910000081
Figure BDA0001819113910000091
(2)PCR循环条件
不含G4-DNA酶的引物：预变性95℃、5min；变性98℃、2min，退火/延伸68℃、30S，35个循环；延伸68℃、5min。
含G4-DNA酶的引物：预变性95℃、5min；变性98℃、2min，退火65℃、30S，延伸68℃、30S，40个循环；延伸68℃、5min。
3、比色信号检测
PCR扩增反应后，向反应液中加入hemin溶液(终浓度为1μM)，在室温下反应5分钟，形成G4/hemin-DNA酶结构。加入新鲜配置的ABTS2-和30％H2O2作为底物催化显色，用紫外分光光度计测定比色信号。
图4-A为野生型引物反应管，从下向上的曲线a、b、c、d、e、f、g、h依次表示0个细胞、104个突变型细胞、200、500、800、103、104、2×104个野生型细胞的检测结果，检测实验结果显示，随着野生型细胞数量的增加，得到的比色信号强度也随之增加。同理，图4-B为突变型引物反应管，从下向上的曲线a、b、c、d、e、f、g、h依次表示0个细胞、104个野生型细胞、200、500、800、103、104、2×104个突变型细胞的检测结果，检测实验结果显示，随着突变型细胞数量的增加，得到的比色信号强度也随之增加。结果显示两个反应管均可免DNA提取直接检测低至200个白细胞。
实施例7
检测方法的临床标本分析
为评价本方法的临床实用性，我们对口腔拭子标本进行检测。具体的，收集30例口腔拭子检测，然后用实施例6所构建的SNPs基因型检测方法进行测定。该方法与CFDA批准的PCR-RFLP方法的检测结果完全一致(如图5所示)，展示了良好的特异性和临床适用性。
本发明的有益效果为：(1)本发明研制了一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法，利用比色法可实现对基因型的简单、快速、特异地检测；(2)特异性好且灵敏度高：本发明依靠设计两对含有G4-DNA酶茎环结构的等位基因特异性引物，可识别区分野生型和突变型模板，在PCR扩增的过程中打开茎环，释放出G4-DNA酶结构，可与hemin结合形成具有辣根过氧化物酶活性的DNA酶，催化底物ABTS2-产生比色信号，将扩增产物利用光学信号输出，极大地提高了检测的灵敏度。依据实际检测得出本方法可免DNA提取直接检测低至200个白细胞的MTHFR基因第677位点基因型；(3)良好的通用性：本发明提供了一种通用型的方法，可实现无创、免DNA提取的SNPs基因型检测，通过设计不同的等位特异性引物，可检测不同基因的基因型。
综上所述，本发明成功构建了免DNA提取的基于等位特异性DNA酶自组装的比色新方法，用于SNPs基因型快速、即时检测，并成功用于口腔拭子中MTHFR基因第677位点基因型的快速分子检测。该方法是一种简单、快速的SNPs基因分型新方法，可为个体化用药分子诊断的推广应用提供新的技术支持，具有广阔的临床应用前景。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 一种免DNA提取的快速SNPs基因分型新方法
<140> 201811156933.4
<141> 2018-09-30
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA(Artificial Sequence)
<400> 1
aggagaaggt gtctgcggga gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA(Artificial Sequence)
<400> 2
aggagaaggt gtctgcggga gt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA(Artificial Sequence)
<400> 3
aggagaaggt gtctgcgggt gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagaaggt gtctgcgggt gt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA(Artificial Sequence)
<400> 5
aggagaaggt gtctgcgggc gc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> DNA(Artificial Sequence)
<400> 6
aggagaaggt gtctgcgggc gt 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
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Claims (15)

1.一种免DNA提取的快速MTHFR基因第667位点基因型检测引物，其特征在于：包括正向引物和反向引物，所述正向引物由如SEQ ID NO.3所示片段和如SEQ ID NO.4所示片段组成，所述反向引物为如SEQ ID NO.9所示片段，或所述正向引物由如SEQ ID NO.10所示片段和如SEQ ID NO.11所示片段组成，所述反向引物为如SEQ ID NO.12所示片段。
2.一种用于检测MTHFR基因第667位点基因型的试剂盒，包括权利要求1所述引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶选自KOD FX DNA聚合酶。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括酶缓冲液、dNTPs。
6.根据权利要求1所述引物、权利要求2-5任意一项所述试剂盒在免DNA提取的非诊断目的MTHFR基因第667位点基因型检测中的应用。
7.一种免DNA提取的非诊断目的MTHFR基因第667位点基因分型检测新方法，包括如下步骤：
1)设计如权利要求1所述的免DNA提取的快速MTHFR基因第667位点基因型检测引物；
2)将靶物质加入含有前述步骤获得的检测引物、DNA聚合酶、酶缓冲液、dNTPs、水的混合液中进行PCR反应；
3)测定步骤2)所得反应液的比色信号。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述靶物质选自基因组DNA、全血、白细胞、口腔上皮细胞中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述靶物质来源于口腔拭子。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，PCR循环条件包括预变性，然后变性、退火、延伸循环，再次延伸。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，预变性条件为95℃，5min。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，包括如SEQ ID NO.3，SEQID NO.4，SEQ ID NO.9所示片段的引物预变性后，按变性98℃、2min；退火68℃、30s，延伸68℃、30s，35个循环进行。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，包括如SEQ ID NO.10-12所示片段的引物预变性后，按变性98℃、2min；退火63℃-67℃、30s，延伸68℃、30s，35-45个循环进行。
14.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，包括如SEQ ID NO.10-12所示片段引物的PCR扩增反应后，向反应液中加入hemin溶液，在室温下反应5-30分钟，形成G4/hemin DNA酶结构，加入新鲜配置的ABTS2-和H2O2作为底物催化显色，用紫外分光光度计测定比色信号。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：加入hemin溶液后，其终浓度为1μM。
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