CN115927356B

CN115927356B - Slc45a2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病ⅳ型诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN115927356B
Application number: CN202211129942.0A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 罗娇娇; 刘鑫林; 何博
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-09-16
Filing date: 2022-09-16
Publication date: 2024-04-30
Anticipated expiration: 2042-09-16
Also published as: CN115927356A

Abstract

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及SLC45A2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断试剂盒中的应用。本发明通过外显子组测序技术发现了c.149C>A和c.1456G>A位点复合杂合突变可以导致眼皮肤白化病Ⅳ型，其中c.1456G>A为本发明首次新发现突变，以上述突变基因为靶点制备的诊断试剂或试剂盒，可以特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断眼皮肤白化病Ⅳ型，可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为眼皮肤白化病Ⅳ型的发病机制研究奠定了重要基础，为眼皮肤白化病Ⅳ型患者的治疗提供全新的理论依据。

Description

SLC45A2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病Ⅳ 型诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及SLC45A2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断试剂盒中的应用。

背景技术

白化病(albinism)是一组调控黑色素或黑素小体合成、转运相关的基因突变导致的眼、皮肤和毛发黑色素减少或缺乏的一种遗传性的疾病，主要表现为皮肤、毛发或眼部的色素减少缺失，并且会伴有畏光、斜视、眼球震颤、视力下降等症状。

根据色素缺失受累部位、基因型和有无其他系统功能异常等临床表现分为三种类型：眼白化病(ocular albinism，OA)、眼皮肤白化病(oculocutaneous albinism，OCA)、综合征型白化病。人群中最常见的为眼皮肤白化病，这个又分为四种类型：I型白化病(OCA1)、II型白化病(OCA2)、III型白化病(OCA3)和IV型白化病(OCA4)。其中IV型白化病主要由SLC45A2基因(MIM 606202)突变所导致。从临床表型分析，不同的OCA4患者黑色素缺乏的程度变异较大，可出现轻度至重度的黑色素缺乏及相应的眼部症状，故仅从表型上OCA4难以与OCA1和OCA2相区别。

眼皮肤白化病Ⅳ型(MIM 606574)是一种常染色体隐性遗传性疾病，其致病基因SLC45A2定位于染色体5p13.2，基因全长40.1kb，包含7个外显子和6个内含子，编码530个氨基酸组成的膜相关转运蛋白(MATP)，该蛋白是一种为黑素瘤反应性T细胞所识别的抗原，故又称为AIM1基因；在黑色素细胞中，MATP可调节酪氨酸酶活性，并参与黑色素和真黑素之间的转换，在黑色素生成中发挥重要作用。目前国际白化病中心数据库迄今为止收录了数十种导致OCA4的SLC45A2基因突变，突变类型包括错义突变、插入突变、缺失突变和剪切位点突变等。SLC45A2突变在高尔基体水平破坏酪氨酸酶的加工和运输，导致人常染色体阴性遗传低色素紊乱的眼皮肤白化病Ⅳ型。

基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊眼皮肤白化病Ⅳ型的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。但目前并没有能特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群的诊断试剂盒的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了SLC45A2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断试剂盒中的应用。利用本发明提供的SLC45A2致病突变基因制备的诊断试剂盒，可以助力眼皮肤白化病Ⅳ型基因突变的筛查和诊断，可以特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种SLC45A2致病突变基因，所述SLC45A2致病突变基因包括c.1456G>A；所述c.1456G>A在登录号为NM_016180.5的7号外显子的第1456位存在G>A。

本发明还提供了一种SLC45A2致病突变体，所述SLC45A2致病突变体为复合杂合突变，包括c.149C>A和c.1456G>A；所述c.149C>A在登录号为NM_016180.5的1号外显子的第149位存在C>A突变；所述c.1456G>A在登录号为NM_016180.5的7号外显子的第1456位存在G>A突变。

本发明还提供了上述SLC45A2致病突变基因或上述SLC45A2致病突变体作为检测靶点在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述SLC45A2致病突变基因或上述SLC45A2致病突变体作为治疗靶点在制备治疗眼皮肤白化病Ⅳ型药物中的应用。

本发明还提供了扩增上述SLC45A2致病突变基因的引物对，所述引物对包括SLC45A2-2F和SLC45A2-2R；所述SLC45A2-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SLC45A2-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了扩增上述SLC45A2致病突变体的引物组，所述引物组包括引物对1和上述的引物对；所述引物对1包括SLC45A2-1F和SLC45A2-1R；所述SLC45A2-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述SLC45A2-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述的引物对或上述的引物组在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种眼皮肤白化病Ⅳ型的诊断或辅助诊断试剂，所述诊断或辅助诊断试剂包括上述的引物对或上述的引物组。

本发明还提供了一种眼皮肤白化病Ⅳ型的诊断或辅助诊断试剂盒，所述诊断或辅助诊断试剂盒包括上述的试剂和测序引物。

优选的，所述测序引物包括测序引物对1和测序引物对2组成的测序引物组，或者测序引物2；所述测序引物对1包括SLC45A2-Seq1F和SLC45A2-Seq1R，所述测序引物对2包括SLC45A2-Seq1F和SLC45A2-Seq1R；所述SLC45A2-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述SLC45A2-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述SLC45A2-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述SLC45A2-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

有益效果：

本发明提供了一种SLC45A2致病突变基因，所述SLC45A2致病突变基因包括c.1456G>A；所述c.1456G>A在登录号为NM_016180.5的7号外显子的第1456位存在G>A。本发明通过利用外显子测序筛选与眼皮肤白化病Ⅳ型高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得眼皮肤白化病Ⅳ型的致病基因复合杂合突变，SLC45A2:NM_016180.5:exon1:c.149C>A:p.A50E和exon7:c.1456G>A:p.A486T，其中SLC45A2:NM_016180.5:exon7:c.1456G>A:p.A486T为本发明首次新发现突变，以上述突变基因为靶点制备的诊断或辅助诊断试剂或试剂盒，可以特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断或辅助诊断眼皮肤白化病Ⅳ型，可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为眼皮肤白化病Ⅳ型的发病机制研究奠定了重要基础，为眼皮肤白化病Ⅳ型患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明提供的SLC45A2致病突变基因或致病突变体可以为眼皮肤白化病Ⅳ型的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为眼皮肤白化病Ⅳ型1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；

图2为利用Sanger测序检测1号家系c.149C>A位点基因型的结果图；

图3为利用Sanger测序检测1号家系c.1456G>A位点基因型的结果图；

图4为眼皮肤白化病Ⅳ型2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，■表示男性患者，◇表示胎儿，↗表示先证者患者；

图5为利用试剂盒检测2号家系c.149C>A位点基因型的结果图；

图6为利用试剂盒检测2号家系c.1456G>A位点基因型的结果图；

图2、图3、图5和图6中箭头所指为突变发生位置。

具体实施方式

本发明所述c.1456G>A突变指野生型SLC45A2基因的第7号外显子的第1456位G突变为A，形成SLC45A2致病突变基因；所述野生型SLC45A2基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_016180.5的序列。

本发明所述c.1456G>A突变导致所编码的蛋白质与野生型SLC45A2基因所编码的蛋白质第486氨基酸由丙氨酸(A)突变为苏氨酸(G)，记为p.A486T。

本发明筛选的SLC45A2致病突变基因可以将眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群区分开，可以作为诊断或辅助诊断眼皮肤白化病Ⅳ型的生物标志物；还可以为眼皮肤白化病Ⅳ型的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

本发明提供了一种SLC45A2致病突变体，所述SLC45A2致病突变体为复合杂合突变，包括c.149C>A和c.1456G>A；所述c.149C>A在登录号为NM_016180.5的1号外显子的第149位存在C>A突变；所述c.1456G>A在登录号为NM_016180.5的7号外显子的第1456位存在G>A突变。

本发明所述c.149C>A突变指野生型SLC45A2基因的第1号外显子的第149位C突变为A，形成SLC45A2基因突变体；所述野生型SLC45A2基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_016180.5的序列。

本发明所述c.149C>A突变导致所编码的蛋白质与野生型SLC45A2基因所编码的蛋白质第50氨基酸由丙氨酸(A)突变为谷氨酸(E)，记为p.A50E。

本发明筛选的SLC45A2致病突变体可以将眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群区分开，可以作为诊断或辅助诊断眼皮肤白化病Ⅳ型的生物标志物；还可以为眼皮肤白化病Ⅳ型的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

本发明还提供了上述方案中所述的SLC45A2致病突变基因或SLC45A2致病突变体作为检测靶点在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断或辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。根据上述SLC45A2致病突变基因或SLC45A2致病突变体的基因突变位点上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针，可以将眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群区分开。

本发明还提供了上述方案中所述的SLC45A2致病突变基因或SLC45A2致病突变体作为治疗靶点在制备治疗眼皮肤白化病Ⅳ型药物中的应用。

本发明还提供了扩增上述SLC45A2致病突变基因的引物对，所述引物对包括SLC45A2-2F和SLC45A2-2R；

所述SLC45A2-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gcagcagagttgagtagtt；

所述SLC45A2-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ctgaggcaggagaatgg。

本发明提供的引物对可以特异性扩增含有c.1456G>A位点的SLC45A2基因或野生型SLC45A2基因，从而可以特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断或辅助诊断眼皮肤白化病Ⅳ型，可以提供优生优育和治疗干预指导。

本发明提供了扩增上述SLC45A2致病突变体的引物，所述引物包括引物对1和上述方案中所述的引物对；所述引物对1包括SLC45A2-1F和SLC45A2-1R；

所述SLC45A2-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ttagaggcaggaaagaat；

所述SLC45A2-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：ctccccaaccacagaat。

本发明提供的引物1可以特异性扩增含有c.149C>A位点的SLC45A2基因或野生型SLC45A2基因，上述方案中所述的引物对可以特异性扩增含有c.1456G>A位点的SLC45A2基因或野生型SLC45A2基因，从而可以特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断或辅助诊断眼皮肤白化病Ⅳ型，可以提供优生优育和治疗干预指导。

在本发明中，所述诊断或辅助诊断试剂优选还包括PCR扩增反应中的其他试剂，包括但不限于dNTPs，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶。本发明在具体实施过程中，可根据实际需要，常规选择其他试剂。

本发明还提供了一种眼皮肤白化病Ⅳ型的诊断或辅助诊断试剂盒，所述诊断或辅助诊断试剂盒包括上述试剂和测序引物。

在本发明中，所述测序引物优选测序引物对1和测序引物对2组成的测序引物组，或者测序引物2；所述测序引物对1包括SLC45A2-Seq1F和SLC45A2-Seq1R，所述测序引物对2包括SLC45A2-Seq1F和SLC45A2-Seq1R；

所述SLC45A2-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：ggtgggctcgcaggaagg；

所述SLC45A2-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：gcccacttacctgctacaac；

所述SLC45A2-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：aatccacgaagccaaaggtat；

所述SLC45A2-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：gccgggatcgtgccactg。

本发明提供的测序引物1可以特异性对含有c.149C>A位点的SLC45A2基因或野生型SLC45A2基因进行测序，引物2可以特异性对含有c.1456G>A位点的SLC45A2基因或野生型SLC45A2基因进行测序。

在本发明中，所述诊断或辅助诊断试剂盒优选还包括c.149C>A位点阳性突变参考品DNA1和c.1456G>A位点阳性突变参考品DNA2组成的复合参考品，或者c.1456G>A位点阳性突变参考品DNA2；

所述DNA1的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示：ttagaggcaggaaagaatttgagcccctcccccagcctgaccatctctgttggttgctcggccaggctccacgtcaaatccagtttgaaacacagaccctaggaccacgcaggaggtggtgggctcgcaggaaggttcctctcccagtggccatgggtagcaacagtgggcaggctggccgccacatctataaatccctagctgatgatggcccctttgactctgtggagccgcctaaaagacccaccagcagactcatcatgcacagcatggccatgttcggaagagagttctgctacgaggtggaggcagcgtatgtgaccccagtcctgctcagcgtaggtctgcccagcagcctgtacagcattgtgtggttcctcagccccatcctgggattcctgctgcagcccgtggtcggatcggccagcgaccactgccggtccaggtggggccgccggagaccctacatcctcaccctgggagtcatgatgctcgtgggcatggctctgtacctcaatggggctactgttgtagcaggtaagtgggctgcacaaggtgggcagacagggatatgtgtcttagtgtgtacctctgcaggaggaggatgttcatgtgtttgacctttcctagaaatttgttagaattgatctctcctaggttacaatgaacttcccctttgacaaatttggcccagattctgtggttggggag；

所述DNA2的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示：

gcagcagagttgagtagttatgaccagggctgtataatccacgaagccaaaggtatttactatctggctggtcacagaaaaattttgctgacctgtgccctaaatgacagttccttgtaggtcaaatggtggttctgtgcttcctttgcagaggcagcaggccccaggaggggacccagacaacagcgtgagagggaagggcatggactgcgccaccctcacatgcatggtgcagctgactcagatcctggtcggaggtggcctgggctttctggtcaacacagccgggaccgttgtcgtcgtggtgatcacagcgtctgcggtggcactgataggctgttgctttgtcgctctctttgttagatatgtggattaggtcaataaagagacaatgaccctaacctcagagacagtgaagcacatggcaggaagttaacattttctgcagctctgaatcttagggtctgcccattggacgcccactattgtgatttcagccgtggaatctgcccacctctctctctctctctctctttttttttttttttttgagatggagtcttgctctgtcacctaggctggagtgcagtggcacgatcccggctcactgcaagcttcgcctcctgggttcacaccattctcctgcctcag。

本发明优选还提供了一种鉴定上述SLC45A2致病突变体的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行测序，确定SLC45A2致病突变体的基因型。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、SLC45A2-1F或SLC45A2-2F 0.5μL、SLC45A2-1R或SLC45A2-2R 0.5μL、模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH₂O。

在本发明中，当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为SLC45A2-1F和SLC45A2-1R时，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min；

当所述PCR扩增的反应体系中的引物对为SLC45A2-2F和SLC45A2-2R时，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。

在本发明中，所述PCR缓冲液优选包括KCl500mmol/L、Tris-HCl100mmol/L和MgCl₂15mmol/L；所述Tris-HCl的pH值优选为8.3。

在本发明中，所述样本优选包括血液或羊水。

本发明优选可以根据SLC45A2基因c.149C>A和c.1456G>A位点的基因型确定提供待测样本的个体与眼皮肤白化病Ⅳ型的相关性，具体为：将测序结果和上述方案中所述的DNA1和DNA2的序列进行比较分析，若和DNA1的序列在c.149C>A位点碱基相同则表示发生c.149C>A突变，若和DNA2的序列在c.1456G>A位点碱基相同则表示发生c.1456G>A突变；

当c.1456G>A位点的基因型为野生型(即没有发生c.1456G>A突变)，c.149C>A位点的基因型为野生型(即没有发生c.149C>A突变)时，提供待测样本的个体为正常个体；

当c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A杂合突变(一个基因发生c.1456G>A突变，其等位基因没有发生c.1456G>A突变)，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A杂合突变(一个基因发生c.149C>A突变，其等位基因没有发生c.149C>A突变)，且两个发生突变的位点在两条染色体上，

或c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A纯合突变，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A杂合突变，

或c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A纯合突变，c.149C>A位点的基因型为野生型，

或c.1456G>A位点的基因型为野生型，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A纯合突变，

或c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A杂合突变，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A纯合突变，

或c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A纯合突变，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A纯合突变时，提供待测样本的个体为眼皮肤白化病Ⅳ型患者；

当c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A杂合突变，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A杂合突变，且两个发生突变的位点在同一条染色体上，

或当c.1456G>A位点的基因型为野生型，c.149C>A位点的基因型为c.149C>A杂合突变，

或c.1456G>A位点的基因型为c.1456G>A杂合突变，c.149C>A位点的基因型为野生型时，提供待测样本的个体为眼皮肤白化病Ⅳ型携带者。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的SLC45A2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断试剂盒中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(第三版；New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

样本获取

1个眼皮肤白化病Ⅳ型家系(简称1号)，家系部分成员的临床信息见表1。图1为眼皮肤白化病Ⅳ型家系图谱。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版。

主要表现为皮肤、毛发或眼部的色素减少缺失，并且会伴有畏光、斜视、眼球震颤、视力下降等症状。

表1 眼皮肤白化病Ⅳ型1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1外周血DNA用于测序分析。

外显子测序

2.仪器设备如表2所示。

表2 仪器设备一览表

3.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

4.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH8.0,0.5mol/L)	ddH₂O
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	NH₄Cl	KHCO₃	EDTA	加ddH₂O
					体积/重量	82.9g	10g	0.37g	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2MTris-HCl，pH8.2	4MNaCl	2mMEDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

5.实验步骤

签署知情同意书后，采集家系中Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1成员的外周血3～5mL作为研究样品。

5.1样本DNA提取

1)将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30min，直至溶液变透明。

如为羊水样本直接进入下一步。

2)4℃，3000rpm离心10min，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL的蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10min。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积的酚/氯仿混合液(酚:氯仿＝1:1，v/v)混匀，室温3000rpm离心10min。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5min，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

5.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

5.3结果

最终得到具有致病意义的基因复合杂合突变SLC45A2:NM_016180.5:exon1:c.149C>A:p.A50E(以下记为c.149C>A)和exon7:c.1456G>A:p.A486T(以下记为c.1456G>A)，分别来自患者的父源和母源的等位基因；其中c.1456G>A的突变为首次发现，该突变导致所编码的蛋白质第486位氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸；另c.149C>A的突变为曾经发现过的突变，该突变导致所编码的蛋白质第50位氨基酸残基由丙氨酸变为谷氨酸；在1号家系患者个体中c.149C>A和c.1456G>A位点的基因型是“c.149C>A杂合突变+c.1456G>A杂合突变”的复合杂合突变，在家系携带者个体中两位点的基因型是“c.149C>A杂合突变”或“c.1456G>A杂合突变”的单个杂合突变。

实施例2

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对c.149C>A和c.1456G>A位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)和100名家系外正常人进行c.149C>A和c.1456G>A位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提取正常人基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对突变位点c.149C>A和c.1456G>A分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表6 各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

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2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7 引物检测PCR反应体系

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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：30个循环(95℃，30s→Tm，30s→72℃，60s)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。

第三步：72℃，7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15min。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其他条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果(结果见表6)，选择其中最优两对，其中SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2作为c.149C>A位点检测用引物，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4作为c.1456G>A位点检测用引物。选择上述两对引物的原因在于：虽然表6中c.149C>A和c.1456G>A位点的引物对1和2的验证和检测结果均一致，但相对于引物对1，两个位点的引物2对设计优质测序引物则困难一些(片段较短或该片段区域的序列构成欠佳，选择优质测序引物的可能性更小)，两个位点的引物对1更有利于后续更有利于设计和筛选巢式引物(测序引物)。

3、家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

根据实施例1中步骤5.1获取1号家系人员以及家系100名家系外人员的样本DNA，按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8 突变位点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

针对c.149C>A位点，反应程序为：第一步：95℃，5min；第二步：30个循环(95℃，30s→49℃，30s→72℃，60s)；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

针对c.1456G>A位点，反应程序为：第一步：95℃，5min；第二步：30个循环(95℃，30s→50℃，30s→72℃，60s)；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(ExoI)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1min；

第二步：33个循环(96℃，30s→55℃，15s→60℃，4min)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(Ph5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；

4)室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物。

针对c.149C>A位点的测序引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，针对c.1456G>A位点的测序引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

9、结果分析

Sanger测序结果见图2和图3。由图2和图3可知，1号家系中1名患者c.149C>A和c.1456G>A位点基因型是“c.149C>A杂合突变+c.1456G>A杂合突变”的复合杂合突变；1号家系中2名携带者该位点的基因型分别是“c.149C>A杂合突变”或“c.1456G>A杂合突变”的单杂合突变。100个无血缘关系的正常对照的c.149C>A和c.1456G>A位点基因型是“野生型”。

实施例3

眼皮肤白化病Ⅳ型诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例2中的2.6所示，浓度和体积同表8；

2)缓冲液浓度和体积同表8；

3)Taq酶浓度和体积同表8；

4)dNTPs浓度和体积同表8；

5)c.149C>A和c.1456G>A阳性突变参考品DNA，c.149C>A阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如SEQ ID NO.9所示；c.1456G>A阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如SEQID NO.10所示。

6)测序引物：如SEQ ID NO.5～8所示。

2、使用方法：应用于2号家系，眼皮肤白化病Ⅳ型2号家系成员的临床信息如表10所示。

表10 眼皮肤白化病Ⅳ型2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

2号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA和Ⅱ2羊水DNA用于该试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较；步骤2)～6)的具体过程参照实施例2中的步骤3～8。测序结果见图5和图6。

试剂盒检测结果显示，2号家系中先证者c.149C>A和c.1456G>A位点基因型是“c.149C>A杂合突变+c.1456G>A杂合突变”的复合杂合突变。图5测序图中箭头所指位置显示家系中先证者和先证者母亲c.149C>A位点基因型是“c.149C>A杂合突变”杂合突变，先证者父亲和胎儿为野生型；图6测序图中箭头所指位置显示家系中先证者、先证者父亲和胎儿c.1456G>A位点基因型是“c.1456G>A杂合突变”，先证者母亲为野生型；图5和图6结果排除胎儿为眼皮肤白化病Ⅳ型患者，仅为c.1456G>A突变携带者；建议继续妊娠并做好孕期监测。

综上所述，利用本发明提供的SLC45A2致病突变体制备的诊断或辅助诊断试剂盒，可以助力眼皮肤白化病Ⅳ型基因突变的筛查和诊断或辅助诊断，可以特异性区分眼皮肤白化病Ⅳ型患者、携带者和正常人群。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种SLC45A2致病突变体，其特征在于，所述SLC45A2致病突变体为：在登录号如NM_016180.5所示的核苷酸的基础上，将第149位碱基由C突变为A和第1456位碱基由G突变为A得到。

2.引物组在制备眼皮肤白化病Ⅳ型诊断或辅助诊断的试剂或试剂盒中的应用；所述引物组由引物对1、引物对2和测序引物组成；所述引物对1由SLC45A2-1F和SLC45A2-1R组成；所述引物对2由SLC45A2-2F和SLC45A2-2R组成；所述测序引物由测序引物对1和测序引物对2组成；所述测序引物对1由SLC45A2-Seq1F和SLC45A2-Seq1R组成，所述测序引物对2由SLC45A2-Seq2F和SLC45A2-Seq2R组成；

所述SLC45A2-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述SLC45A2-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SLC45A2-2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述SLC45A2-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述SLC45A2-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述SLC45A2-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述SLC45A2-Seq2F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述SLC45A2-Seq2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。