CN115927585B

CN115927585B - WAS致病突变基因及在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN115927585B
Application number: CN202211039534.6A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 伊宁; 罗娇娇; 刘鑫林
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-08-29
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2024-04-23
Anticipated expiration: 2042-08-29
Also published as: CN115927585A

Abstract

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及WAS致病突变基因及在制备Wiskott‑Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用。本发明通过外显子组测序技术首次发现了c.230A>G或c.238delC位点突变可以导致Wiskott‑Aldrich综合征(MIM301000)，以上述突变基因为靶点制备的诊断试剂或试剂盒，可以特异性区分Wiskott‑Aldrich综合征患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断Wiskott‑Aldrich综合征，可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明提供的WAS致病突变基因可以为Wiskott‑Aldrich综合征的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

Description

WAS致病突变基因及在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及基因诊断技术领域，特别是涉及WAS致病突变基因及在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用。

背景技术

Wiskott-Aldrich综合征(WAS，MIM 301000)，是一种X连锁隐性遗传性疾病，以血小板减少伴血小板体积减小、湿疹、免疫缺陷三联征为主要表现，同时患者易患自身免疫性疾病和淋巴瘤。如不经造血干细胞移植，WAS蛋白表达阴性患者平均生存期仅15岁左右。目前WAS的估计发病率约1/100000活产儿，该病几乎只影响男性，北美地区发病率为1/250000活产男婴。

Wiskott-Aldrich综合征致病基因WAS(MIM 300392)定位于染色体Xp11.23-p11.22，基因全长7.6kb，包含12个外显子和11个内含子，编码502个氨基酸组成的的WAS蛋白(WASp)。WASp通过发夹状结构呈非活化状态。多种信号可活化WASp，打开发夹结构，促进下游肌动蛋白的多聚化和细胞骨架重塑。WASp是一种造血系统特异表达的细胞内信号传导分子和骨架蛋白，调节肌动蛋白多聚化，促进细胞骨架及免疫突触形成。目前已有超过300种WAS基因致病突变报道。错义突变是最常见的突变类型，其次为拼接位点突变、缺失突变、无义突变、插入突变和复合突变。大多数错义突变位于第1～4外显子，拼接位点突变多位于第6～10内含子，无义突变和插入/缺失、复合突变分布于整个WAS基因。

基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊Wiskott-Aldrich综合征的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。但目前并没有能特异性区分Wiskott-Aldrich综合征患者、携带者和正常人群的诊断试剂盒的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了WAS致病突变基因及在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用。利用本发明提供的WAS致病突变基因制备的诊断试剂盒，可以助力Wiskott-Aldrich综合征基因突变的筛查和诊断，可以特异性区分Wiskott-Aldrich综合征患者、携带者和正常人群。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种WAS致病突变基因，所述WAS致病突变基因包括c.230A>G和/或c.238delC；

所述c.230A>G在登录号为NM_000377.3的2号外显子的第230位存在A>G突变；

所述c.238delC在登录号为NM_000377.3的2号外显子的第238位存在C缺失突变。

本发明还提供了扩增上述WAS致病突变基因的引物对，所述引物对包括WAS-1F和WAS-1R；

所述WAS-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述WAS-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了利用上述WAS致病突变基因或上述的引物对在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种Wiskott-Aldrich综合征的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括上述的引物对。

优选的，所述诊断试剂盒还包括测序引物；所述测序引物包括WAS-Seq1F和WAS-Seq1R；

所述WAS-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述WAS-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述诊断试剂盒还包括c.230A>G位点阳性突变参考品DNA1和c.238delC位点阳性突变参考品DNA2；

所述DNA1的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述DNA2的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种鉴定上述WAS致病突变基因的基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

以待测样品DNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

将扩增产物进行测序，确定WAS致病突变基因的基因型。

优选的，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、WAS-1F 0.5μL、WAS-1R 0.5μL、模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH₂O。

优选的，所述PCR扩增的反应进程包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。

优选的，所述待测样品包括血液。

有益效果：

本发明提供了一种WAS致病突变基因，所述WAS致病突变基因包括c.230A>G和/或c.238delC；所述c.230A>G在登录号为NM_000377.3的2号外显子的第230位存在A>G突变；所述c.238delC在登录号为NM_000377.3的2号外显子的第238位存在C缺失突变。本发明通过外显子组测序技术首次发现了W AS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G和/或exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点突变可以导致Wiskott-Aldrich综合征(MIM 301000)，以上述突变基因为靶点制备的诊断试剂或试剂盒，可以特异性区分Wiskott-Aldrich综合征患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断Wiskott-Aldrich综合征，可以提供优生优育和治疗干预指导。另一方面，本发明为Wiskott-Aldrich综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为Wiskott-Aldrich综合征患者的治疗提供全新的理论依据。第三方面，本发明提供的WAS致病突变基因可以为Wiskott-Al drich综合征的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为Wiskott-Aldrich综合征1号家系遗传图谱；

图2为Wiskott-Aldrich综合征2号家系遗传图谱；

图3为利用Sanger测序检测1号家系c.230A>G位点基因型的结果图；

图4为利用Sanger测序检测2号家系c.238delC位点基因型的结果图；

图5为Wiskott-Aldrich综合征3号家系遗传图谱；

图6为Wiskott-Aldrich综合征4号家系遗传图谱；

图7为利用试剂盒检测3号家系先证者c.230A>G位点基因型的结果图；

图8为利用试剂盒检测4号家系先证者弟弟c.238delC位点基因型的结果图；

其中，图1、图2、图5和图6中，□表示男性正常个体，⊙表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；图3、4、7和8中箭头所指为突变发生位置。

具体实施方式

本发明所述c.230A>G和c.238delC为Wiskott-Aldrich综合征致病突变基因，野生型WAS基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_000377.3的序列；其中c.230A>G为登录号为NM_000377.3的2号外显子的第230位存在A>G突变，导致所编码的蛋白质第77位氨基酸残基由天冬氨酸变为甘氨酸(p.D77G)；c.238delC为登录号为NM_000377.3的2号外显子的第238位存在C缺失突变，导致所编码的蛋白质第79位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸，并造成移码突变，在后面45位氨基酸后终止(Q79Rfs*45)。

本发明筛选的WAS致病突变基因可以将Wiskott-Aldrich综合征患者、携带者和正常人群区分开，可以作为诊断Wiskott-Aldrich综合征的生物标志物，可以为Wiskott-Aldrich综合征的药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。

本发明提供了扩增上述WAS致病突变基因的引物对，所述引物对包括WAS-1F和WAS-1R；

所述WAS-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：accacgagaaccagcgact；

所述WAS-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：gggtttgcgggttgagaa。

本发明还提供了利用上述WAS致病突变基因或上述引物对在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明以上述WAS致病突变基因作为靶标，设计能诊断靶标基因型的试剂或试剂盒，可以特异性区分Wiskott-Aldrich综合征患者、携带者和正常人群，可用于快速、有效地预测或诊断Wiskott-Aldrich综合征，可以提供优生优育和治疗干预指导。

本发明还提供了一种Wiskott-Aldrich综合征的诊断试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对，优选还包括测序引物。在本发明中，所述测序引物优选包括WAS-Seq1F和WAS-Seq1R；

所述WAS-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：gaggcaggaaggaccagg；

所述WAS-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：ggtttgcgggttgagaa。

在本发明中，所述诊断试剂盒优选还包括c.230A>G位点阳性突变参考品DNA1和c.238delC位点阳性突变参考品DNA2；

所述DNA1的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.5所示：cctccaccctcctccaggaccacgagaaccagcgactctttgagatgcttggacgaaaatgcttggtgagctggggatctcctgcccccgccccgtccccaccgtttcttcctcttcctctcctccttctctctcttcccctcctcccgctcctcctttccctctccatcatctcctctcctagaatttcccgtcataatccacccttcccaggaagatctcaatgtctacttgccttccctctggctgcagctcttcctttgggcccatgactgtcatgaggcaggaaggaccaggtctggctccaagaccttgtggctacccctgaccagactccactgacccctgctttcctctcccagacgctggccactgcagttgttcagctgtacctggcgctgccccctggagctgagcactggaccaaggagcattgtggggctgtgtgcttcgtgaagggtaacccccagaagtcctacttcatccgcctttacggccttcaggtgacccccccacccccgactggacttgcaagccagttctcaacccgcaaaccc；

所述DNA2的单链核苷酸序列优选如SEQ ID NO.6所示：cctccaccctcctccaggaccacgagaaccagcgactctttgagatgcttggacgaaaatgcttggtgagctggggatctcctgcccccgccccgtccccaccgtttcttcctcttcctctcctccttctctctcttcccctcctcccgctcctcctttccctctccatcatctcctctcctagaatttcccgtcataatccacccttcccaggaagatctcaatgtctacttgccttccctctggctgcagctcttcctttgggcccatgactgtcatgaggcaggaaggaccaggtctggctccaagaccttgtggctacccctgaccagactccactgacccctgctttcctctcccagacgctggccactgcagttgttcagctgtacctggcgctgccccctggagctgagcactggaccaaggagcattgtggggctgtgtgcttcgtgaaggataaccccagaagtcctacttcatccgcctttacggccttcaggtgacccccccacccccgactggacttgcaagccagttctcaacccgcaaaccc。

将扩增产物进行测序，确定WAS致病突变基因的基因型。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括10×PCR缓冲液2μL、dNTPs 0.4μL、WAS-1F 0.5μL、WAS-1R 0.5μL、模板1μL、Taq酶0.2μL和余量的ddH₂O。

在本发明中，所述PCR扩增的反应进程优选包括：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃反应7min。

在本发明中，所述PCR缓冲液优选包括KCl 500mmol/L、Tris-HCl100mmol/L和MgCl₂15mmol/L；所述Tris-HCl的pH值优选为8.3。

在本发明中，所述样本优选包括血液。

本发明优选可以根据生物标志物的基因型确定提供待测样本的个体与Wiskott-Aldrich综合征的相关性，具体为：

当c.230A>G位点的基因型为野生型(即没有发生c.230A>G突变)，c.238delC位点的基因型为野生型(即没有发生c.238delC突变)时，提供待测样本的个体为正常个体；

当c.230A>G位点的基因型为c.230A>G半杂合突变(男性X染色体上发生c.230A>G突变)，

或c.238delC位点的基因型为c.238delC半杂合突变(男性X染色体上发生c.238delC突变)，

或c.230A>G和c.238delC位点的基因型均为半杂合突变，

或c.230A>G位点的基因型为杂合突变(女性X染色体上发生c.230A>G突变，其等位基因未发生c.230A>G突变)，c.238delC位点的基因型为c.238delC杂合突变(女性X染色体上发生c.238delC突变，其等位基因未发生c.238delC突变)，且两个发生突变的位点在两条X染色体上，

或c.230A>G位点的基因型为纯合突变(女性两条X染色体上均发生c.230A>G突变)，

或c.238delC位点的基因型为c.238delC纯合突变(女性两条X染色体上均发生c.238delC突变)，

或c.230A>G和c.238delC位点的基因型均为纯合突变时，提供待测样本的个体为Wiskott-Aldrich综合征患者；

当c.230A>G位点的基因型为杂合突变，c.238delC位点的基因型为c.238delC杂合突变，且两个发生突变的位点在同一条X染色体上，

或c.230A>G位点的基因型为c.230A>G杂合突变且c.238delC位点的基因型为野生型，

或c.238delC位点的基因型为c.238delC杂合突变且c.230A>G位点的基因型为为野生型时，提供待测样本的个体为Wiskott-Aldrich综合征携带者。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的WAS致病突变基因及在制备Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

样本获取

2个Wiskott-Aldrich综合征家系(简称1号和2号家系)，家系部分成员的临床信息见表1。图1和2显示了WAS基因突变家系图谱。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版和《罕见病诊疗指南》2019年版。

诊断基于病史、体格检查和实验室检查。根据湿疹、血小板减少、反复感染三联征伴血小板体积减少可初步诊断典型WAS。WAS蛋白缺乏或表达水平降低、WAS基因检测可明确诊断。早期男性婴儿若出现出血倾向、血小板减少伴有血小板体积减小即应该怀疑WAS可能。若伴有不同程度的湿疹表现，则更应该疑诊。

诊断标准本病尚无国内诊断标准，一般沿用泛美免疫缺陷组和欧洲免疫缺陷学会于1999年发表的国际诊断标准。

1)确定：男性，先天性血小板较少(＜70000/mm³)，血小板体积小，具备以下至少1项；

A、WAS基因突变；

B、Northern杂交证实淋巴细胞WAS mRNA缺失

C、淋巴细胞不表达WAS蛋白；

D、母系表亲具有血小板较少及血小板体积小。

2)可能：男性，先天性血小板较少(＜70000/mm³)，血小板体积小，具备以下至少1项；

A、湿疹；B、对多糖抗原的抗体应答不正常；C、反复细菌或病毒感染；D、淋巴瘤、白血病或脑肿瘤。

3)疑似：男性，先天性血小板较少(＜70000/mm³)，血小板体积小，或男性患者因血小板减少症行脾切除术，具备以下至少1项；

A、湿疹；

B、对多糖抗原的抗体应答不正常；

C、反复细菌或病毒感染；

D、自身免疫性疾病；

E、淋巴瘤、白血病或脑肿瘤。

5)临床评分系统WAS患者根据临床特点可进行病情评分，指导预后判断及治疗。国际通行按照血小板数量、血小板体积、湿疹、感染严重度、有无自身免疫性疾病和(或)恶性肿瘤6项指标评分。

1分：仅有血小板减少、MPV减小，无其他临床表现。

2分：血小板减少，MPV减小；轻度、短暂湿疹；伴或不伴轻症感染。

3分：血小板减少、MPV减小；持续但治疗有效的湿疹；反复发生需抗生素治疗的感染。

4分：除血小板异常，有持续、难以控制的湿疹和可能危及生命的感染。

5分：除血小板异常、湿疹及反复感染外，出现自身免疫性疾病和(或)恶性肿瘤。5A：伴自身免疫性疾病；5M：伴恶性肿瘤。由于WAS患者免疫缺陷等随年龄进展，2岁以下幼儿临床评分虽为1-2分，部分病例仍可进展为典型WAS。

6)遗传咨询与产前诊断。

WAS是一种X连锁隐性遗传疾病。女性携带者将致病突变位点传递给其男性后代的概率为50％。不除外发生一些新生突变。当先证者致病突变已知时，可对男性胎儿行产前诊断。可行羊毛膜、羊水细胞DNA测序、脐带血WASp流式检测等。

表1 Wiskott-Aldrich综合征1号和2号家系成员的临床信息

如图1、2所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

1号家系人员Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA用于测序。

2号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1外周血DNA用于测序。

外显子测序

2.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

3.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminatorV3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。

4.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

试剂	Tris	硼酸	EDTA(pH8.0,0.5mol/L)	ddH₂O
					体积/重量	5.4g	750mg	2mL	90mL

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

试剂	NH₄Cl	KHCO₃	EDTA	加ddH₂O
					体积/重量	82.9g	10g	0.37g	至1000mL

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

试剂	2MTris-HCl，pH8.2	4MNaCl	2mMEDTA
				体积/重量	0.5mL	10mL	0.4mL

5.实验步骤

签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ2、Ⅱ1成员及2号家系中Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1成员的外周血3～5mL作为研究样品。

5.1样本DNA提取

1)将外周血3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL 20mg/mL的蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加等体积的酚/氯仿混合液(酚:氯仿＝1:1，v/v)混匀，室温3000rpm离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

5.2外显子测序

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150～250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。

5.3结果

最终得到具有致病意义的基因突变WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G和exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45；其中exon2:c.230A>G的突变导致所编码的蛋白质第77位氨基酸残基由天冬氨酸变为甘氨酸；exon2:c.238delC的突变导致所编码的蛋白质第79位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸，并造成移码突变，在后面45位氨基酸后终止。

在1号家系患者男性个体中WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点的基因型是“C.230A>G半合子突变”，在WAS家系女性携带者个体中两位点的基因型是“C.230A>G杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。

在2号家系患者个体中WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点的基因型是“C.238delC半合子突变”，在WAS家系女性携带者个体中两位点的基因型是“C.238delC杂合突变”，在正常个体中该位点基因型为“野生型”。

实施例2

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对WAS:NM_000377.3:e xon2:c.230A>G:p.D77G和exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系2名人员(先证者、先证者母亲)、2号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)和100名家系外正常人进行WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G和exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例1的方法提取正常人基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝ma nual&source＝genome.ucsc.edu)。

2.2针对突变位点c.230A>G和c.238delC分别设计15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。

表7引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：30个循环(95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数)。

第三步：72℃，7min；

第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1～2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10～15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1)如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其他条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；

2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果(结果见表6)，选择其中最优一对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为c.238delC位点和c.230A>G位点检测用引物。

3、家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

根据实施例1中步骤5.1获取1号和2号家系人员以及两个家系100名家系外人员的样本DNA，按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8突变位点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；

第二步：30个循环(95℃，30sec→58℃，30sec→72℃，60sec)；

第三步：72℃，7min；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

试剂	用量
		PCR产物纯化后DNA	2.0μL
3.2pmol/μL测序引物	1.0μL
		BigDye	0.5μL
5×BigDye测序缓冲液	2.0μL
		ddH₂O	4.5μL

测序PCR循环条件：

第一步：96℃，1min；

第二步：33个循环(96℃，30sec→55℃，15sec→60℃，4min)；

第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/LNaAc(Ph5.2)；

2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15min；

3)3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；

4)室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物。

针对c.238delC位点和c.230A>G位点的测序引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。

9、结果分析

Sanger测序结果显示，1号家系中1名患者WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.230A>G”半合子突变；1号家系中1名携带者该位点的基因型是“C.230A>G”的杂合突变；100个无血缘关系的正常对照的WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G和exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“野生型”。图3测序图中箭头所指位置A层显示家系患者WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.230A>G”半合子突变，图3中B层显示家系中携带者WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.230A>G”杂合子突变。

Sanger测序结果显示，2号家系中1名患者WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“c.238delC”半合子突变；1号家系中1名携带者该位点的基因型是“c.238delC”的杂合突变；1名正常个体和100个无血缘关系的正常对照的WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“野生型”。图4测序图中箭头所指位置C层显示家系中患者WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“C.238delC”半合子突变，图4中B层显示家系中携带者WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“C.238delC”杂合子突变，图4中A层显示家系中正常个体WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“野生型”。

实施例3

Wiskott-Aldrich综合征诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例2中的2.6所示，浓度和体积同表8；

2)缓冲液浓度和体积同表8；

3)Taq酶浓度和体积同表8；

4)dNTPs浓度和体积同表8；

5)c.230A>G和c.238delC阳性突变参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.230A>G阳性突变参考品单链的具体序列如SEQ ID NO.5所示；

c.238delC阳性突变参考品单链的具体序列如SEQ ID NO.6所示。

6)测序引物：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

2、使用方法：应用于3号和4号家系，Wiskott-Aldrich综合征3号和4号家系成员的临床信息如表10所示。

表10 Wiskott-Aldrich综合征3号和4号家系成员的临床信息

如图5、6所示，，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。

3号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA用于该试剂盒检测。

4号家系人员Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1外周血DNA用于该试剂盒检测。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较；步骤2)～6)的具体过程参照实施例2中的步骤3～8。测序结果见图7和图8。

试剂盒检测结果显示，3号家系中先证者WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.230A>G”半合子突变。图7测序图中箭头所指位置显示家系中先证者WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.230A>G”半合子突变；先证者母亲WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.230A>G”杂合子突变；结果显示先证者为Wiskott-Aldrich综合征患者，先证者母亲为Wiskott-Aldrich综合征致病基因携带者，先证者父亲基因型为野生型，为正常个体。

试剂盒检测结果显示，4号家系中先证者WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“C.238delC”半合子突变。图8测序图中箭头所指位置显示家系中先证者WAS:NM_000377.3:exon2:c.230A>G:p.D77G位点基因型是“C.238delC”半合子突变；图8测序图中箭头所指位置显示家系中先证者母亲WAS:NM_000377.3:exon2:c.238delC:p.Q79Rfs*45位点基因型是“C.238delC”杂合突变；结果显示先证者为Wiskott-Aldrich综合征患者，先证者母亲为Wiskott-Aldrich综合征致病基因携带者。遗传咨询意见先证者建议尽早干预治疗，且患者父母以后生男孩有50％的概率为Wiskott-Aldrich综合征患者，建议以后如果妊娠，须来医院行产前诊断。

综上所述，利用本发明提供的WAS致病突变基因制备的诊断试剂盒，可以助力Wiskott-Aldrich综合征基因突变的筛查和诊断，可以特异性区分Wiskott-Aldrich综合征患者、携带者和正常人群。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种WAS致病突变基因，其特征在于，所述WAS致病突变基因为：在登录号为NM_000377.3所示的核苷酸序列的编码区中第238位碱基C缺失。

2.一种Wiskott-Aldrich综合征的辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述辅助诊断试剂盒包括引物对、测序引物和阳性突变参考品DNA2；所述引物对由WAS-1F和WAS-1R组成；所述测序引物由WAS-Seq1F和WAS-Seq1R组成；

所述WAS-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述WAS-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述WAS-Seq1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述WAS-Seq1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述阳性突变参考品DNA2的单链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。