CN117487906B

CN117487906B - Gamt基因突变体、试剂、试剂盒及应用

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Publication number: CN117487906B
Application number: CN202311850671.2A
Authority: CN
Inventors: 曾桥; 刘亚宁; 徐霞
Original assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiahui Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2043-12-29
Also published as: CN117487906A

Abstract

本发明提供了一种GAMT基因突变体、试剂、试剂盒及应用；所述基因突变体相较于野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因第2号外显子紧邻的下游内含子中，第43位碱基发生碱基G突变为碱基A，且在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C；或者，所述GAMT基因突变体相较于所述野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C。本发明首次发现所述基因突变体可以导致脑肌酸缺乏综合征，且与脑肌酸缺乏综合征的发病密切相关。

Description

GAMT基因突变体、试剂、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种GAMT基因突变体、试剂、试剂盒及应用。

背景技术

脑肌酸缺乏综合征（Cerebral creatine deficiency syndrome，CCDS；MIM612736）是一组由三种神经发育障碍（AGAT缺乏、GAMT缺乏、CRTR缺乏）引起肌酸生物合成或转运障碍的先天性遗传代谢性疾病，属于一种罕见病。脑是肌酸缺乏综合征患者的主要受累器官，患者在婴儿期就可表现出严重的神经发育迟缓和多种神经系统表型，最常见的临床症状主要是癫痫发作，智力低下，自闭症和语言发育落后。脑肌酸缺乏综合征中，CRTR缺乏最常见（男性患者占大多数），GAMT缺乏次之，AGMT缺乏最罕见；大多数患者自婴儿期以来就表现出严重的临床症状，但多数直至学龄期或青春期才被诊断出来，该病误诊率、漏诊率极高；几乎所有的脑肌酸缺乏综合征患者均表现有认知障碍和语言发育迟缓，癫痫和运动障碍在GAMT缺乏症和CRTR缺乏症患者中更为常见，肌病在GAMT缺乏症和AGAT缺乏症更为常见。GAMT和AGAT缺乏症可以通过口服肌酸补充来治疗，而CRTR缺乏症患者对这种治疗几乎没有反应。

在肌酸代谢过程中，有数个酶促反应，依照不同的酶的功能缺陷可把大脑肌酸缺乏综合征分为三类，分别是AGAT（由精氨酸甘氨酸脒基转移酶）、GAMT（胍基乙酸甲基转移酶）以及由于SLC6A8基因突变引起的CRTR-D（肌酸转运载体缺乏）。AGAT、GAMT是常染色体隐性遗传，CRTR-D是X连锁遗传。

脑肌酸缺乏综合征致病基因GAMT基因（MIM 601240）定位于染色体19p13.3，包括6个外显子和5个内含子，基因长4.5kb，编码237个氨基酸的胍基乙酸甲基转移酶（GAMT）蛋白。GAMT在肌酸合成的过程中是催化GAA合成肌酸，所以GAMT缺陷不仅会造成肌酸缺乏，而且因为GAA大量堆积而对神经系统造成损伤，所以在治疗的过程中不仅要外源性补充肌酸，还要限制精氨酸的摄入、补充大量的鸟氨酸，动态监测体液中的GAA以及肌酸含量，在治疗过程中予以调整。

因此，基因突变是导致疾病发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊脑肌酸缺乏综合征的重要遗传学标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种GAMT基因突变体、试剂、试剂盒及应用，以解决脑肌酸缺乏综合征的筛查和诊断的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种GAMT基因突变体，所述GAMT基因突变体相较于野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因第2号外显子紧邻的下游内含子中，第43位碱基发生碱基G突变为碱基A，且在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C；

或者，所述GAMT基因突变体相较于所述野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C。

本发明还提供了一种如上述任意所述的GAMT基因突变体作为检测靶点在制备脑肌酸缺乏综合征的检测试剂和/或制备脑肌酸缺乏综合征的检测试剂盒中的应用。

进一步地，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括上游引物GAMT-F1和下游引物GAMT-R1；所述上游引物GAMT-F1包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物GAMT-R1包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括上游引物GAMT-SeqF1和下游引物GAMT-SeqR1；所述上游引物GAMT-SeqF1包括如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列，所述下游引物GAMT-SeqR1包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种脑肌酸缺乏综合征的检测试剂，所述检测试剂的检测靶点包括如上述任意所述的GAMT基因突变体。

本发明还提供了一种脑肌酸缺乏综合征的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上述任意所述的检测试剂。

本发明的有益效果至少包括：

本发明提供了一种导致脑肌酸缺乏综合征的GAMT突变体蛋白，GAMT突变体蛋白包括p.K109T。本发明提供的GAMT突变体蛋白与野生型GAMT基因编码的蛋白相比，第109位氨基酸由赖氨酸（K）突变为苏氨酸（T），即错义突变。通过检测GAMT突变体蛋白在生物样品中是否存在，可以有效地检测患者是否因此患脑肌酸缺乏综合征，明确患者的分子遗传学或产前诊断、指导患者的精准治疗和优生优育。

本发明还提供了编码GAMT突变体蛋白的GAMT基因突变体，GAMT基因突变体包括327+43G>A和/或326A>C。本发明中，327+43G>A突变指野生型GAMT基因第2号外显子紧邻下游内含子第43位碱基G突变为A，形成GAMT基因突变体；326A>C指野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基A突变为C，形成GAMT基因突变体。本发明通过检测该GAMT基因突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测患者是否因此患脑肌酸缺乏综合征。

以此，本发明首次发现上述GAMT突变体蛋白和上述GAMT基因突变体可以导致脑肌酸缺乏综合征，且与脑肌酸缺乏综合征的发病密切相关；本发明确定了新的脑肌酸缺乏综合征的致病突变蛋白和突变位点，通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测患者是否因此患脑肌酸缺乏综合征，明确患者的分子遗传学或产前诊断，指导患者的精准治疗和优生优育。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1显示脑肌酸缺乏综合征1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者；

图2显示利用Sanger测序检测GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点基因型的结果图，1号家系中先证者、先证者母亲为327+43G>A杂合子突变（测序图中箭头所指为突变发生位置）；

图3显示利用试剂盒检测GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点基因型的结果图，1号家系中先证者、先证者父亲为326A>C杂合子突变（测序图中箭头所指为突变发生位置）；

图4显示脑肌酸缺乏综合征2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，表示女性携带者，■表示男性患者，↗表示先证者；

图5显示利用试剂盒检测2号家系GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点基因型的结果图，2号家系中先证者、先证者哥哥、先证者父亲为327+43G>A杂合子突变（测序图中箭头所指为突变发生位置）；

图6显示利用试剂盒检测2号家系GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点基因型的结果图，2号家系中先证者、先证者母亲为326A>C杂合子突变（测序图中箭头所指为突变发生位置）。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，术语“常染色体隐性遗传”是指父母双方常染色体上都有致病基因时，一个致病基因不会导致疾病，但若父母将致病基因都传给孩子，孩子就可能生病，与性别无关。

在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。

在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。

在本发明中，术语“纯合突变”是指等位基因均出现均发生同样突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。

在本发明中，术语“错义突变”是指是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后，变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。

在本发明中，术语“剪切突变”是指突变发生在剪接供、受体识别位点或其旁侧保守序列的突变，使正常剪接位点消失或新生剪接位点，改变RNA前体的剪接方式，使得产生的成熟RNA中含有内含子或缺失外显子序列的一类突变。

文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。

文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。

并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本发明提供了一种导致脑肌酸缺乏综合征的GAMT突变体蛋白，所述GAMT突变体蛋白包括p.K109T；具体为，所述GAMT突变体蛋白与野生型GAMT基因编码的蛋白相比，第109位氨基酸由赖氨酸（K）突变为苏氨酸（T），即错义突变。

所述GAMT突变体蛋白的氨基酸序列包括或优选为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.5具体为QTHVIP (方框内字母为突变后的氨基酸)，即所述GAMT突变体蛋白中含有的突变。本发明还提供了一种编码所述的GAMT突变体蛋白的GAMT基因突变体，所述GAMT基因突变体包括或为327+43G>A和/或326A>C。

本发明中，所述野生型GAMT基因的cDNA序列参见Genbank登录号为NM_000156.6的序列，具体序列如SEQ ID NO.44所示；所述野生型GAMT基因编码的蛋白ID号为NP_000147.1，具体序列如SEQ ID NO.45所示。

所述GAMT基因突变体中，327+43G>A对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示，327+43G>A对应编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.47所示；326A>C对应的核苷酸序列如SEQ IDNO.48所示，326A>C对应编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.49所示。

本发明针对自行收集的1例脑肌酸缺乏综合征家系（其中1号家系包括先证者、先证者父母）通过全外显子测序、家系分析联合Sanger测序验证的方法对家系进行致病变异检测和验证。确定了2个新的致病突变位点，即在1号家系中确定了GAMT基因上的327+43G>A突变和326A>C复合杂合突变，该突变可导致脑肌酸缺乏综合征的发生。

本发明首次发现了GAMT基因上的327+43G>A和326A>C两个突变位点，并确认了两个突变位点与脑肌酸缺乏综合征的密切联系，可用于脑肌酸缺乏综合征的分子遗传学研究，脑肌酸缺乏综合征相关疾病的诊断。

本发明中，327+43G>A指野生型GAMT基因第2号外显子紧邻下游内含子第43位碱基G突变为A，形成GAMT基因突变体，该突变可影响基因剪切；包含327+43G>A的所述GAMT基因突变体突变产生包括或优选为如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.6具体为5’-TCCTTGGGTGAG-3’（方框内字母为突变后碱基）；本发明包含327+43G>A的GAMT基因突变体可以引起剪切突变。326A>C指野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基A突变为C，形成GAMT基因突变体；包含326A>C的所述GAMT基因突变体突变产生包括或优选为如SEQ IDNO.7所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.7具体为5’-CACAAGGTGCC-3’（方框内字母为突变后碱基）；本发明包含326A>C的GAMT基因突变体可以引起p.K109T的突变。

即，本发明提供了一种GAMT基因突变体，所述GAMT基因突变体相较于野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因第2号外显子紧邻的下游内含子中，第43位碱基发生碱基G突变为碱基A；和/或，所述GAMT基因突变体相较于所述野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C。

本发明提供的GAMT基因突变体可以将脑肌酸缺乏综合征患者和正常人群区分开，进而此GAMT基因突变体可以作为诊断和/或筛查脑肌酸缺乏综合征的生物标志物。一方面，通过检测受试者是否携带有上述突变，用于筛查或诊断脑肌酸缺乏综合征的遗传学诊断，以指导治疗；另一方面，为脑肌酸缺乏综合征的发病机制研究奠定了重要基础，为脑肌酸缺乏综合征患者的治疗提供全新的理论依据；第三方面，本发明可以为治疗脑肌酸缺乏综合征提供可能的药物靶点。

本发明还提供了一种如上述任意所述的GAMT突变体蛋白或如上述任意所述的GAMT基因突变体作为检测靶点在制备脑肌酸缺乏综合征检测试剂和/或制备脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒中的应用。

所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒可以包括或为分子遗传学诊断试剂盒、分子遗传学筛查试剂盒，产前基因诊断试剂盒、产前基因筛查试剂盒，孕前基因诊断试剂盒、孕前基因筛查试剂盒、辅助防治脑肌酸缺乏综合征试剂盒中的一种或多种。

需说明的是，用于检测所的GAMT突变体蛋白或所述GAMT基因突变体的所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂在制备所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒中的应用，亦属于所述的GAMT基因突变体作为检测靶点在制备所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒中的应用。

所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂中通常包括引物对、探针、抗体和质谱检测试剂中的至少一种；优选包括引物对和/或探针，更优选为引物对。

本发明通过检测生物样本中是否含有327+43G>A和/或326A>C的突变，可以有效检测生物样本是否患有脑肌酸缺乏综合征，或是否易患脑肌酸缺乏综合征。本发明通过检测所述GAMT突变体蛋白在生物样本中是否表达，可以有效确证生物样本中是否患有脑肌酸缺乏综合征，或是否易患脑肌酸缺乏综合征。

本发明还提供了一种检测如上述任意所述GAMT基因突变体的扩增引物（引物对），包括上游引物GAMT-F1和下游引物GAMT-R1；所述GAMT-F1的核苷酸序列包括或为如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.1具体为：5’-CCATCGCAGCGTCAAAGGT-3’；所述下游引物GAMT-R1的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.2具体为：5’-CCGCATCCCAGCAAGTCAG-3’。

本发明还提供了一种检测如上述任意所述GAMT基因突变体的测序引物（引物对），包括上游引物GAMT-SeqF1和下游引物GAMT-SeqR1；所述上游引物GAMT-SeqF1的核苷酸序列包括或为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.3具体为：5’-CATTGGATCATCGAGTGCA-3’；所述下游引物GAMT-SeqR1的核苷酸序列包括或为如SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.4具体为5’-CTCACCCCTCACCATCAAA-3’。

本发明还提供了检测如上述任意所述GAMT基因突变体的引物组合，包括如上述任意所述的扩增引物和/或如上述任意所述的测序引物。

本发明还提供了一种如上述任意所述的引物组合在制备脑肌酸缺乏综合征检测试剂中的应用。

需说明的是，本发明中，所述脑肌酸缺乏综合征的检测靶点包括如上述任意所述的GAMT突变体蛋白和/或如上述任意所述的GAMT基因突变体，优选为所述GAMT基因突变体。

本发明还提供了一种脑肌酸缺乏综合征检测试剂，所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂的检测靶点包括如上述任意所述的GAMT基因突变体；所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂可以包括如上述任意所述的引物组合；所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂可以理解为用于诊断和/或筛查脑肌酸缺乏综合征的试剂。

所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂还可以包括PCR扩增所需要的试剂，PCR扩增所需要的试剂优选包括但不限于dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶；所述PCR缓冲液优选为10×PCR缓冲液，具体包括500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl（pH8.3）和15mmol/L MgCl₂。

所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂还可以包括DNA测序用试剂；本发明对所述DNA测序用试剂的类型没有特殊限定，采用本领域中常规DNA测序用试剂即可。

所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂中的测序引物能够对扩增所述GAMT基因突变体的引物组的扩增产物进行测序，从而判断GAMT基因上是否存在327+43G>A和/或326A>C突变位点，快速精准诊断脑肌酸缺乏综合征。

本发明还提供了一种如上述任意所述的脑肌酸缺乏综合征检测试剂在脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒及其制备中的应用。即，本发明还提供了一种脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒，所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒包括如上述任意所述的检测试剂。

所述脑肌酸缺乏综合征检测试剂盒可以包括或为分子遗传学诊断试剂盒、分子遗传学筛查试剂盒，产前基因诊断试剂盒、产前基因筛查试剂盒、孕前基因诊断试剂盒、孕前基因筛查试剂盒和辅助防治脑肌酸缺乏综合征试剂盒中的一种或多种；本发明进行所述检测时使用的样本优选包括或为血液。

为便于本领域技术人员对本发明做具体理解，本发明还提供了一种检测脑肌酸缺乏综合征的方法，包括如下步骤：采用所述GAMT基因突变体的引物对对待测样本DNA进行扩增，将扩增得到的产物进行测序和比对，结果判定。

其中，本发明对待测样本DNA的获取方法没有特殊限定，采用本领域中常规DNA提取方法即可；致病基因突变体（所述GAMT基因突变体）的引物对不再进行赘述；本发明对扩增、测序和比对的步骤和具体过程没有特殊限定，采用本领域中常规方式即可；本发明中的待测样本DNA的来源优选为血液。

将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对后，本发明中的结果判定包括：

当327+43G>A位点的基因型为野生型（即没有发生327+43G>A突变），326A>C位点的基因型为野生型（即没有发生326A>C突变）时，提供待测样本的个体为正常个体；

当327+43G>A位点的基因型为327+43G>A杂合突变（一个基因发生327+43G>A突变，其等位基因没有发生327+43G>A突变），326A>C位点的基因型为326A>C杂合突变（一个基因发生326A>C突变，其等位基因没有发生326A>C突变），且两个发生突变的位点在两条染色体上，

或327+43G>A位点的基因型为327+43G>A纯合突变，326A>C位点的基因型为326A>C杂合突变，

或327+43G>A位点的基因型为327+43G>A纯合突变，326A>C位点的基因型为野生型，

或327+43G>A位点的基因型为野生型，326A>C位点的基因型为326A>C纯合突变，

或327+43G>A位点的基因型为327+43G>A杂合突变，326A>C位点的基因型为326A>C纯合突变，

或327+43G>A位点的基因型为327+43G>A纯合突变，326A>C位点的基因型为326A>C纯合突变时，提供待测样本的个体为脑肌酸缺乏综合征患者；

当327+43G>A位点的基因型为327+43G>A杂合突变，326A>C位点的基因型为326A>C杂合突变，且两个发生突变的位点在同一条染色体上，

或当327+43G>A位点的基因型为野生型，326A>C位点的基因型为326A>C杂合突变，

或327+43G>A位点的基因型为327+43G>A杂合突变，326A>C位点的基因型为野生型时，提供待测样本的个体为脑肌酸缺乏综合征携带者。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册（第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1 SECONDEDITION；New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

样本获取

发明人发现了1个脑肌酸缺乏综合征家系（简称1号家系），该家系部分成员的临床信息见表1。图1显示了GAMT家系图谱，其中，表示男性携带者，表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者。

1.诊断标准：

可参照《人类单基因遗传疾病》2010版：

脑肌酸缺乏综合征是一组新的先天性肌酸合成或转运错误引起的临床代谢综合征，该病患者在婴幼儿期就可出现神经系统症状，主要表现为言语迟缓和智力低下（AGAT缺乏、GAMT缺乏、CRTR缺乏），以及顽固性癫痫（GAMT和CRTR缺乏），自闭症、锥体外系综合征和低张力症（GAMT缺乏）；分子生物学检测是脑肌酸缺乏综合征诊断的金标准。大脑肌酸缺乏综合征的确诊依靠基因检测，可以通过口服肌酸在早期控制症状。在定期复查中，血、尿中的肌酸值不能直接反应大脑的肌酸水平，血、尿中的肌酸值是正常的。所以在诊断及复查时对患儿进行头颅MRS检查，可帮助临床提高诊断及调整治疗方案。

表1 脑肌酸缺乏综合征1号家系成员的临床信息

如图1所示，编号采用Ⅰ（第一代）、Ⅱ（第二代）。

1号家系人员Ⅰ1（父亲）、Ⅰ2（母亲）、Ⅱ1（先证者）外周血DNA用于测序分析。

实施例2

外显子测序

1.仪器设备如表2所示。

表2仪器设备一览表

2.试剂耗材

人类全外显子测序试剂盒（Agilent）、DNA 1000试剂盒（Agilent）、96孔板（Axygen）、不同型号枪头（Axygen）、200μL离心管（Eppendorf）、1.5mL离心管（Eppendorf）、毛细管电泳缓冲液（Thermo）、测序标准物（Thermo）、无水乙醇（Thermo）、BigDyeTerminator V3.1（Thermo）、外周血gDNA提取试剂盒（TIANGEN）、琼脂糖（TIANGEN）、EB染液（Amresco）。

3.试剂配方

5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。

表3 5×TBE电泳液配方

用ddH₂O将最终体积调整为100mL。

0.5×TBE电泳液工作液，用ddH₂O稀释10倍即可。

10×红细胞裂解液按照表4配制。

表4 10×红细胞裂解液配方

高压灭菌，4℃保存。

1×细胞核裂解液按照表5配制。

表5 1×细胞核裂解液配方

4.实验步骤

签署知情同意书后，采集家1号系中Ⅰ1（父亲）、Ⅰ2（母亲）、Ⅱ1（先证者）等成员的外周血3-5mL。

4.1样本DNA提取

1)将样本装入15mL离心管中，加2~3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。

2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。

3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。

4)小心移上清至另一离心管，加酚和氯仿混合液混匀，酚：氯仿的体积比是1:1，室温3000转/分钟离心10分钟。

5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。

6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。

7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。

4.2外显子测序

参考人类全外显子测序试剂盒（Agilent）说明书和分子克隆实验室手册（第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1 SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014）操作指南。

1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；

2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；

3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；

4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；

5) NextSeq500测序仪测序和数据分析。

4.3结果

最终得到2个具有致病意义的基因突变GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:和exon2:326A>C:p.K109T；327+43G>A突变为第2号外显子紧邻的后续内含子第43位碱基G突变为A，导致剪切突变；326A>C突变是第326位碱基A突变为C，第109位氨基酸由赖氨酸（K）突变为苏氨酸（T），即错义突变。在家系患者（先证者）基因型是“327+43G>A与326A>C复合杂合突变”；家系中携带者的基因型是327+43G>A杂合突变或326A>C杂合突变。

实施例3

Sanger测序验证

对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:和exon2:326A>C:p.K109T位点进行验证。分别对实施例1中的1号系中Ⅰ1（父亲）、Ⅰ2（母亲）、Ⅱ1（先证者）等3名人员和100名家系外正常人进行GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:和exon2:326A>C:p.K109T位点基因型检测。

具体方法步骤如下：

1、DNA提取

按照实施例2的方法提基因组DNA。

2、候选引物设计、验证及优选

2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库（hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。

2.2针对327+43G>A、326A>C位点为紧邻位置，故共同设计18对候选引物（见表6），并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。

表6 327+43G>A、326A>C位点各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表

注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对；

2.3候选引物PCR验证反应

按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管（表7中序号1至8）。

表7 引物检测PCR反应体系

反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：

第一步：95℃，5min；第二步：30个循环（95℃，30sec→Tm，30sec→72℃，60sec）；（根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值）；第三步：72℃，7min；第四步：4℃直至取样时。

2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：

1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。

2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上（加石棉网）加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。

3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。

4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。

5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1~2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。

6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。

7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/ml的EB水溶液中染色10~15分钟。

8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。

2.5结果评价：

1）如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和反应体系有效性好和特异性强；

2）如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；

3）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；

4）如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；

5）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。

2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对（表6中SEQ ID NO.1和SEQID NO.2）作为突变家系检测用引物。

针对GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点及GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点的引物序列如下所示：

GAMT-F1：5’-CCATCGCAGCGTCAAAGGT-3’（SEQ ID NO.1）；

GAMT-R1：5’-CCGCATCCCAGCAAGTCAG-3’（SEQ ID NO.2）。

3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增

按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。

表8 突变位点PCR反应体系

反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环（95℃，30秒→51℃，30秒→72℃，60秒）；第三步：72℃，7分钟；

第四步：4℃直至取样时。

4、琼脂糖凝胶电泳检测

参照上述2.4步骤。

5、PCR产物酶解法纯化：5μL PCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I（Exo I），1μL碱性磷酸酶（AIP），37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。

6、BigDye反应

BigDye反应体系见表9。

表9 BigDye反应体系

测序PCR循环条件：第一步：96℃，1分钟；第二步：33个循环（96℃，30秒→62℃，15秒→60℃，4分钟）；第三步：4℃直至取样时。

7、BigDye反应产物纯化：

1)每管加入1μL 125mM EDTA（pH8.0），加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc（pH5.2）；

2)加入70μL 70％酒精，振荡混匀4次，室温放置15分钟；

3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；

4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。

8、测序

将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物（第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的）作为测序引物，针对GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A位点及GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点测序引物序列如下所示：

GAMT-SeqF1：5’-CATTGGATCATCGAGTGCA-3’（SEQ ID NO.3）；

GAMT-SeqR1：5’-CTCACCCCTCACCATCAAA-3’（SEQ ID NO.4）。

9、结果分析

图2的Sanger测序结果显示，1号家系2名成员GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点基因型是“327+43G>A杂合子”。图2测序图中箭头所指位置显示B和C层GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点基因型是“327+43G>A杂合子”突变；图2测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。

图3的Sanger测序结果显示，1号家系2名成员GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点基因型是“326A>C杂合子”。图3测序图中箭头所指位置显示A和C层GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点基因型是“326A>C杂合子”突变；图3测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。

结合图2和图3结果，先证者为“327+43G>A与326A>C复合杂合突变”，为脑肌酸缺乏综合征患者；家系其他人员为突变携带者。

实施例4

GAMT基因327+43G>A、326A>C突变诊断试剂盒及应用

1、试剂盒组成：

1)扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1~2所示的序列；2)缓冲液：10×PCR缓冲液具体组分为：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris-Cl（pH8.3），15mmol/L MgCl₂；3)Taq聚合酶；4)dNTPs；5)GAMT:327+43G>A、326A>C阳性突变参考品DNA该参考品为一段双链DNA，327+43G>A阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：5’-CCATCGCAGCGTCAAAGGTGCAGGAGGCGCCCATTGATGAG CATTGGATCATCGAGTGCA ATGACGGCGTCTTCCAGCGGCTCCGGGACTGGGCCCCACGGCAGACACACAAGGTGCCCCTCTGCCCGCAGGCCCTCCAGGACCCCCACTCCTTGGGTGAGGGCACTGCTTCCTGGGGGTTGGGGGCCTGGGGCTGTCAGAGGTGGAGGAGGTGGTCTTCTCTCTCGGGAGTCCCCCTGGCCGCTCCCTTTCTGCAGGTGGGGAGATCCTGGGGACCTCTCTACCCTGTCCTCTCTTTTTCTTTTCCCCTCTGCAAGGTCATCCCCTTGAAAGGCCTGTGGGAGGATGTGGCACCCACCCTGCCTGACGGTCACTTTGATGG TGAGGGGTGAGGGGACGTA TCACAGGGTGGGCCTCCCCAGCTCCAATGCAGCCCCTCCTTTGCTTGTGGGGGTCCCTCTGATGTGCACTGGGGGGACAGAGCCCAAGTGGGTGTGGGCCTGGCTGTGGGATGGCGGAGCACCGGGGATGGGCATGCTCACGGAGGGGCCCTGGAGGCGATCTCGGGGTTCTCAAGCCTGTGTGGGAGCCCCACCTCTACCCACGGCCCCGTCTCACTGCACCTCCACCCGCTGGGGGATGAGCCGGGTGAGGCTGGGTGAGGCGCTGAGCCCGGCCCTGACCGCGTGGGCTTCTGTTCTCCGTGCAGGGATCCTGTACGACACGTACCCACTCTCGGAGGAGACCTGGCACACACACCAGTTCAACTTCATCAAGGTGGTTCTCTCTGACTTG CTGGGATGCGG-3’（SEQ ID NO.8）

326A>C阳性突变参考品DNA具体序列如下所示：5’-CCATCGCAGCGTCAAAGGTGCAGGAGGCGCCCATTGATGAG CATTGGATCATCGAGTGCA ATGACGGCGTCTTCCAGCGGCTCCGGGACTGGGCCCCACGGCAGACACACAGGTGCCCCTCTGCCCGCAGGCCCTCCAGGACCCCCACTCCTTGGGGTGAGGGCACTGCTTCCTGGGGGTTGGGGGCCTGGGGCTGTCAGAGGTGGAGGAGGTGGTCTTCTCTCTCGGGAGTCCCCCTGGCCGCTCCCTTTCTGCAGGTGGGGAGATCCTGGGGACCTCTCTACCCTGTCCTCTCTTTTTCTTTTCCCCTCTGCAAGGTCATCCCCTTGAAAGGCCTGTGGGAGGATGTGGCACCCACCCTGCCTGACGGTCACTTTGATGG TGAGGGGTGAGGGGACGTA TCACAGGGTGGGCCTCCCCAGCTCCAATGCAGCCCCTCCTTTGCTTGTGGGGGTCCCTCTGATGTGCACTGGGGGGACAGAGCCCAAGTGGGTGTGGGCCTGGCTGTGGGATGGCGGAGCACCGGGGATGGGCATGCTCACGGAGGGGCCCTGGAGGCGATCTCGGGGTTCTCAAGCCTGTGTGGGAGCCCCACCTCTACCCACGGCCCCGTCTCACTGCACCTCCACCCGCTGGGGGATGAGCCGGGTGAGGCTGGGTGAGGCGCTGAGCCCGGCCCTGACCGCGTGGGCTTCTGTTCTCCGTGCAGGGATCCTGTACGACACGTACCCACTCTCGGAGGAGACCTGGCACACACACCAGTTCAACTTCATCAAGGTGGTTCTCTCTGACTTGCTGGGATGCGG-3’（SEQ ID NO.9）

其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为突变位点，单下划线加粗斜体碱基为上下游测序引物位置。

6)测序引物：如实施例3中SEQ ID NO.3~4所示的序列。

2、使用方法：

共筛查和检测92个脑部发育异常、生长发育落后的家系中383位个体，并再次发现如下契合本发明的脑肌酸缺乏综合征15个家系18位患者和35位携带者；现以2号家系为实施例阐述该基因突变检测试剂盒的应用（见表11）。

表10脑肌酸缺乏综合征筛查情况一览表

：经羊水穿刺和产前诊断确诊胎儿为脑肌酸缺乏综合征患者。

#：家系12和家系13中各有2名人员未行遗传学检测。

表11 脑肌酸缺乏综合征2号家系成员的临床信息

如图4所示，编号采用Ⅰ（第一代）、Ⅱ（第二代）。

2号家系人员Ⅰ1（先证者父亲）、Ⅰ2（先证者母亲）、Ⅱ1（先证者哥哥）和Ⅱ2（先证者）外周血DNA用于测序分析。

1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。

2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应；

3)对PCR扩增产物进行纯化；

4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；

5)对BiyDye反应产物纯化；

6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。

图5的试剂盒检测结果显示，2号家系1名患者GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点基因型是“326A>C杂合子”。图5测序图中箭头所指位置显示D层脑肌酸缺乏综合征患者及B层携带者GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点基因型是“326A>C杂合子”突变；图5测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。

图6的试剂盒检测结果显示，2号家系1名患者GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点基因型是“327+43G>A杂合子”。图6测序图中箭头所指位置显示D层脑肌酸缺乏综合征患者和A、C层携带者GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点基因型是“327+43G>A杂合子”突变；图6测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。结合图5与图6的检测结果确认先证者为脑肌酸缺乏综合征患者，先证者父母及哥哥为携带者。遗传咨询意见为，该先证者父母生育脑肌酸缺乏综合征的可能性为1/4，如计划再生育建议行胚胎植入前遗传学诊断和/或产前诊断。

实施例5

基因突变评级与解读（突变的致病性）

突变解读基于我们目前对脑肌酸缺乏综合征与致病基因GAMT的了解认识(https://www.omim.org/entry/2612736)，以及检测结果对受检者进行临床表型关联。突变遵从突变命名的HGVS指南（http://www.hgvs.org/），并根据 GenBank登记号命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。基因变异数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相关指南：Richards,S，et al., Standards and guidelines for the interpretation ofsequence variants:a joint consensus recommendation of the American College ofMedical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med, advance online publication 5 March 2015. doi:10.1038/gim.2015.30；以及中国《遗传变异分类标准与指南》：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等. 遗传变异分类标准与指南. 中国科学：生命科学，2017，47：668–688。

《遗传变异分类标准与指南》中遗传变异分类是基于典型的数据类型(如人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据)对变异进行五级分类，分别为：“致病的（pathogenic，P）”、“可能致病的（likely pathogenic，LP）”、“意义不明确的（variant of uncertainsignificance，VUS）”、“可能良性的（likely benign，LB）”和“良性的（benign，B）”；五级分类的判定是基于对变异的各个侧面/子项目进行解读分析后的综合评分（表12）。

表12 变异致病性判定准则

五级评定之前，需要对突变/变异的各侧面/子项进行分析/解读。其中，致病变异标准可分为：非常强(very strong，PVS1)、强(strong，PS1~4)、中等(moderate，PM1~6)、或辅助证据(supporting，PP1~5；良性变异证据可分为：独立(stand-alone，BA1)、强(strong，BS1~4)、或辅助证据(BP1~6) (见下表13)。对于一个给定的突变/变异，首先需要基于观察到的证据来选择表13中的标准，判断突变/变异各侧面/子项能满足表13中的哪几条，每条分别被评为PVS1/PS1~4/PM1~6/PP1~5/BA1/BS1~4/BP1~6中的哪个，最后再根据表12的评分规则把可满足的各条子项标准组合起来，再根据表12的组合标准从五级系统中选择一个分类；例如，如果该突变的各侧面/子项经分析后具备PVS1、PM1、PM2三条，则该突变综合评级为“致病”[即满足表12中“致病（P）”中(i)+(b)的准则]。

表13 变异判读标准及变异致病性判定准则

突变/变异各侧面/子项的分析/解读需要基于相应的生物信息分析工具（见表15）和众多可用的数据（库）（见表16），包括现有案例获得的数据，以及已有公布的数据，比如公共数据库(如ClinVar或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得。采用各种数据（库）对突变/变异进行分析时，采用的程度判断评价标准如表14所示。

表14 程度判断评价标准一览表

表15 生物信息分析工具

表16人群数据库、疾病特异性数据库和序列数据库

根据上述标准或准则，本发明中GAMT基因327+43G>A和326A>C突变评定为“致病”和“可能致病”，判断标准及具体证据如下表17：

表17 GAMT基因327+43G>A和326A>C突变致病性解读

AR：指常染色体隐性遗传

GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:p.R427变异评级证据如下：

1、PVS1：GAMT基因327+43G>A变异发生在splicing区域，即327+43G>A位内含子区域核苷酸位置碱基G突变成A，该位点为经典剪切位点，该变异影响蛋白功能；

2、PS4：结合文献和本病例，共在19名患者中检测到该变异；

3、PM2：GAMT基因327+43G>A变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库（ExAC）和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现；

4、PM3：对于隐性遗传病，该突变已在19例患者该变异的反式位置（另一条同源染色体上）检测到致病变异（即纯合突变-两条染色体上均检测到该变异）；

5、PP3：多种计算机软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响；

因此，该突变/变异的综合性证据（PVS1+PS4+PM2+PM3+PP3）符合表12中“致病（P）”评判标准(i)中(a)或(b)或(c)，在此综合判定GAMT基因327+43G>A变异为“致病”。

GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T变异评级证据如下：

1、PS4：结合文献和本病例，共在19名患者中检测到该变异；

2、PM1：326A>C突变位于热点突变区域，位于GAMT蛋白的关键功能域（该变异发生于Arginine N-methyltransferase 2-like domain功能结构域）；

3、PM2：GAMT基因326A>C变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库（ExAC）和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现；

因此，该突变/变异的综合性证据（PS4+PM1+PM2+PM3+PP3）符合表12中“可能致病（LP）”评判标准(ii)，在此综合判定GAMT基因326A>C变异为“可能致病”。

实施例6

随访及诊断试剂盒检测性能分析

对于经过产前诊断的胎儿，对其出生后情况进行了随访。并对所有个体的GAMT基因靶向捕获芯片法进行重测序分析验证（见表18与表19）。

表18 327+43G>A位点检测的性能分析结果

注：本表包含家系1的随访数据；患者和携带者中检测到的突变均列为阳性结果。

根据表1（家系1）和表10的数据可以看出，在对16个家系进行检测时发现阳性患者（19例）和携带者（18例）。上述阳性位点检测结果均通过GAMT基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现37例真阳性病例、15例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。327+43G>A变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00%，其95%CI为99.03%~100%，特异度为100%，其95%CI为99.03%~100%。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。

表19 326A>C位点检测的性能分析结果

根据家系1和表10的数据可以看出，在对16个家系进行检测时发现阳性患者（19例）和携带者（19例）。上述阳性位点检测结果均通过GAMT基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现38例真阳性病例、15例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。326A>C变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00%，其95%CI为99.03%~100%，特异度为100%，其95%CI为99.03%~100%。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。

由以上实施例可以得出：本发明确认了新的GAMT基因突变体，即包括327+43G>A和/或326A>C，且确认了新突变体与脑肌酸缺乏综合征的发病密切相关，所述基因突变体可用于脑肌酸缺乏综合征的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。

本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims

1.一种GAMT基因突变体，其特征在于，所述GAMT基因突变体相较于野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因第2号外显子紧邻的下游内含子中，第43位碱基发生碱基G突变为碱基A，且在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C；

或者，所述GAMT基因突变体相较于所述野生型GAMT基因，在所述野生型GAMT基因的第2号外显子的第326位碱基发生碱基A突变为碱基C；

其中，所述第43位碱基为GAMT:NM_000156.6:exon2:327+43G>A:位点，所述第326位碱基为GAMT:NM_000156.6:exon2:326A>C:p.K109T位点。

2.一种检测如权利要求1所述的GAMT基因突变体的试剂在制备脑肌酸缺乏综合征的检测试剂和/或制备脑肌酸缺乏综合征的检测试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括扩增引物，所述扩增引物包括上游引物GAMT-F1和下游引物GAMT-R1；所述上游引物GAMT-F1包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物GAMT-R1包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括测序引物，所述测序引物包括上游引物GAMT-SeqF1和下游引物GAMT-SeqR1；所述上游引物GAMT-SeqF1包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述下游引物GAMT-SeqR1包括如SEQID NO.4所示的核苷酸序列。