CN117487907B - Kcnh2基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

Kcnh2基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种KCNH2基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用。KCNH2基因突变体相较于野生型KCNH2基因，在所述野生型KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基由碱基A突变为碱基T。本发明的KCNH2基因突变体丰富了II型长QT综合征的致病突变谱，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断II型长QT综合征的致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，为II型长QT综合征患者的治疗提供全新的理论依据，可以为治疗II型长QT综合征提供可能的药物靶点。

Description

KCNH2基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及检测试剂领域，尤其涉及一种KCNH2基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用。
背景技术
遗传性长QT综合征(LQTS)是一种常染色体遗传性心脏病。心电图上表现为QTc延长，T波改变，尖端扭转型室性心动过速(TdP)。该病多见于儿童和青年，临床上可表现为心慌、晕厥、抽搐甚至猝死；死亡率高，未经治疗的患者10年死亡率约50%。遗传性LQTS在遗传学上分为8种类型，II型遗传性LQTS(MIM 613688)是临床上的常见类型，此型是一种常染色体显性遗传性疾病，其临床特点为大多数患者心脏事件多在运动(如跑步)、情绪激动(如恐惧、生气和惊吓)时诱发，尤其是惊醒时诱发。近年来随着分子遗传学的发展已明确遗传性LQTS是由于编码离子通道蛋白和细胞骨架蛋白的基因异常造成的，包括编码钠离子通道的基因SCN5A、编码钾离子通道亚单位的基因KCNQ1、KCNH2（MIM 152427）、KCNE1、KCNE2、 KCNJ2、细胞骨架蛋白基因ANK2和钙通道基因Cav2.1。
基因突变是导致II型长QT综合征发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊II型长QT综合征的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，研发检测方法，确定突变位点，助力II型长QT综合征基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗，具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种KCNH2基因突变体、突变体蛋白、试剂、试剂盒及应用，以解决II型长QT综合征的筛查和检测的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种KCNH2基因突变体，所述KCNH2基因突变体相较于野生型KCNH2基因，在所述野生型KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基由碱基A突变为碱基T。
本发明还提供了一种KCNH2突变体蛋白，所述KCNH2突变体蛋白相较于野生型KCNH2基因编码的蛋白，第93位氨基酸由赖氨酸突变为终止密码子。
本发明还提供了一种如上所述的KCNH2基因突变体作为检测靶点在制备II型长QT综合征检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
进一步地，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括KCNH2基因突变体的扩增引物，所述扩增引物包括上游引物KCNH2-1F和下游引物KCNH2-1R；所述上游引物KCNH2-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物KCNH2-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步地，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括KCNH2基因突变体的测序引物，所述测序引物包括上游引物KCNH2-Seq1F和下游引物KCNH2-Seq1R；所述上游引物KCNH2-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物KCNH2-Seq1R包括如SEQID NO.4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种如上所述的KCNH2突变体蛋白作为检测靶点在制备II型长QT综合征检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种II型长QT综合征检测试剂和/或检测试剂盒，所述检测试剂和/或所述检测试剂盒的检测靶点包括如上所述的KCNH2基因突变体或如上所述的KCNH2突变体蛋白。
本发明达到的有益效果：
本发明首次发现了野生型KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基由碱基A突变为碱基T可以导致II型长QT综合征，家系中未患病成员检测该突变结果为阴性。本发明的KCNH2基因突变体丰富了II型长QT综合征的致病突变谱，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断II型长QT综合征的致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，为II型长QT综合征患者的治疗提供全新的理论依据，可以为治疗II型长QT综合征提供可能的药物靶点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为II型长QT综合征1号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，表示死亡男性个体，/>表示死亡可疑女性患者，↗表示先证者；
图2为利用Sanger测序检测1号家系KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点基因型的结果图，其中，B和D层：1号家系中杂合子突变者；A和C层：1号家系中基因型为野生型（测序图中箭头所指为突变发生位置）；
图3为II型长QT综合征2号家系遗传图谱；其中，□表示男性正常个体，○表示女性正常个体，■表示男性患者，●表示女性患者，↗表示先证者；
图4为利用试剂盒检测2号家系先证者KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点基因型的结果图；其中，A和C层：2号家系中杂合子突变者；B和D层：2号家系中基因型为野生型（测序图中箭头所指为突变发生位置）。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施方式，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
并且，本发明各个实施方式之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
在本发明中，术语“常染色体显性遗传”是指只要父母一方常染色体上存在致病基因，并将其传给孩子，无论孩子的另一个基因是否正常，都可能导致疾病，与性别无关。有遗传病家族史者需进行孕前产前检查，避免遗传病影响下一代。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，指基因序列或DNA序列中一个或数个(例如几个)碱基的添加、缺失和/或置换，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。术语“突变”当用于描述基因所编码的产物或者蛋白质时，“突变”指的是所述蛋白质或编码产物中一个或数个(例如几个)氨基酸残基的添加、缺失和/或置换。
文中术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
文中术语“纯合突变”是指等位基因均出现均发生同样突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
文中术语“无义突变”是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。即：编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后，变成不编码任何氨基酸的终止密码UAA、UAG或UGA。虽然无义突变并不引起氨基酸编码的错误，但由于终止密码出现在一条mRNA的中间部位，就使翻译时多肽链的终止就此终止，形成一条不完整的多肽链。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“产前诊断”是指在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增KCNH2基因是指，在PCR反应中引物只扩增KCNH2基因，而不扩增其他基因。
为了解决II型长QT综合征的筛查和检测的技术问题，本发明提供了一种KCNH2基因突变体，KCNH2基因突变体相较于野生型KCNH2基因，在野生型KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基由碱基A突变为碱基T。
需要说明的是，II型长QT综合征致病基因KCNH2（MIM 152427）定位于染色体7q36.1，基因全长33.4kb，包含15个外显子和14个内含子，编码含1159个氨基酸的KCNH2蛋白，KCNH2编码快速激活的延迟整流钾电流(Ikr)通道的α亚单位,该亚单位有6个跨膜片段和1个孔区(pore region)。Ikr通道由4个α亚单位和若干β亚单位组成,Ikr外向钾电流是人类心肌细胞动作电位3相快速复极期的主要复极电流，致病突变使Kv11.1通道的功能降低或丧失，从而延长QT间期，导致II型长QT综合征：基础电生理研究显示KCNH2突变使心脏复极钾电流减少,导致QT间期延长；某些情况下,突变亚单位无功能,与野生型亚单位共表达时(如发生在患者细胞内)电流可能减少50%或更多。另一些情况,突变亚单位具有“负显性”作用,不仅本身不产生电流,而且影响与之共表达的野生型亚单位的转运和功能,使Ikr更加减少。基因库中收录的KCNH2突变达200多种,这些突变常位于通道的跨膜区、孔区和CNB结构域。
具体地，登录号为NM_000238.4的KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基A突变为T，表示为c.277A>T。其产生包括SEQ ID NO.5（5’-GAGCGCAAGTGG-3’）所示的核苷酸片段（方框内字母为突变发生处）；所述c.277A>T导致编码的KCNH2蛋白与野生型KCNH2基因编码的蛋白相比，第93位氨基酸由赖氨酸（K）突变为终止密码子（/>），即无义突变，记为KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93/>，其中突变产生的核心氨基酸的序列如SEQID NO.6所示（LGAEER/>）（方框内/>为突变后的终止密码子），造成了截短蛋白，影响正常KCNH2功能，引起II型长QT综合征，具有致病性。
其中，野生型KCNH2基因的转录本（mRNA）ID号为NM_000238.4；该野生型KCNH2基因的转录本（mRNA）序列具体如《ST.26标准序核苷酸或氨基酸序列表》中SEQ ID NO.46所示；
变异后的核酸序列（c.277A>T）具体如《ST.26标准序核苷酸或氨基酸序列表》中SEQ ID NO.47所示；
野生型KCNH2基因编码的蛋白的蛋白ID号为NP_000229.1；该野生型KCNH2基因编码的蛋白的蛋白质序列具体如《ST.26标准序核苷酸或氨基酸序列表》中SEQ ID NO.48所示；
变异后的蛋白质序列（p.K93）具体如《ST.26标准序核苷酸或氨基酸序列表》中SEQ ID NO.49所示。
本发明利用外显子测序筛选与II型长QT综合征高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，通过Sanger测序进行验证，首次发现KCNH2基因存在c.277A>T时，与II型长QT综合征相关，因此，通过检测KCNH2基因是否存在c.277A>T，能够检测II型长QT综合征。
本发明还提供了一种如上的KCNH2基因突变体作为检测靶点在制备试剂或制备试剂盒中的应用，试剂包括检测II型长QT综合征的试剂；试剂盒包括预防II型长QT综合征试剂盒、诊断II型长QT综合征试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗II型长QT综合征试剂盒中的一种或多种。
本发明还提供了一种检测II型长QT综合征的扩增引物，扩增引物包括上游引物KCNH2-1F和下游引物KCNH2-1R；上游引物KCNH2-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物KCNH2-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
具体地，扩增引物优选的上游引物KCNH2-1F（SEQ ID NO.1）和下游引物KCNH2-1R（SEQ ID NO.2）分别为：
KCNH2-1F：5’- GCCGTAAGTTCATCATCGC -3’
KCNH2-1R：5’- AAGGACCAGAGGAGCCAGA -3’
该扩增引物能够检测KCNH2基因上是否存在c.277A>T的突变位点，特异性扩增KCNH2基因突变体。具体地，该扩增引物特异性扩增含有c.277A>T突变位点的KCNH2基因突变体片段或野生型KCNH2基因片段，通过测序引物进行测序后即可区分KCNH2基因突变体和野生型KCNH2基因；通过测序引物进行测序后即可区分KCNH2基因突变体和野生型KCNH2基因。
本发明还提供了一种检测II型长QT综合征的测序引物，测序引物包括上游引物KCNH2-Seq1F和下游引物KCNH2-Seq1R；上游引物KCNH2-Seq1F包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；下游引物KCNH2-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
具体地，测序引物优选的上游引物KCNH2-Seq1F（SEQ ID NO.3）和下游引物KCNH2-Seq1R（SEQ ID NO.4）分别为：
KCNH2-Seq1F：5’-CTACTGCAACGACGGCTTCT-3’
KCNH2-Seq1R：5’-AAACCATCTCAGCAGAGTGA-3’
本发明还提供了一种检测II型长QT综合征的引物组合，包括如上的扩增引物和/或如上的测序引物。
具体地，通过该测序引物对上述扩增引物的扩增产物进行测序，可以区分KCNH2基因突变体和野生型KCNH2基因；本发明利用该测序引物对该扩增引物扩增的片段进行测序，能够快速精准诊断II型长QT综合征。
本发明还提供了一种如上的引物组合在制备检测II型长QT综合征的试剂中的应用。
进一步地，II型长QT综合征的检测靶点包括KCNH2基因突变体，KCNH2基因突变体相较于野生型KCNH2基因，在野生型KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基由碱基A突变为碱基T。本发明的KCNH2基因突变体丰富了II型长QT综合征的致病突变谱，通过检测受试者是否携带有上述突变，能够筛查或诊断II型长QT综合征的致病基因突变携带者或患者，以提供优生优育和治疗干预指导，为II型长QT综合征患者的治疗提供全新的理论依据，可以为治疗II型长QT综合征提供可能的药物靶点。
本发明还提供了一种检测II型长QT综合征的试剂，试剂包括如上的引物组合。
进一步地，试剂还包括dNTP，PCR缓冲液，镁离子和Tap聚合酶中的一种或多种。
本发明还提供了一种如上的试剂在试剂盒及其制备中的应用，试剂盒包括预防II型长QT综合征试剂盒、诊断II型长QT综合征试剂盒、孕前遗传病筛查试剂盒、产前遗传病筛查试剂盒、孕前遗传病诊断试剂盒、产前遗传病诊断试剂盒、辅助治疗II型长QT综合征试剂盒中的一种或多种。
具体地，该试剂盒通过男性个体和/或女性个体的检测样品中KCNH2基因突变体的基因型诊断个体是否患有II型长QT综合征；该检测样品优选包括血液。基因型诊断个体是否患有II型长QT综合征的标准具体为：
当个体c.277A>T位点的基因型是“c.277A>T杂合子突变，则为患者；
当个体c.277A>T位点的基因型是“c.277A>T纯合子突变”，则为患者；
当个体c.277A>T位点的基因型是“野生型”，则个体为正常人。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测II型长QT综合征的引物组合、试剂和试剂盒、KCNH2基因突变体及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010年版；
遗传性长QT综合征诊断标准：1）有晕厥史或尖端扭转型室性心动过速（TdP）发作；2）心电图QTc延长，QTc>460ms；3）心电图QTc延长，QTc>440ms，伴有心动过缓或T波异常；4)基因突变检测等遗传学证据。
2.检测对象
以1个II型长QT综合征家系（简称1号家系）为受试对象，进行检测，该1号家系部分成员的临床信息见表1，家系图谱如图1。
表1 II型长QT综合征1号家系成员的临床信息
注：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ依次表示第一代、第二代和第三代，1号家系人员Ⅱ:1、Ⅱ:2、Ⅲ:1、Ⅲ:2外周血DNA用于测序。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2 仪器设备
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒（Agilent）、DNA 1000试剂盒（Agilent）、96孔板（Axygen）、不同型号枪头（Axygen）、200μL离心管（Eppendorf）、1.5mL离心管（Eppendorf）、毛细管电泳缓冲液（Thermo）、测序标准物（Thermo）、无水乙醇 （Thermo）、BigDyeTerminator V3.1（Thermo）、外周血gDNA提取试剂盒（TIANGEN）、琼脂糖（TIANGEN）和EB染液（Amresco）。
3.试剂配方
1）5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
2）0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释表3中5×TBE电泳液贮存液10倍即可。
3）10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
4）1×细胞核裂解液配方按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅱ:1、Ⅱ:2、Ⅲ:1、Ⅲ:2成员外周血3~5mL为研究样品。
4.1样本DNA提取
1）样本3~5mL装入15mL离心管中，加2~3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
2）4℃，3000rpm离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20% SDS，摇匀，至出现黏稠透明状。加10μL 20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3）加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000rpm离心10分钟。
4）小心移上清至另一离心管，加等体积的酚和氯仿混合液（酚和氯仿的体积比为1:1）混匀，室温3000rpm离心10分钟。
5）小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6）将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7）TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
1）取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150~250bp片段；
2）DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3）连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4）Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5）NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到具有致病意义的基因突变KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93；该突变为位于第2号外显子的第277位碱基A突变为T，导致第93位氨基酸由赖氨酸（K）突变为终止密码子（/>），即无义突变。
在1号家系患者个体中KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点的基因型是“c.277A>T杂合子突变”，在1号家系正常个体中该位点基因型为“野生型”。
实施例3
Sanger测序验证
对家系外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系4名人员（先证者、先证者父亲、先证者母亲、先证者堂姐）和100名家系外正常人进行KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93/>位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1.DNA提取
按照实施例2的方法提基因组DNA。
2.候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?redirect=manual&source=genome.ucsc.edu）。
2.2针对突变位点c.277A>T设计20对候选引物（见表6），并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6 针对c.277A>T位点候选引物基本情况和验证实验结果
/>
注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类引物。
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管（表7中序号1至8）。
表7 引物检测PCR反应体系
/>
反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃预变性5min；
第二步：30个循环（95℃变性30sec→Tm退火30sec→72℃延伸60sec）；（根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数）。
第三步：72℃延伸7min；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1）用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2）称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上（加石棉网）加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3）待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4）凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5）加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1~2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6）盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7）切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10~15分钟。
8）将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描系统记录电泳结果。
2.5结果评价：
1）如果7号管仅出现一条明亮目的条带，无其条带，则判断该对引物和反应体系有效性好和特异性强；
2）如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4）如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5）如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表7验证测试后统计的结果，选择表6中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为针对KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点的扩增引物。
KCNH2-1F：5’- GCCGTAAGTTCATCATCGC-3’（SEQ ID NO.1）
KCNH2-1R：5’- AAGGACCAGAGGAGCCAGA-3’（SEQ ID NO.2）
3、1号家系人员和100名家系外人员突变位点PCR扩增
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8 突变点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，针对c.277A>T位点执行以下反应程序：
第一步：95℃预变性5min；
第二步：30个循环（95℃变性30sec→56℃退火30sec→72℃延伸60sec）；
第三步：72℃延伸7min；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I（Exo I），1μL碱性磷酸酶（AIP），37℃消化15min，85℃使酶失活15min。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
测序PCR循环条件：
第一步：96℃预变性1min；
第二步：33个循环（96℃变性30sec→55℃退火15sec→60℃延伸4min）；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1）每管加入1μL 125mM EDTA（pH8.0），加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc（pH5.2）；
2）加入70μL 70％酒精，振荡混匀4次，室温放置15min；
3）3000g，4℃离心30min；马上倒置96孔板，185g离心1min；
4）室温放置5min，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μL Hi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4min，迅速置冰上4min，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序，测序引物则在上述SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的基础上设计巢式引物（第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的）作为测序引物，引物序列如下所示。
针对KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点的测序引物序列如下所示：
KCNH2-Seq1F：5’-CTACTGCAACGACGGCTTCT-3’（SEQ ID NO.3）
KCNH2-Seq1R：5’-AAACCATCTCAGCAGAGTGA-3’（SEQ ID NO.4）；
9、结果分析
针对KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点的测序结果如图2所示。根据图2可以看出1号家系中2名患者KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93/>位点基因型是“c.277A>T”杂合子突变；1号家系中2名正常个体及100个无血缘关系的正常对照的KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93/>位点基因型是“野生型”。
实施例4
II型长QT综合征诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
试剂盒1：1）扩增引物：如实施例3中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；2）PCR缓冲液（10×PCR缓冲液，由KCl 500mmol/L、Tris-HCl（pH8.3）100mmol/L和MgCl215mmol/L组成）；3）Taq酶（20U）；4）dNTPs（四种dNTP各4mM）；5）c.277A>T阳性参考品DNA，该参考品为一段双链DNA，c.277A>T突变位点阳性参考品的具体序列如SEQ ID NO.7所示，具体的：5’-GCCGTAAG TTCATCATCGCCAACGCTCGGGTGGAGAACTGCGCCGTCAT CTACTGCAACGACGGCTTCT GCGAGCTGTGCGGCTACTCGCGGGCCGAGGTGATGCAGCGACCCTGCACCTGCGACTTCCTGCACGGGCCGCGCACGCAGCGCCGCGCTGCCGCGCAGATCGCGCAGGCACTGCTGGGCGCCGAGGAGCGCAAGTGGAAATCGCCTTCTACCGGAAAGATGgtaggagcgggccggggcggggccacgaccaggggcggggtcaagaggggcgggaccacggcgaggggcagggtgcgtgggggtgtgggggtgtgggggcggctggagaacgccccgagcccgggcagggttctgtgggggtgtgacgcgggcgggggccctgcggtgtgcctgtgggaggcgcggttccggggcctgcgcc tcactctgctgagatggttt tcaggagggcaaaggagttgctaggctgtgggtctggctcctctggtcctt-3’，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框为突变位点，单下划线加粗斜体碱基为上下游测序引物位置，小写字母为内含子区域序列，大写字母为外显子区域序列；6）测序引物：如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2、使用方法：
共筛查和检测66个晕厥史、心脏病家系中233位个体，并再次发现如下契合本发明的18个家系41位患者（见表10）；现以2号家系为实施例阐述该基因突变检测试剂盒的应用。2号家系临床信息如表11所示，2号家系图谱如图3。
表10 II型长QT综合征筛查情况一览表
表11 II型长QT综合征2号家系成员的临床信息
注：Ⅰ、Ⅱ依次表示第一代、第二代。
2号家系人员Ⅰ:1、Ⅰ:2、Ⅱ:1、Ⅱ:2成员外周血DNA用于该试剂盒1检测；步骤如下：
1）基因组DNA提取：按照实施例2步骤提取样本基因组DNA；
2）先采用试剂盒中的PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，具体如实施例3步骤3；
3）对PCR扩增产物进行纯化，具体如实施例3步骤5；
4）采用上述试剂盒中的测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应，具体如实施例3步骤6；
5）对BiyDye反应产物纯化，具体如实施例3步骤7；
6）对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较，具体如实施例3步骤8。
利用试剂盒对2号家系人员检测结果如图4所示，其中A层箭头所指位置显示家系中先证者KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93位点基因型是“c.277A>T”杂合子突变；C层先证者母亲同样存在突变；检测结果确认先证者、先证者母亲为II型长QT综合征患者，先证者父亲、妹妹基因型为野生型，为正常个体。先证者以后生育II型长QT综合征患者后代的概率为1/2，建议以后如需生育，可来医院行胚胎植入前遗传学诊断和产前诊断。
实施例5
I基因突变评级与解读（突变的致病性）
突变解读基于我们目前对II型长QT综合征与致病基因KCNH2的了解认识(https://www.omim.org/entry/613688)，以及检测结果对受检者进行临床表型关联。突变遵从突变命名的HGVS指南（http://www.hgvs.org/），并根据GenBank登记号命名(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。基因变异数据解读规则参考美国医学遗传学和基因组学学院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相关指南：Richards,S，et al., Standards and guidelines for the interpretation ofsequence variants:a joint consensus recommendation of the American College ofMedical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med, advance online publication 5 March 2015. doi:10.1038/gim.2015.30；以及中国《遗传变异分类标准与指南》：王秋菊，沈亦平，邬玲仟，等.遗传变异分类标准与指南.中国科学：生命科学，2017，47：668–688。
《遗传变异分类标准与指南》中遗传变异分类是基于典型的数据类型(如人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据)对变异进行五级分类，分别为：“致病的（pathogenic，P）”、“可能致病的（likely pathogenic，LP）”、“意义不明确的（variant of uncertainsignificance，VUS）”、“可能良性的（likely benign，LB）”和“良性的（benign，B）”；五级分类的判定是基于对变异的各个侧面/子项目进行解读分析后的综合评分（表12）。
表12 变异致病性判定准则
五级评定之前，需要对突变/变异的各侧面/子项进行分析/解读。其中，致病变异标准可分为：非常强(very strong，PVS1)、强(strong，PS1~4)、中等(moderate，PM1~6)、或辅助证据(supporting，PP1~5；良性变异证据可分为：独立(stand-alone，BA1)、强(strong，BS1~4)、或辅助证据(BP1~6) (见下表13)。对于一个给定的突变/变异，首先需要基于观察到的证据来选择表13中的标准，判断突变/变异各侧面/子项能满足表13中的哪几条，每条分别被评为PVS1/PS1~4/PM1~6/PP1~5/BA1/BS1~4/BP1~6中的哪个，最后再根据表12的评分规则把可满足的各条子项标准组合起来，再根据表12的组合标准从五级系统中选择一个分类；例如，如果该突变的各侧面/子项经分析后具备PVS1、PM1、PM2三条，则该突变综合评级为“致病”[即满足表12中“致病（P）”中(i)+(b)的准则]。
表13 变异判读标准及变异致病性判定准则
/>
突变/变异各侧面/子项的分析/解读需要基于相应的生物信息分析工具（见表15）和众多可用的数据（库）（见表16），包括现有案例获得的数据，以及已有公布的数据，比如公共数据库(如ClinVar或位点特异数据库)和实验室自有数据库获得。采用各种数据（库）对突变/变异进行分析时，采用的程度判断评价标准如表14所示。
表14 程度判断评价标准
/>
表15 生物信息分析工具
/>
表16 人群数据库、疾病特异性数据库和序列数据库
/>
根据上述标准或准则，本发明中KCNH2基因c.277A>T突变评定为“致病”，判断标准及具体证据如下表17：
表17 KCNH2基因c.277A>T突变致病性解读
AD：指常染色体显性遗传。
KCNH2:NM_000238.4:exon2:c.277A>T:p.K93变异评级证据如下：
1、PVS1：KCNH2基因c.277A>T变异无义突变，远超过10%的蛋白区域受影响（该变异发生在第2号外显子，KCNH2基因共有15个外显子，相当于第3至第15号共13个外显子被截掉而受影响），KCNH2功能丧失变异为其致病机制之一；
2、PS4：结合文献和本病例，在多名患者（43名）中检测到该变异（见表1、表10和表11）；
3、PM2：KCNH2基因c.277A>T变异在参考人群千人基因组(1000G)、人类外显子数据库（ExAC）和人群基因组突变频率数据库(gnomAD)中没有发现，即在正常对照人群中频率极低；
4、PP1：本系列案例中，变异与疾病在家系成员中存在共分离现象；
5、PP3：多种计算机软件预测该变异会对基因或基因产物造成有害的影响；
6、PP4：本系列案例中，该变异相关的疾病与患者的症状与家族病史高度符合。
因此，该突变/变异的综合性证据（PVS1+PS4+PM2+PP1+PP3+PP4）符合表12中“致病（P）”评判标准(i)中(a)或(c)或(d)，在此综合判定KCNH2基因c.277A>T变异为“致病”。
实施例6
随访及诊断试剂盒检测性能分析
对所有家系人员进行了随访，并对所有个体的KCNH2基因靶向捕获芯片法进行重测序分析验证（见表18）。
表18 c.277A>T位点检测的性能分析结果
注：本表包含家系1的随访数据。
结合表1和表10可以看出，在对19个家系进行检测时发现阳性患者（43例）。上述阳性位点检测结果均通过KCNH2基因靶向捕获芯片法验证。根据随访和验证结果，本次共发现43例真阳性病例、51例真阴性病例、0例假阴性和0例假阳性病例。c.277A>T变异位点标记物进行检测的灵敏度为100.00%，其95%CI（95%置信区间）为99.03%~100%，特异度为100%，其95%CI为99.03%~100%。以上结果说明，本试剂盒在临床应用时具有良好的检测性能。
根据上述实施例可以看出，本发明KCNH2基因突变体可以作为诊断II型长QT综合征的生物标志物，为治疗II型长QT综合征提供可能的药物靶点。
本发明的上述技术方案中，以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的技术构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围。

Claims (3)

1.一种KCNH2基因突变体，其特征在于，所述KCNH2基因突变体相较于野生型KCNH2基因，在所述野生型KCNH2基因的第2号外显子的第277位碱基由碱基A突变为碱基T。
2.一种KCNH2突变蛋白，其特征在于，所述KCNH2突变蛋白相较于野生型KCNH2基因编码的蛋白，第93位氨基酸由赖氨酸突变为终止密码子。
3.一种如权利要求1所述的KCNH2基因突变体在制备II型长QT综合征检测试剂和/或检测试剂盒中的应用；
所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括KCNH2基因突变体的扩增引物，所述扩增引物包括上游引物KCNH2-1F和下游引物KCNH2-1R；所述上游引物KCNH2-1F包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述下游引物KCNH2-1R包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述检测试剂和/或所述检测试剂盒包括KCNH2基因突变体的测序引物，所述测序引物包括上游引物KCNH2-Seq1F和下游引物KCNH2-Seq1R；所述上游引物KCNH2-Seq1F包括如SEQID NO.3所示的核苷酸序列；所述下游引物KCNH2-Seq1R包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
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快速激活延迟整流钾离子通道a亚基F129I突变致长QT综合征机制研究;冯莉;马克娟;李新;;心肺血管病杂志;20200726(第07期);全文 *
遗传性长QT综合征基因突变位点鉴定方法的探讨;杨海涛;;临床心血管病杂志;20111225(第12期);全文 *

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