CN115725721A - 用于检测长qt综合征致病基因kcnq1和kcnh2的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及了用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8；与野生型KCNQ1基因参考序列相比，致病基因KCNQ1的第515‑525位的碱基缺失；与野生型KCNH2基因参考序列相比，致病基因KCNH2第679位的碱基A突变为碱基T。本发明还涉及上述试剂在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供的致病基因KCNQ1和KCNH2可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因KCNQ1和KCNH2开发的试剂及其检测试剂盒可以将携带KCNQ1 c.515_525del和KCNH2 c.679A>T基因突变的患者和正常人群区分开，对长QT综合征的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂及其应用。
背景技术
长QT综合征(longQTsyndrome,LQTS)是一种心脏结构正常但心肌复极延迟的单基因遗传性心血管疾病，主要表现为心电图校正的QT间期(QTc)延长，易发尖端扭转型室速导致晕厥甚至心脏性猝死(sudden cardiac death,SCD)。LQTS临床表型多样，患者可终生无明显症状亦可幼年发生SCD。
目前报道的LQTS相关致病基因至少16个，其中明确的致病基因9个，分别编码电压门控钾、钠、钙通道蛋白及其相关调节蛋白。其中，KCNQ1(LQTS1)、KCNH2(LQTS2)和SCN5A(LQTS3)3个致病基因可解释约75％的患者，其余致病基因可解释5％～10％的患者。
LQTS主要为常染色体显性遗传，既有家族性发病病例亦有散发病例，散发病例可能与新发突变有关。KCNQ1和KCNE1除了常染色体显性遗传外，亦可由常染色体隐性遗传模式导致与耳聋相关的Jervell-Lange-Nielsen综合征。
基因检测对于患者临床诊断、危险分层、治疗及患者家属的早期预警非常重要，例如基因检测出携带≥2个致病基因突变的LQTS患者或先天耳聋的Jervell-Lange-Nielsen综合征患者SCD风险高，可积极考虑预防性植入植入型心律转复除颤器(implantablecardioverter defibrillator,ICD)，提高患者生存率。目前已发现长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2基因的许多突变位点，进一步发现新的KCNQ1和KCNH2基因突变位点将有助于进一步研究长QT综合征，对长QT综合征的早期诊断，或者辅助临床诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂及其应用。
本发明目的之一在于提供用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8；与野生型KCNQ1基因参考序列SEQ ID NO:9相比，所述致病基因KCNQ1的第515-525位的碱基缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1，与野生型KCNQ1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:10相比，所述致病基因KCNQ1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；与野生型KCNH2基因参考序列SEQ ID NO:11相比，所述致病基因KCNH2第679位的碱基A突变为碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3，与野生型KCNH2基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:10相比，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。具体突变信息如下：
本发明目的之二在于提供上述用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。
本发明的原理和有益效果在于：本发明提供的致病基因KCNQ1和KCNH2可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂开发检测试剂盒可以将携带KCNQ1 c.515_525del或KCNH2 c.679A>T基因突变的患者和正常人群区分开，对长QT综合征的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。为生育需求的患者提供为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，能够有效减少患儿的出生。
附图说明
图1为实施例1中长QT综合征患者的Sanger测序图；
图2为实施例2中长QT综合征先证者的家系图；
图3为实施例3中长QT综合征患者的Sanger测序图；
图4为实施例4中长QT综合征先证者的家系图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
试剂来源：PCR预混液：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase-Free H2O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取检测试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。
实施例1：KCNQ1 c.515_525del验证实验
在临床诊断为长QT综合征患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取检测试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。
S2、准备PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：
正向引物(SEQ ID NO:5)：5'TTGCAGGGTCTGAAGCCACT 3'；反向引物(SEQ ID NO:6)：5'AATGCTCCTGTGCTGGGTCCT 3'。长度：345bp。
S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
S4、PCR产物的检测：取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。
S5、PCR产物纯化：PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力架上静置10min，使乙醇完全挥发干净。(8)将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5min。(9)将离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(10)将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。
S6、Sanger测序：使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。
S7、测序结果进行生物信息学分析：将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型KCNQ1基因序列(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。
S8、基因变异论证：患者KCNQ1 c.515_525del杂合错义变异，即与野生型KCNQ1基因参考序列SEQ ID NO:9相比，致病基因KCNQ1的第515-525位的碱基缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1，与野生型KCNQ1基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:10相比，致病基因KCNQ1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。测序结果如图1所示。
检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。
根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为长QT综合征的高度可疑致病突变。
实施例2：样本验证-KCNQ1 c.515_525del
招募2000名未患有长QT综合征的对照人群和1000名长QT综合征患者，使用实施例1中的方法检测该患者家系的每个成员以及对照人群的是否携带KCNQ1 c.515_525del变异。基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)长QT综合征家系；国别/地区：中国/江苏；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：20-55岁；(2)对照人群国别/地区：中国/江苏；对照人群男女比例：1﹕1；对照人群年龄分布：20-55岁。
仅在长QT综合征的家系(家系图如图2所示)的患病成员中检测到KCNQ1 c.515_525del杂合错义变异；未患有长QT综合征的对照人群未见该位点的突变。
实施例3：KCNH2 c.679A>T验证实验
在临床诊断为长QT综合征患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录患者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。采用实施例1的方法对提取基因组DNA、准备PCR反应体系、Sanger测序等，所用到的正向引物(SEQ ID NO:7)：5'TGCCCCTGTTTCCTCATCCAC 3'；反向引物(SEQ ID NO:8)：5'ACCCCACCCTTCAGTAGTCCC 3'。长度：799bp。
S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，58℃退火20s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型KCNH2基因序列(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。
测序结果发现患者携带KCNH2 c.679A>T杂合错义变异，即与野生型KCNH2基因参考序列SEQ ID NO:11相比，致病基因KCNH2第679位的碱基A突变为碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3，与野生型KCNH2基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:12相比，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。测序结果如图3所示。
检索千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。
根据现有证据：该变异为罕见变异、该变异为长QT综合征的高度可疑致病突变。
实施例4：样本验证-KCNH2 c.679A>T
招募1000名未患有长QT综合征的对照人群和500名长QT综合征患者，使用实施例1中的方法检测该患者家系的每个成员以及对照人群的是否携带KCNH2 c.679A>T变异。
基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)长QT综合征家系；国别/地区：中国/北京；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：20-55岁；(2)对照人群国别/地区：中国/北京；对照人群男女比例：1﹕1；对照人群年龄分布：20-55岁。
仅在长QT综合征的家系(家系图如图4所示)的患病成员中检测到KCNH2 c.679A>T杂合错义变异；1000名未患有长QT综合征的对照人群未见该位点的突变。
实施例5：检测试剂盒
1.组成：
表2.组成
2.使用方法：(1)基因组DNA提取：使用DNA提取检测试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。(2)PCR扩增：采用上述的检测试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。(3)对PCR扩增产物进行纯化。(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。(5)分析测序结果，比对是否有KCNQ1 c.515_525del或KCNH2 c.679A>T杂合错义变异。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (3)
1.用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:8；与野生型KCNQ1基因参考序列相比，所述致病基因KCNQ1的第515-525位的碱基缺失，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型KCNH2基因参考序列相比，所述致病基因KCNH2第679位的碱基A突变为碱基T，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
2.根据权利要求1所述的用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂，其特征在于，所述致病基因KCNQ1编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述致病基因KCNH2编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测长QT综合征致病基因KCNQ1和KCNH2的试剂在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。
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