CN111423503A

CN111423503A - 与长qt综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

Info

Publication number: CN111423503A
Application number: CN202010259856.6A
Authority: CN
Inventors: 刘哲; 侯青; 梁庆渊; 刘锋; 李伟真; 刘福佳; 赵娜娜; 周小云; 刘昕超; 惠汝太
Original assignee: Bosinor Beijing Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Bosinor Beijing Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111423503B

Abstract

本发明公开了突变蛋白和突变的KCNH2基因，与人类KCNH2基因相比，具有c.1369G>A杂合错义变异，研究数据验证该突变与长QT综合征相关，基于请求保护上述突变蛋白和基因的用途，以及检测长QT综合征的试剂盒。本发明提供的突变的KCNH2基因可以将长QT综合征患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断长QT综合征的生物标志物；可以早期筛查该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询；为人类攻克长QT综合征提供可能的药物治疗靶点。

Description

与长QT综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种人体变异基因，特别是一种与长QT综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用。

背景技术

长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)是一种心脏结构正常但心肌复极延迟的单基因遗传性心血管疾病，主要表现为心电图校正的QT间期(QTc)延长，易发尖端扭转型室速导致晕厥甚至SCD。长QT综合征临床表型多样，患者可终生无明显症状亦可幼年发生SCD。2018年，长QT综合征被收录进《第一批罕见病目录》中。根据《罕见病诊疗指南(2019年版)》，长QT综合征的发病率估测为1/2500例活产婴儿。未治疗的长QT综合征患者10年病死率可达50％。对长QT综合征的发病特征简要总结如下：(1)发病年龄小，女性多见。(2)常有晕厥或猝死家族史。(3)不同基因型和表现型，可累及钾、钠、钙通道。常有特征性尖端扭转性室速(TdP)，导致晕厥或猝死。(4)心电图表现为QT间期延长。(5)心电图一般有如下特征：①表现为QT间期延长，短-长-短周期现象诱发；②心室率160～240bpm，QRS波振幅与形态围绕等电位线扭转，5～20个心动周期主波围绕基线扭转一次，多数能自行终止；③ATP较难终止TdP。

目前报道的长QT综合征相关致病基因至少16个，其中明确的致病基因有9个(KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNE1、KCNJ2、CACNA1C、CAV3、CALM1、CALM2)，分别编码电压门控钾、钠、钙通道蛋白及其相关调节蛋白。其中KCNH2基因编码一种电压激活型钾离子通道，其野生型蛋白序列信息在NCBI编号为NP_001191727.1，如本文附件氨基酸序列表SeqID No.1所示，该蛋白在心室动作电位的复极末期起到重要作用，因此KCNH2基因也被称为hERG基因。

KCNH2基因突变与常染色体显性遗传的遗传性长QT综合征2型和短QT综合征1型(遗传方式未知)的发生有关。长QT综合征既有家族性发病病例，亦有散发病例，散发病例可能与新发突变有关。长QT综合征主要为常染色体显性遗传，KCNQ1和KCNE1除了常染色体显性遗传外，亦可由常染色体隐性遗传模式导致与耳聋相关的Jervell-Lange-Nielsen综合征。长QT综合征有外显延迟性，致病基因突变携带者发病时间不等，早至宫内尚未分娩时即可检测到QTc延长，亦有携带者晚年发病甚至终生不发病。长QT综合征尚无特殊疗法和根治手段，只能通过手术或者药物对具体症状进行有限的缓解。因缺乏特异性临床表现，绝大多数长QT综合征无法仅通过临床表现和传统实验室检查进行分型，具体分类需依靠基因诊断，因此，基因检测是确诊长QT综合征的重要手段。

现在，KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)和SCN5A(LQT3)3个致病基因可解释约75％的患者，其余致病基因可解释5％～10％的患者。

目前仍有15％～20％的长QT综合征患者无法用已知的致病基因解释，提示可能存在未发现的致病基因。基于该疾病的罕见性，任何一个或一组长QT综合征的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。

发明内容

本发明发明人在对长QT综合征的家系成员进行分析过程中意外发现家系中的长QT综合征患者具有KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异。该变异所致的氨基酸改变对应位置由非极性的丙氨酸变为极性不带电荷的苏氨酸。

查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限于中国各地区人群。使用多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen-2)对该变异进行交叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen-2为“D”，其他为“5个D/1个M”)，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中高度保守；查询ClinVar、HGMD数据库未发现该变异，该位点附近的错义变异c.1383G>T(p.Met461Ile)、c.1379G>T(p.Gly460Val)、c.1379G>C(p.Gly460Ala)、c.1376T>C(p.Leu459Pro)、c.1370C>A(p.Ala457Asp)、c.1342G>A(p.Glu448Lys)均被报导为致病变异，文献检索未发现本发明发现的变异与长QT综合征的关系。

发明人通过大量样本验证了该变异与长QT综合征患者的关系，该发现对于长QT综合征诊断、优生筛查，以及未来作为药物设计靶点方面都具有重要意义。基于此，本发明请求保护以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种人工制备的突变蛋白，其与野生型钾离子通道蛋白同源比对，具有如下突变：A457T；

其中所述野生型钾离子通道蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

本领域技术人员可以理解，上述人工制备的突变蛋白，基于一些使用目的，突变蛋白仅需具有上述突变位点即可，而不必如野生型蛋白一样完整。

优选地，所述人工制备的突变蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明的第二方面提供一种突变的KCNH2基因片段，其编码上述人工制备的突变蛋白。

本领域技术人员很好理解，基于氨基酸密码子的简并性，编码上述突变蛋白的基因片段可以是多种序列；

优选地，所述突变的KCNH2基因片段与野生型KCNH2基因同源比对，具有c.1369G>A杂合错义变异，其中所述野生型KCNH2基因序列为人第7号染色体chr7:150646497-150652917区间的片段(Seq ID No.3)。

优选地，所述突变的KCNH2基因片段具有Seq ID No.4所示的序列。

第三方面，本发明提供了上述的突变蛋白的用途应用，其特征在于，将所述突变蛋白分子用作靶蛋白以研发长QT综合征的检测试剂盒或治疗药物。

第五方面，本发明提供了上述突变的KCNH2基因片段的用途，其特征在于，将所述突变基因作为靶分子片段，用于研发长QT综合征检测试剂盒或治疗药物。

第六方面，本发明提供了一种检测长QT综合征的试剂盒，其特征在于，包含

扩增上述突变的KCNH2基因的特异性引物，和/或检测上述突变的KCNH2基因的特异性探针。

在一个优选的实施方案中，所述特异性引物具有：

正向引物KCNH2-E5F：其核苷酸序列为：5'CCAGGTCCTTCCCAAGACAC 3'，和

反向引物KCNH2-E5R其核苷酸序列为：5'TGAAACCAAATGCCGAGCTTC 3'。

优选地，还包括阳性对照重组质粒；阴性对照重组质粒；

优选地，还DNA提取试剂、Taq DNAPolymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂及增强剂等。

优选地，所述试剂盒还包含对PCR扩增产物进行测序的试剂。

优选地，所述对PCR扩增产物进行测序的试剂为Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法用试剂、单链构象多态性(SSCP)分析用试剂和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)检测用试剂中的一种或多种。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异可以将长QT综合征患者和正常人群区分开，因此，该变异可以作为临床辅助诊断长QT综合征的生物标志物。

2.通过检测受试者是否携带上述变异，可以早期筛查该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

3.为人类攻克长QT综合征提供可能的药物治疗靶点，促进创新药物研发。

附图说明

图1是实施例2中长QT综合征患者家系图。

图2是长QT综合征患者与正常对照的KCNH2基因测序结果，其中，A为家系中及本地数据库中正常对照的Sanger测序图，B为家系中长QT综合征患者的Sanger测序图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

试剂来源：

PCR Mix：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。

Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。

扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

RNase-Free H₂O：购自北京索莱宝科技有限公司。

磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。

实施例1：长QT综合征患者/携带者验证实验

样本来源：保定市第一中心医院，在长QT综合征先证者及家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL全血样本(加入EDTA抗凝，-80℃保存)，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

随机收集200名与该长QT综合征先证者家系无关的健康样本作为验证样本，每位采集2-4ml EDTA抗凝血，-80℃保存。

1.制备基因组DNA

对先证者和验证样本的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。

2.准备PCR反应体系

该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCRMix 25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H₂O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下表1所示：

表1引物信息

3.目的片段扩增

将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s,59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸2min；4℃保存。

4.PCR产物的检测

取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

5.PCR产物纯化

PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：

5.1涡旋振荡磁珠30秒，使其彻底混匀为均一溶液。

5.2向1.5ml的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5分钟。

5.3将上一步的离心管放于磁力架上，直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

5.4保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。

5.5向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10秒钟后将离心管重新放回磁力架，静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。

5.6重复步骤5.5。

5.7保持离心管固定于磁力架上静置放置10分钟，使乙醇完全挥发干净。

5.8将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5分钟。

5.9将离心管放于磁力架上直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

5.10将洗脱液转移至一个新的1.5ml离心管中，此时，可弃去磁珠。

6.Sanger测序

使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

7.测序结果进行生物信息学分析

将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型KCNH2基因序列(Suq id No.3)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

测序后获得的原始数据由Trimmomatic(version 0.36)(可参考Bolger AM,LohseM,Usadel B,Trimmomatic:a flexible trimmer for Illumina sequence data.2014 30(15):2114-20，通过参考的方式将其全文并入本文)进行处理，经过过滤去除污染，包括：修剪接头序列，去除低质量的reads；

应用fastp(Chen S,Zhou Y,Chen Y,et al,fastp:an ultra-fast all-in-oneFASTQ preprocessor. 2018 34(17):i884-i890，通过参考的方式将其全文并入本文)对clean reads进行质量控制，统计每个碱基位置的测序质量平均值以及GC含量分布，保证后续分析的准确性。

使用BWA(version 0.7.12-r1039)(通过Burrows-Wheeler变换比对)比对参考基因组hg19，获得比对到基因组上的唯一比对序列。

然后利用Samtools(version 1.2)(可参考Li H,Handsaker B,Wysoker A,et al,The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.2009 25(16):2078-9，通过参考的方式将其全文并入本文)和VarScan(version v2.3.9)(可参考Koboldt DC,Chen K,Wylie,et al,VarScan:variant detection in massively parallel sequencing ofindividual and pooled samples.Bioinformatics 2009,25(17),2283-5,通过参考的方式将其全文并入本文)确定靶区域的SNP和INDEL的基因型。

通过四个公共数据库：dbSNP(version 138)(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp138.txt.gz.)，千人数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，ESP数据库(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)，ExAC数据库(http://exac.hms.harvard.edu/)的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

通过比对正常样本，去掉所有已知变异，同义变异以及非编码区的变异，利用SIFT(可参考Choi Y,Sims GE,Murphy S,et al,Predicting the Functional Effect ofAmino Acid Substitutions and Indels.PLoS ONE 2009,7(10):e46688,通过参考的方式将其全文并入本文)和Polyphen(可参考Adzhubei IA,Schmidt S,Peshkin L,A methodand server for predicting damaging missense mutations.2010 7(4):248-9.通过参考的方式将其全文并入本文)软件进行SNP功能预测，结果提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。另外通过查询ClinVar数据库(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)、HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.

uk/ac/index.php)数据库以及文献检索均未发现该变异与疾病相关的报导。综合考虑测序质量和生物信息学分析结果，最终发现先证者可能具有致病意义的基因突变(KCNH2基因c.1369G>A，p.Ala457Thr杂合错义变异)。测序结果显示，先证者有KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异(KCNH2:p.Ala457Thr het)，而200名健康的对照成员均未检测到该变异。查询“人群频率数据库”发现该变异为罕见变异，千人基因组(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无；ESP6500(https:// esp.gs.washington.edu/drupal/)：无；ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限于中国各地区人群。使用多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen-2)对该变异进行交叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen-2为“D”，其他为“5个D/1个M”)，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。氨基酸由非极性的丙氨酸变为极性不带电荷的苏氨酸。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中高度保守。查询ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)、HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)数据库未发现该变异，该位点附近的错义变异c.1383G>T(p.Met461Ile)、c.1379G>T(p.Gly460Val)、c.1379G>C(p.Gly460Ala)、c.1376T>C(p.Leu459Pro)、c.1370C>A(p.Ala457Asp)、c.1342G>A(p.Glu448Lys)均被报导为致病变异，文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。

8.基因变异论证

200名表型健康的对照成员均未检测到该变异；长QT综合征先证者检测到KCNH2基因c.1369G>A杂合错义变异。

实施例2：无关样本验证实验--长QT综合征家系筛查

1.实验方法

招募1个长QT综合征家系(家系图如图1所示)，对所有的家系成员(4名家系内患者和4名家系内正常人)进行实验室检查、心电图和动态心电图检查、运动心电图检查和影像学检查，初步确认其符合长QT综合征家系特征。

通过基因检测，在该家系中检查到有4名长QT综合征病人；据家系成员介绍，该家系中有一名已故成员也是长QT综合征患者。

另外招募了1453名未患有长QT综合征的健康人群作为对照。

使用实施例1中的方法扩增该家系每个成员以及对照人群的KCNH2基因c.1369，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。

基于样本信息保密，现公开部分样本信息。

样本可公开信息：

(1)长QT综合征家系国别/地区：中国/保定

家系成员男女比例：4﹕7

家系成员年龄分布：26-80岁

(2)对照人群国别/地区：中国

对照人群男女比例：1﹕1

对照人群年龄分布：12-78岁

2.结果

Sanger测序结果显示(如图2所示)，招募的长QT综合征家系中患病成员均携带c.1369G>A杂合突变；而家系内非患病成员和正常对照人群未见前述任一位点的突变。

实施例3：体外检测长QT综合征患者的KCNH2基因试剂盒

1、试剂盒组成：

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)PCR扩增：采用上述的试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。

(3)对PCR扩增产物进行纯化。

(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。

(5)分析测序结果，比对是否有KCNH2基因c.1369G>A杂合突变。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 百世诺（北京）医学检验实验室有限公司

<120> 与长QT综合征相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

<130> P200212-BSN

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Ala Pro Ala Gly Lys Ala Ser Arg Thr Gly Ala Leu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Ala Gln Lys Gly Arg Val Arg Arg Ala Val Arg Ile Ser Ser Leu

20 25 30

Val Ala Gln Glu Val Leu Ser Leu Gly Ala Asp Val Leu Pro Glu Tyr

35 40 45

Lys Leu Gln Ala Pro Arg Ile His Arg Trp Thr Ile Leu His Tyr Ser

50 55 60

Pro Phe Lys Ala Val Trp Asp Trp Leu Ile Leu Leu Leu Val Ile Tyr

65 70 75 80

Thr Ala Val Phe Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Phe Leu Leu Lys Glu Thr

85 90 95

Glu Glu Gly Pro Pro Ala Thr Glu Cys Gly Tyr Ala Cys Gln Pro Leu

100 105 110

Ala Val Val Asp Leu Ile Val Asp Ile Met Phe Ile Val Asp Ile Leu

115 120 125

Ile Asn Phe Arg Thr Thr Tyr Val Asn Ala Asn Glu Glu Val Val Ser

130 135 140

His Pro Gly Arg Ile Ala Val His Tyr Phe Lys Gly Trp Phe Leu Ile

145 150 155 160

Asp Met Val Ala Ala Ile Pro Phe Asp Leu Leu Ile Phe Gly Ser Gly

165 170 175

Ser Glu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Lys Thr Ala Arg Leu Leu Arg Leu

180 185 190

Val Arg Val Ala Arg Lys Leu Asp Arg Tyr Ser Glu Tyr Gly Ala Ala

195 200 205

Val Leu Phe Leu Leu Met Cys Thr Phe Ala Leu Ile Ala His Trp Leu

210 215 220

Ala Cys Ile Trp Tyr Ala Ile Gly Asn Met Glu Gln Pro His Met Asp

225 230 235 240

Ser Arg Ile Gly Trp Leu His Asn Leu Gly Asp Gln Ile Gly Lys Pro

245 250 255

Tyr Asn Ser Ser Gly Leu Gly Gly Pro Ser Ile Lys Asp Lys Tyr Val

260 265 270

Thr Ala Leu Tyr Phe Thr Phe Ser Ser Leu Thr Ser Val Gly Phe Gly

275 280 285

Asn Val Ser Pro Asn Thr Asn Ser Glu Lys Ile Phe Ser Ile Cys Val

290 295 300

Met Leu Ile Gly Ser Leu Met Tyr Ala Ser Ile Phe Gly Asn Val Ser

305 310 315 320

Ala Ile Ile Gln Arg Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Arg Tyr His Thr Gln

325 330 335

Met Leu Arg Val Arg Glu Phe Ile Arg Phe His Gln Ile Pro Asn Pro

340 345 350

Leu Arg Gln Arg Leu Glu Glu Tyr Phe Gln His Ala Trp Ser Tyr Thr

355 360 365

Asn Gly Ile Asp Met Asn Ala Val Leu Lys Gly Phe Pro Glu Cys Leu

370 375 380

Gln Ala Asp Ile Cys Leu His Leu Asn Arg Ser Leu Leu Gln His Cys

385 390 395 400

Lys Pro Phe Arg Gly Ala Thr Lys Gly Cys Leu Arg Ala Leu Ala Met

405 410 415

Lys Phe Lys Thr Thr His Ala Pro Pro Gly Asp Thr Leu Val His Ala

420 425 430

Gly Asp Leu Leu Thr Ala Leu Tyr Phe Ile Ser Arg Gly Ser Ile Glu

435 440 445

Ile Leu Arg Gly Asp Val Val Val Ala Ile Leu Gly Met Gly Trp Gly

450 455 460

Ala Gly Thr Gly Leu Glu Met Pro Ser Ala Ala Ser Arg Gly Ala Ser

465 470 475 480

Leu Leu Asn Met Gln Ser Leu Gly Leu Trp Thr Trp Asp Cys Leu Gln

485 490 495

Gly His Trp Ala Pro Leu Ile His Leu Asn Ser Gly Pro Pro Ser Gly

500 505 510

Ala Met Glu Arg Ser Pro Thr Trp Gly Glu Ala Ala Glu Leu Trp Gly

515 520 525

Ser His Ile Leu Leu Pro Phe Arg Ile Arg His Lys Gln Thr Leu Phe

530 535 540

Ala Ser Leu Lys

545

<210> 2

<211> 548

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Ala Pro Ala Gly Lys Ala Ser Arg Thr Gly Ala Leu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Ala Gln Lys Gly Arg Val Arg Arg Ala Val Arg Ile Ser Ser Leu

20 25 30

Val Ala Gln Glu Val Leu Ser Leu Gly Ala Asp Val Leu Pro Glu Tyr

35 40 45

Lys Leu Gln Ala Pro Arg Ile His Arg Trp Thr Ile Leu His Tyr Ser

50 55 60

Pro Phe Lys Ala Val Trp Asp Trp Leu Ile Leu Leu Leu Val Ile Tyr

65 70 75 80

Thr Ala Val Phe Thr Pro Tyr Ser Ala Ala Phe Leu Leu Lys Glu Thr

85 90 95

Glu Glu Gly Pro Pro Ala Thr Glu Cys Gly Tyr Ala Cys Gln Pro Leu

100 105 110

Ala Val Val Asp Leu Ile Val Asp Ile Met Phe Ile Val Asp Ile Leu

115 120 125

Ile Asn Phe Arg Thr Thr Tyr Val Asn Ala Asn Glu Glu Val Val Ser

130 135 140

His Pro Gly Arg Ile Ala Val His Tyr Phe Lys Gly Trp Phe Leu Ile

145 150 155 160

Asp Met Val Ala Ala Ile Pro Phe Asp Leu Leu Ile Phe Gly Ser Gly

165 170 175

Ser Glu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Lys Thr Ala Arg Leu Leu Arg Leu

180 185 190

Val Arg Val Ala Arg Lys Leu Asp Arg Tyr Ser Glu Tyr Gly Ala Ala

195 200 205

Val Leu Phe Leu Leu Met Cys Thr Phe Ala Leu Ile Ala His Trp Leu

210 215 220

Ala Cys Ile Trp Tyr Ala Ile Gly Asn Met Glu Gln Pro His Met Asp

225 230 235 240

Ser Arg Ile Gly Trp Leu His Asn Leu Gly Asp Gln Ile Gly Lys Pro

245 250 255

Tyr Asn Ser Ser Gly Leu Gly Gly Pro Ser Ile Lys Asp Lys Tyr Val

260 265 270

Thr Ala Leu Tyr Phe Thr Phe Ser Ser Leu Thr Ser Val Gly Phe Gly

275 280 285

Asn Val Ser Pro Asn Thr Asn Ser Glu Lys Ile Phe Ser Ile Cys Val

290 295 300

Met Leu Ile Gly Ser Leu Met Tyr Ala Ser Ile Phe Gly Asn Val Ser

305 310 315 320

Ala Ile Ile Gln Arg Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Arg Tyr His Thr Gln

325 330 335

Met Leu Arg Val Arg Glu Phe Ile Arg Phe His Gln Ile Pro Asn Pro

340 345 350

Leu Arg Gln Arg Leu Glu Glu Tyr Phe Gln His Ala Trp Ser Tyr Thr

355 360 365

Asn Gly Ile Asp Met Asn Ala Val Leu Lys Gly Phe Pro Glu Cys Leu

370 375 380

Gln Ala Asp Ile Cys Leu His Leu Asn Arg Ser Leu Leu Gln His Cys

385 390 395 400

Lys Pro Phe Arg Gly Ala Thr Lys Gly Cys Leu Arg Ala Leu Ala Met

405 410 415

Lys Phe Lys Thr Thr His Ala Pro Pro Gly Asp Thr Leu Val His Ala

420 425 430

Gly Asp Leu Leu Thr Ala Leu Tyr Phe Ile Ser Arg Gly Ser Ile Glu

435 440 445

Ile Leu Arg Gly Asp Val Val Val Thr Ile Leu Gly Met Gly Trp Gly

450 455 460

Ala Gly Thr Gly Leu Glu Met Pro Ser Ala Ala Ser Arg Gly Ala Ser

465 470 475 480

Leu Leu Asn Met Gln Ser Leu Gly Leu Trp Thr Trp Asp Cys Leu Gln

485 490 495

Gly His Trp Ala Pro Leu Ile His Leu Asn Ser Gly Pro Pro Ser Gly

500 505 510

Ala Met Glu Arg Ser Pro Thr Trp Gly Glu Ala Ala Glu Leu Trp Gly

515 520 525

Ser His Ile Leu Leu Pro Phe Arg Ile Arg His Lys Gln Thr Leu Phe

530 535 540

Ala Ser Leu Lys

545

<210> 3

<211> 1346

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

gccttacaaa taagaacatg gaggtctaga gcccaagggt gctcggccag gcatggtgaa 60

gctggagtgg ggtcccaggt ccttcccaag acactgggcc ccctgatgct tccgagatct 120

cccaggcctg gaggttgaga tttctctgac atggaggggt gggatggtgg agtagagtgt 180

gggttggggg gtcccaaggg agggtgtgct gagctgcccc caccctgccc ccaggtgctg 240

aagggcttcc ctgagtgcct gcaggctgac atctgcctgc acctgaaccg ctcactgctg 300

cagcactgca aacccttccg aggggccacc aagggctgcc ttcgggccct ggccatgaag 360

ttcaagacca cacatgcacc gccaggggac acactggtgc atgctgggga cctgctcacc 420

gccctgtact tcatctcccg gggctccatc gagatcctgc ggggcgacgt cgtcgtggcc 480

atcctgggta tggggtgggg ggcgggcact ggactggaaa tgccctctgc agcctcaaga 540

ggtgcgagcc ttctgaatat gcagtcactg gggctgtgga cctgggactg cctgcagggt 600

cactgggctc ctttaattca cctaaactca ggccctccaa gcggggccat ggagaggagc 660

cccacgtggg gtgaggctgc tgaactctgg ggttcccaca ttctccttcc cttcaggatc 720

cgccacaaac agacactttt tgcttcctta aagtaggatc aaatctagat cctctagcct 780

gggcagtaga ggaagaaatg ctagcctgga agctcggcat ttggtttcac taagggccat 840

gtggttccct gcagcctcat gcctggcccc ttgacacatc caaagcaaag ggagtcctgc 900

cccctccccc cacttccttt ctaccctgcc tgtgcacagt gggtgggttg gtgtgtctgg 960

acactgagga cttcctcccc ctttgcctgt ccttccctcg gccctgtgtg cctcagggca 1020

gatatagcaa gctctttcga ccatagttga tggtaggaca ttttagactt tgtttctcag 1080

ctctgtacaa acacaaatac acacccccac aaaactaaaa tcaaagtttc actacataac 1140

actgggcctt actgcatgtg gttcattcta gcatttctgt tctgtgctgt gctaagctat 1200

actactgtat gttctttcag taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatgct ggttttgatt 1260

cactactgtg ttctgatctt tggtttgaag aacattgctt ataagggtgc agtgattggc 1320

taagagggtg tttgggacct ggggtt 1346

<210> 4

<211> 1346

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gccttacaaa taagaacatg gaggtctaga gcccaagggt gctcggccag gcatggtgaa 60

gctggagtgg ggtcccaggt ccttcccaag acactgggcc ccctgatgct tccgagatct 120

cccaggcctg gaggttgaga tttctctgac atggaggggt gggatggtgg agtagagtgt 180

gggttggggg gtcccaaggg agggtgtgct gagctgcccc caccctgccc ccaggtgctg 240

aagggcttcc ctgagtgcct gcaggctgac atctgcctgc acctgaaccg ctcactgctg 300

cagcactgca aacccttccg aggggccacc aagggctgcc ttcgggccct ggccatgaag 360

ttcaagacca cacatgcacc gccaggggac acactggtgc atgctgggga cctgctcacc 420

gccctgtact tcatctcccg gggctccatc gagatcctgc ggggcgacgt cgtcgtgacc 480

atcctgggta tggggtgggg ggcgggcact ggactggaaa tgccctctgc agcctcaaga 540

ggtgcgagcc ttctgaatat gcagtcactg gggctgtgga cctgggactg cctgcagggt 600

cactgggctc ctttaattca cctaaactca ggccctccaa gcggggccat ggagaggagc 660

cccacgtggg gtgaggctgc tgaactctgg ggttcccaca ttctccttcc cttcaggatc 720

cgccacaaac agacactttt tgcttcctta aagtaggatc aaatctagat cctctagcct 780

gggcagtaga ggaagaaatg ctagcctgga agctcggcat ttggtttcac taagggccat 840

gtggttccct gcagcctcat gcctggcccc ttgacacatc caaagcaaag ggagtcctgc 900

cccctccccc cacttccttt ctaccctgcc tgtgcacagt gggtgggttg gtgtgtctgg 960

acactgagga cttcctcccc ctttgcctgt ccttccctcg gccctgtgtg cctcagggca 1020

gatatagcaa gctctttcga ccatagttga tggtaggaca ttttagactt tgtttctcag 1080

ctctgtacaa acacaaatac acacccccac aaaactaaaa tcaaagtttc actacataac 1140

actgggcctt actgcatgtg gttcattcta gcatttctgt tctgtgctgt gctaagctat 1200

actactgtat gttctttcag taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatgct ggttttgatt 1260

cactactgtg ttctgatctt tggtttgaag aacattgctt ataagggtgc agtgattggc 1320

taagagggtg tttgggacct ggggtt 1346

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物KCNH2-E5F

<400> 5

ccaggtcctt cccaagacac 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物KCNH2-E5R

<400> 6

tgaaaccaaa tgccgagctt c 21

Claims

1.一种人工制备的突变蛋白，其与野生型钾离子通道蛋白同源比对，具有如下突变：A457T；其中所述野生型钾离子通道蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述人工制备的突变蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

3.一种突变的KCNH2基因片段，其编码权利要求1或2所述的突变蛋白。

4.根据权利要求3所述的突变的KCNH2基因片段，其与野生型KCNH2基因同源比对，具有c.1369G>A杂合错义变异，其中所述野生型KCNH2基因序列为人第7号染色体如Seq ID No.3所示。

5.根据权利要求3所述的突变的KCNH2基因片段，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

6.权利要求1或2所述的突变蛋白的用途应用，其特征在于，将所述突变蛋白分子用作靶蛋白研发长QT综合征的检测试剂盒或治疗药物。

7.权利要求3-5任一所述的突变的KCNH2基因片段的用途，将突变的KCNH2基因片段作为靶分子片段研发长QT综合征检测试剂盒或治疗药物。

8.一种检测长QT综合征的试剂盒，其特征在于，包含

扩增权利要求3-5任一所述的突变的KCNH2基因的特异性引物，和/或特异性探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物具有

正向引物KCNH2-E5F：其核苷酸序列为：5'CCAGGTCCTTCCCAAGACAC 3'，和

反向引物KCNH2-E5R其核苷酸序列为：5'TGAAACCAAATGCCGAGCTTC 3'。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，还包括阳性对照重组质粒；阴性对照重组质粒；

优选地，还包括DNA提取试剂、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂及增强剂。