CN112028983B

CN112028983B - 与扩张型心肌病相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

Info

Publication number: CN112028983B
Application number: CN202010447289.7A
Authority: CN
Inventors: 刘哲; 侯青; 梁庆渊; 刘锋; 李伟真; 刘福佳; 赵娜娜; 周小云; 刘昕超; 惠汝太
Original assignee: Bosinor Beijing Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Bosinor Beijing Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2040-05-25
Also published as: CN112028983A

Abstract

本发明“与扩张型心肌病相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用”，公开了突变蛋白和突变的TTN基因，与人类TTN基因相比，具有c.20292_20293杂合缺失变异，研究数据验证该突变与扩张型心肌病相关，基于请求保护上述突变蛋白和基因的用途，以及检测扩张型心肌病的试剂盒。本发明提供的突变的TTN基因可以将扩张型心肌病患者和正常人群区分开，可以作为临床辅助诊断扩张型心肌病的生物标志物；可以早期筛查该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询；为人类攻克扩张型心肌病提供可能的药物治疗靶点。

Description

与扩张型心肌病相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种人体变异基因，特别是一种与扩张型心肌病相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用。

背景技术

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一类以心脏左心室或双心室扩张、收缩功能不全为主要特征的心肌疾病。早期可仅表现为心脏扩大及收缩功能降低，后期往往出现慢性心力衰竭，是导致心力衰竭的重要原因之一。病程中常伴发心律失常、血栓栓塞，甚至SCD等并发症，预后不佳。2014年中国一项报道显示，767例扩张型心肌病随访52个月的病死率为42.24％，给家庭和社会带来了沉重负担。

迄今报道的扩张型心肌病相关致病基因超过60个，其中具有明确家系连锁证据支持的致病基因见下表：

表1扩张型心肌病相关致病基因

基因名称	导致扩张型心肌病占比(％)
		MYH7	5～10
MYBPC3	2
		TNNT2	3～6
DSP	3
		TTN	15～25
LMNA	5～8
		MYH6	4
MYPN	3
		RBM20	2～5
SCN5A	3
		ANKRD1	2
RAF1	9
		DES	少见
DMD	少见

扩张型心肌病致病基因主要编码细胞结构及功能相关蛋白。前者绝大多数为肌节蛋白相关编码基因，也包括心肌细胞Z带、细胞核、细胞骨架及连接相关蛋白的编码基因；后者见于转录因子以及离子通道等细胞功能相关蛋白编码基因。遗传方式以常染色体显性遗传多见，也有常染色体隐性遗传、X连锁遗传等，后者多见于儿童。

目前，约60％的家族性扩张型心肌病可筛查到明确的致病基因突变。但是，仍有部分扩张型心肌病患者无法用已知的致病基因解释，提示可能存在未发现的致病基因。因此，任何一个或一组扩张型心肌病的相关基因的发现与提出都将是对本领域的重要技术贡献。

发明内容

本发明发明人在对扩张型心肌病的家系成员进行分析过程中意外发现家系中的扩张型心肌病患者具有TTN基因c.20292_20293del杂合缺失变异。

TTN是肌联蛋白的编码基因，其野生型mRNA转录本序列在Genebank中的编号为NM003319.4(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_003319)，全长82029，编码蛋白具有26926氨基酸，起始密码子位于第226-227bp位置。上述c.20292_20293del杂合缺失变异位置是在开放读码框中的位置，即从起始密码子起算的第20292_20293位核苷酸发生缺失突变。

肌联蛋白表达于心肌和骨骼肌，该蛋白分子量大，长度跨越肌节的1/2，是一种重要的结构蛋白。TTN基因突变可导致扩张型心肌病、肥厚型心肌病及多种肌病等；致病突变的类型主要为截短变异，点突变导致疾病的报道较少。

查询人群频率数据库发现该变异为罕见变异(千人基因组：无，ESP6500：无，ExAC：无)。在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限于中国各地区人群。该缺失变异使第6764位氨基酸后的蛋白截短表达。查询ClinVar、HGMD数据库未发现该变异，文献检索未发现本发明发现的变异与扩张型心肌病的关系。

发明人通过大量样本验证了该变异与扩张型心肌病患者的关系，该发现对于扩张型心肌病诊断、优生筛查，以及未来作为药物设计靶点方面都具有重要意义。基于此，本发明请求保护以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种人工制备的突变蛋白，氨基酸序列如Seq ID No.2所示，其对应的野生型肌联蛋白氨基酸序列片段如Seq ID No.1所示，是野生型肌联蛋白氨基酸全长序列第6061-7320位氨基酸；所述突变蛋白与Seq ID No.1相比，是在野生型肌联蛋白氨基酸全长序列的第6764位发生p.Tyr6764Ter截短表达。

本领域技术人员可以理解，上述人工制备的突变蛋白，基于一些使用目的，突变蛋白仅需具有上述突变特点即可，而不必是全长。

优选地，上述人工制备的突变蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明的另一方面提供，一种突变的TTN基因片段，其编码权利要求1或2所述的突变蛋白。

进一步地，所述突变的TTN基因片段，与野生型肌联蛋白编码基因TNT相比，是在与野生型肌联蛋白编码基因读码框内的20292-20293位核苷酸对应的位置发生c.20292_20293del杂合缺失变异，其中所述野生型肌联蛋白编码基因TTN在Genebank中的登录号为NM 003319.4，，全长82029bp。

本领域技术人员很好理解，基于氨基酸密码子的简并性，编码上述突变蛋白的基因片段可以是多种序列；

优选地，所述的突变的TTN基因片段，其核苷酸序列如Seq ID No.4所示，对应的野生型基因组序列的核苷酸序列为Seq ID No.3，所述c.20292_20293del缺失突变的位置对应在Seq ID No.3所示核苷酸序列的第418-419位。

本发明的再一方面，提供上述突变蛋白的用途，其特征在于，将所述突变蛋白分子用作靶蛋白研发扩张型心肌病的检测试剂盒或治疗药物。

本发明的再一方面，提供上述突变的TTN基因片段的用途，将突变的TTN基因片段作为靶分子片段研发扩张型心肌病检测试剂盒或治疗药物。

本发明的又一方面，提供一种检测扩张型心肌病的试剂盒，其特征在于，包含扩增前述突变的TTN基因的特异性引物对，和/或特异性探针；

其中所述特异性引物对的上游引物结合位置设计在Seq ID No.4所示核苷酸序列的第1-200为核苷酸位置，下游引物结合位置设计在Seq ID No.4所示核苷酸序列的第450-665位核苷酸位置。

优选地，所述试剂盒中，所述特异性引物对如下：

上游引物TTN-E81F，其核苷酸序列为：5′TTGAGTACCTATTCCGTGT 3′，和

下游引物TTN-E81R，其核苷酸序列为：5′TCACTAAGTAAAGTAGGCACA3′。

优选地，所述试剂盒中，还包括阳性对照重组质粒；阴性对照重组质粒；

优选地，还包括DNA提取试剂、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂及增强剂。

优选地，所述对PCR扩增产物进行测序的试剂为Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法用试剂、单链构象多态性(SSCP)分析用试剂和等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)检测用试剂中的一种或多种。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的TTN基因c.20292_20293del杂合缺失变异可以将扩张型心肌病患者和正常人群区分开，因此，该变异可以作为临床辅助诊断扩张型心肌病的生物标志物。

2.通过检测受试者是否携带上述变异，可以早期筛查该变异的携带者，为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，减少患儿出生。

3.为人类攻克扩张型心肌病提供可能的药物治疗靶点，促进创新药物研发。

附图说明

图1是实施例2中扩张型心肌病患者家系图。

图2是扩张型心肌病患者与正常对照的TTN基因测序结果，其中，A为家系中及本地数据库中正常对照的Sanger测序图，B为家系中扩张型心肌病患者的Sanger测序图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

试剂来源

PCR Mix：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：101037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。

Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。

扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

RNase-Free H₂O：购自北京索莱宝科技有限公司。

磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031

886-01C。

实施例1：扩张型心肌病患者/携带者验证实验

样本来源：徐州市中心医院，在扩张型心肌病先证者及家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL全血样本(加入EDTA抗凝，-80℃保存)，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。

随机收集200名与该扩张型心肌病先证者家系无关的健康样本作为验证样本，每位采集2-4mL EDTA抗凝血，-80℃保存。

1.制备基因组DNA

对先证者和验证样本的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用磁珠法全血基因组DNA提取试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。

2.准备PCR反应体系

该PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCRMix 25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H₂O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下表1所示：

表1引物信息

3.目的片段扩增

将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最终72℃延伸2min；4℃保存。

4.PCR产物的检测

取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。

5.PCR产物纯化

PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：

5.1涡旋振荡磁珠30秒，使其彻底混匀为均一溶液。

5.2向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5分钟。

5.3将上一步的离心管放于磁力架上，直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

5.4保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。

5.5向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10秒钟后将离心管重新放回磁力架，静置1分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。

5.6重复步骤5.5。

5.7保持离心管固定于磁力架上静置放置10分钟，使乙醇完全挥发干净。

5.8将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5分钟。

5.9将离心管放于磁力架上直至磁珠完全吸附(约需1分钟)。

5.10将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。

6.Sanger测序

使用AppliedBiosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。

7.测序结果进行生物信息学分析

将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型TTN基因序列(编码基因(mRNA)全序列Genebank ACCESSION NM 003319.4)，在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。

测序后获得的原始数据由Trimmomatic(version 0.36)(可参考Bolger AM，LohseM，Usadel B，Trimmomatic：a flexible trimmer for Illumina sequence data.201430(15)：2114-20，通过参考的方式将其全文并入本文)进行处理，经过过滤去除污染，包括：修剪接头序列，去除低质量的reads；

应用fastp(Chen S，Zhou Y，Chen Y，et al，fastp：an ultra-fast all-in-oneFASTQ preprocessor.201834(17)：i884-i890，通过参考的方式将其全文并入本文)对clean reads进行质量控制，统计每个碱基位置的测序质量平均值以及GC含量分布，保证后续分析的准确性。

使用BWA(version 0.7.12-r1039)(通过Burrows-Wheeler变换比对)比对参考基因组hgl9，获得比对到基因组上的唯一比对序列。

然后利用Samtools(version 1.2)(可参考Li H，Handsaker B，Wysoker A，et al，The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.200925(16)：2078-9，通过参考的方式将其全文并入本文)和VarScan(version v2.3.9)(可参考Koboldt DC，Chen K，Wylie，etal，VarScan：variant detection in massively parallel sequencing of individualand pooled samples.Bioinformatics 2009，25(17)，2283-5，通过参考的方式将其全文并入本文)确定靶区域的SNP和INDEL的基因型。

通过四个公共数据库：dbSNP(version 138)(http：//hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp138.txt.gz.)，

千人数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，ESP数据库(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)，ExAC数据库(http：//exac.hms.harvard.edu/)的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

通过比对正常样本，去掉所有已知变异，同义变异以及非编码区的变异，利用SIFT(可参考Choi Y，Sims GE，Murphy S，et al，Predicting the Functional Effect ofAmino Acid Substitutions and Indels.PLoS ONE 2009，7(10)：e46688，通过参考的方式将其全文并入本文)和Polyphen(可参考Adzhubei IA，Schmidt S，Peshkin L，A methodand server for predicting damaging missense mutations.20107(4)：248-9.通过参考的方式将其全文并入本文)软件进行SNP功能预测，结果提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。另外通过查询ClinVar数据库(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)、HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)数据库以及文献检索均未发现该变异与疾病相关的报导。综合考虑测序质量和生物信息学分析结果，最终发现先证者可能具有致病意义的基因突变(TTN基因c.20292_20293del，p.Tyr6764Ter截短变异)。测序结果显示，先证者有TTN基因c.20292_20293del杂合缺失变异(TTN：p.Tyr6764Ter)，而200名健康的对照成员均未检测到该变异。查询“人群频率数据库”发现该变异为罕见变异，千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无；ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无；ExAC(http：//exac.hms.harvard.edu/)：无。

在发现此变异之前，现有数据库中均未有报道病症相关家系携带有该变异，数据库包括但不限于中国各地区人群。查询ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)、HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)

数据库未发现该变异，文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。

8.基因变异论证

200名表型健康的对照成员均未检测到该变异；扩张型心肌病先证者检测到TTN基因c.20292_20293del杂合缺失变异。

实施例2.无关样本验证实验--扩张型心肌病家系筛查

1.实验方法

招募1个扩张型心肌病家系(家系图如图1所示)，对所有的家系成员(4名家系内患者和5名家系内正常人)进行实验室检查、心电图和动态心电图检查、运动心电图检查和影像学检查，初步确认其符合扩张型心肌病家系特征。

通过基因检测，在该家系中检查到有4名扩张型心肌病病人；据家系成员介绍，该家系中有一名已故成员也是扩张型心肌病患者。

另外招募了1174名未患有扩张型心肌病的健康人群作为对照。

使用实施例1中的方法扩增该家系每个成员以及对照人群的TTN基因c.20292_20293，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。

基于样本信息保密，现公开部分样本信息。

样本可公开信息：

(1)扩张型心肌病家系国别/地区：中国/江苏

家系成员男女比例：5∶6

家系成员年龄分布：27-80岁

(2)对照人群国别/地区：中国

对照人群男女比例：1∶1

对照人群年龄分布：18-65岁

2.结果

Sanger测序结果显示(如图2所示)，招募的扩张型心肌病家系中患病成员均携带c.20292_20293杂合缺失突变；而家系内非患病成员和正常对照人群未见前述任一位点的突变。

实施例3：体外检测扩张型心肌病患者的TTN基因试剂盒

1、试剂盒组成：

2、使用方法：

(1)基因组DNA提取：使用DNA提取试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。

(2)PCR扩增：采用上述的试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。

(3)对PCR扩增产物进行纯化。

(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。

(5)分析测序结果，与野生型编码基因比对确定是否有TTN基因c.20292_20293杂合缺失突变。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 百世诺（北京）医学检验实验室有限公司

<120> 与扩张型心肌病相关的新突变蛋白、新突变基因及其应用

<130> P200337

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1260

<212> PRT

<213> 野生型肌联蛋白的氨基酸序列上第6061-7320位氨基酸序列

<400> 1

Pro Gln Asn Leu Glu Ile Leu Glu Gly Glu Lys Ala Glu Phe Val Cys

1 5 10 15

Ser Ile Ser Lys Glu Ser Phe Pro Val Gln Trp Lys Arg Asp Asp Lys

20 25 30

Thr Leu Glu Ser Gly Asp Lys Tyr Asp Val Ile Ala Asp Gly Lys Lys

35 40 45

Arg Val Leu Val Val Lys Asp Ala Thr Leu Gln Asp Met Gly Thr Tyr

50 55 60

Val Val Met Val Gly Ala Ala Arg Ala Ala Ala His Leu Thr Val Ile

65 70 75 80

Glu Lys Leu Arg Ile Val Val Pro Leu Lys Asp Thr Arg Val Lys Glu

85 90 95

Gln Gln Glu Val Val Phe Asn Cys Glu Val Asn Thr Glu Gly Ala Lys

100 105 110

Ala Lys Trp Phe Arg Asn Glu Glu Ala Ile Phe Asp Ser Ser Lys Tyr

115 120 125

Ile Ile Leu Gln Lys Asp Leu Val Tyr Thr Leu Arg Ile Arg Asp Ala

130 135 140

His Leu Asp Asp Gln Ala Asn Tyr Asn Val Ser Leu Thr Asn His Arg

145 150 155 160

Gly Glu Asn Val Lys Ser Ala Ala Asn Leu Ile Val Glu Glu Glu Asp

165 170 175

Leu Arg Ile Val Glu Pro Leu Lys Asp Ile Glu Thr Met Glu Lys Lys

180 185 190

Ser Val Thr Phe Trp Cys Lys Val Asn Arg Leu Asn Val Thr Leu Lys

195 200 205

Trp Thr Lys Asn Gly Glu Glu Val Pro Phe Asp Asn Arg Val Ser Tyr

210 215 220

Arg Val Asp Lys Tyr Lys His Met Leu Thr Ile Lys Asp Cys Gly Phe

225 230 235 240

Pro Asp Glu Gly Glu Tyr Ile Val Thr Ala Gly Gln Asp Lys Ser Val

245 250 255

Ala Glu Leu Leu Ile Ile Glu Ala Pro Thr Glu Phe Val Glu His Leu

260 265 270

Glu Asp Gln Thr Val Thr Glu Phe Asp Asp Ala Val Phe Ser Cys Gln

275 280 285

Leu Ser Arg Glu Lys Ala Asn Val Lys Trp Tyr Arg Asn Gly Arg Glu

290 295 300

Ile Lys Glu Gly Lys Lys Tyr Lys Phe Glu Lys Asp Gly Ser Ile His

305 310 315 320

Arg Leu Ile Ile Lys Asp Cys Arg Leu Asp Asp Glu Cys Glu Tyr Ala

325 330 335

Cys Gly Val Glu Asp Arg Lys Ser Arg Ala Arg Leu Phe Val Glu Glu

340 345 350

Ile Pro Val Glu Ile Ile Arg Pro Pro Gln Asp Ile Leu Glu Ala Pro

355 360 365

Gly Ala Asp Val Val Phe Leu Ala Glu Leu Asn Lys Asp Lys Val Glu

370 375 380

Val Gln Trp Leu Arg Asn Asn Met Val Val Val Gln Gly Asp Lys His

385 390 395 400

Gln Met Met Ser Glu Gly Lys Ile His Arg Leu Gln Ile Cys Asp Ile

405 410 415

Lys Pro Arg Asp Gln Gly Glu Tyr Arg Phe Ile Ala Lys Asp Lys Glu

420 425 430

Ala Arg Ala Lys Leu Glu Leu Ala Ala Ala Pro Lys Ile Lys Thr Ala

435 440 445

Asp Gln Asp Leu Val Val Asp Val Gly Lys Pro Leu Thr Met Val Val

450 455 460

Pro Tyr Asp Ala Tyr Pro Lys Ala Glu Ala Glu Trp Phe Lys Glu Asn

465 470 475 480

Glu Pro Leu Ser Thr Lys Thr Ile Asp Thr Thr Ala Glu Gln Thr Ser

485 490 495

Phe Arg Ile Leu Glu Ala Lys Lys Gly Asp Lys Gly Arg Tyr Lys Ile

500 505 510

Val Leu Gln Asn Lys His Gly Lys Ala Glu Gly Phe Ile Asn Leu Lys

515 520 525

Val Ile Asp Val Pro Gly Pro Val Arg Asn Leu Glu Val Thr Glu Thr

530 535 540

Phe Asp Gly Glu Val Ser Leu Ala Trp Glu Glu Pro Leu Thr Asp Gly

545 550 555 560

Gly Ser Lys Ile Ile Gly Tyr Val Val Glu Arg Arg Asp Ile Lys Arg

565 570 575

Lys Thr Trp Val Leu Ala Thr Asp Arg Ala Glu Ser Cys Glu Phe Thr

580 585 590

Val Thr Gly Leu Gln Lys Gly Gly Val Glu Tyr Leu Phe Arg Val Ser

595 600 605

Ala Arg Asn Arg Val Gly Thr Gly Glu Pro Val Glu Thr Asp Asn Pro

610 615 620

Val Glu Ala Arg Ser Lys Tyr Asp Val Pro Gly Pro Pro Leu Asn Val

625 630 635 640

Thr Ile Thr Asp Val Asn Arg Phe Gly Val Ser Leu Thr Trp Glu Pro

645 650 655

Pro Glu Tyr Asp Gly Gly Ala Glu Ile Thr Asn Tyr Val Ile Glu Leu

660 665 670

Arg Asp Lys Thr Ser Ile Arg Trp Asp Thr Ala Met Thr Val Arg Ala

675 680 685

Glu Asp Leu Ser Ala Thr Val Thr Asp Val Val Glu Gly Gln Glu Tyr

690 695 700

Ser Phe Arg Val Arg Ala Gln Asn Arg Ile Gly Val Gly Lys Pro Ser

705 710 715 720

Ala Ala Thr Pro Phe Val Lys Val Ala Asp Pro Ile Glu Arg Pro Ser

725 730 735

Pro Pro Val Asn Leu Thr Ser Ser Asp Gln Thr Gln Ser Ser Val Gln

740 745 750

Leu Lys Trp Glu Pro Pro Leu Lys Asp Gly Gly Ser Pro Ile Leu Gly

755 760 765

Tyr Ile Ile Glu Arg Cys Glu Glu Gly Lys Asp Asn Trp Ile Arg Cys

770 775 780

Asn Met Lys Leu Val Pro Glu Leu Thr Tyr Lys Val Thr Gly Leu Glu

785 790 795 800

Lys Gly Asn Lys Tyr Leu Tyr Arg Val Ser Ala Glu Asn Lys Ala Gly

805 810 815

Val Ser Asp Pro Ser Glu Ile Leu Gly Pro Leu Thr Ala Asp Asp Ala

820 825 830

Phe Val Glu Pro Thr Met Asp Leu Ser Ala Phe Lys Asp Gly Leu Glu

835 840 845

Val Ile Val Pro Asn Pro Ile Thr Ile Leu Val Pro Ser Thr Gly Tyr

850 855 860

Pro Arg Pro Thr Ala Thr Trp Cys Phe Gly Asp Lys Val Leu Glu Thr

865 870 875 880

Gly Asp Arg Val Lys Met Lys Thr Leu Ser Ala Tyr Ala Glu Leu Val

885 890 895

Ile Ser Pro Ser Glu Arg Ser Asp Lys Gly Ile Tyr Thr Leu Lys Leu

900 905 910

Glu Asn Arg Val Lys Thr Ile Ser Gly Glu Ile Asp Val Asn Val Ile

915 920 925

Ala Arg Pro Ser Ala Pro Lys Glu Leu Lys Phe Gly Asp Ile Thr Lys

930 935 940

Asp Ser Val His Leu Thr Trp Glu Pro Pro Asp Asp Asp Gly Gly Ser

945 950 955 960

Pro Leu Thr Gly Tyr Val Val Glu Lys Arg Glu Val Ser Arg Lys Thr

965 970 975

Trp Thr Lys Val Met Asp Phe Val Thr Asp Leu Glu Phe Thr Val Pro

980 985 990

Asp Leu Val Gln Gly Lys Glu Tyr Leu Phe Lys Val Cys Ala Arg Asn

995 1000 1005

Lys Cys Gly Pro Gly Glu Pro Ala Tyr Val Asp Glu Pro Val Asn

1010 1015 1020

Met Ser Thr Pro Ala Thr Val Pro Asp Pro Pro Glu Asn Val Lys

1025 1030 1035

Trp Arg Asp Arg Thr Ala Asn Ser Ile Phe Leu Thr Trp Asp Pro

1040 1045 1050

Pro Lys Asn Asp Gly Gly Ser Arg Ile Lys Gly Tyr Ile Val Glu

1055 1060 1065

Arg Cys Pro Arg Gly Ser Asp Lys Trp Val Ala Cys Gly Glu Pro

1070 1075 1080

Val Ala Glu Thr Lys Met Glu Val Thr Gly Leu Glu Glu Gly Lys

1085 1090 1095

Trp Tyr Ala Tyr Arg Val Lys Ala Leu Asn Arg Gln Gly Ala Ser

1100 1105 1110

Lys Pro Ser Arg Pro Thr Glu Glu Ile Gln Ala Val Asp Thr Gln

1115 1120 1125

Glu Ala Pro Glu Ile Phe Leu Asp Val Lys Leu Leu Ala Gly Leu

1130 1135 1140

Thr Val Lys Ala Gly Thr Lys Ile Glu Leu Pro Ala Thr Val Thr

1145 1150 1155

Gly Lys Pro Glu Pro Lys Ile Thr Trp Thr Lys Ala Asp Met Ile

1160 1165 1170

Leu Lys Gln Asp Lys Arg Ile Thr Ile Glu Asn Val Pro Lys Lys

1175 1180 1185

Ser Thr Val Thr Ile Val Asp Ser Lys Arg Ser Asp Thr Gly Thr

1190 1195 1200

Tyr Ile Ile Glu Ala Val Asn Val Cys Gly Arg Ala Thr Ala Val

1205 1210 1215

Val Glu Val Asn Val Leu Asp Lys Pro Gly Pro Pro Ala Ala Phe

1220 1225 1230

Asp Ile Thr Asp Val Thr Asn Glu Ser Cys Leu Leu Thr Trp Asn

1235 1240 1245

Pro Pro Arg Asp Asp Gly Gly Ser Lys Ile Thr Asn

1250 1255 1260

<210> 2

<211> 703

<212> PRT

<213> 发生p.Tyr6764Ter截短变异的肌联蛋白的氨基酸序列片段

<400> 2

Pro Gln Asn Leu Glu Ile Leu Glu Gly Glu Lys Ala Glu Phe Val Cys

1 5 10 15

Ser Ile Ser Lys Glu Ser Phe Pro Val Gln Trp Lys Arg Asp Asp Lys

20 25 30

Thr Leu Glu Ser Gly Asp Lys Tyr Asp Val Ile Ala Asp Gly Lys Lys

35 40 45

Arg Val Leu Val Val Lys Asp Ala Thr Leu Gln Asp Met Gly Thr Tyr

50 55 60

Val Val Met Val Gly Ala Ala Arg Ala Ala Ala His Leu Thr Val Ile

65 70 75 80

Glu Lys Leu Arg Ile Val Val Pro Leu Lys Asp Thr Arg Val Lys Glu

85 90 95

Gln Gln Glu Val Val Phe Asn Cys Glu Val Asn Thr Glu Gly Ala Lys

100 105 110

Ala Lys Trp Phe Arg Asn Glu Glu Ala Ile Phe Asp Ser Ser Lys Tyr

115 120 125

Ile Ile Leu Gln Lys Asp Leu Val Tyr Thr Leu Arg Ile Arg Asp Ala

130 135 140

His Leu Asp Asp Gln Ala Asn Tyr Asn Val Ser Leu Thr Asn His Arg

145 150 155 160

Gly Glu Asn Val Lys Ser Ala Ala Asn Leu Ile Val Glu Glu Glu Asp

165 170 175

Leu Arg Ile Val Glu Pro Leu Lys Asp Ile Glu Thr Met Glu Lys Lys

180 185 190

Ser Val Thr Phe Trp Cys Lys Val Asn Arg Leu Asn Val Thr Leu Lys

195 200 205

Trp Thr Lys Asn Gly Glu Glu Val Pro Phe Asp Asn Arg Val Ser Tyr

210 215 220

Arg Val Asp Lys Tyr Lys His Met Leu Thr Ile Lys Asp Cys Gly Phe

225 230 235 240

Pro Asp Glu Gly Glu Tyr Ile Val Thr Ala Gly Gln Asp Lys Ser Val

245 250 255

Ala Glu Leu Leu Ile Ile Glu Ala Pro Thr Glu Phe Val Glu His Leu

260 265 270

Glu Asp Gln Thr Val Thr Glu Phe Asp Asp Ala Val Phe Ser Cys Gln

275 280 285

Leu Ser Arg Glu Lys Ala Asn Val Lys Trp Tyr Arg Asn Gly Arg Glu

290 295 300

Ile Lys Glu Gly Lys Lys Tyr Lys Phe Glu Lys Asp Gly Ser Ile His

305 310 315 320

Arg Leu Ile Ile Lys Asp Cys Arg Leu Asp Asp Glu Cys Glu Tyr Ala

325 330 335

Cys Gly Val Glu Asp Arg Lys Ser Arg Ala Arg Leu Phe Val Glu Glu

340 345 350

Ile Pro Val Glu Ile Ile Arg Pro Pro Gln Asp Ile Leu Glu Ala Pro

355 360 365

Gly Ala Asp Val Val Phe Leu Ala Glu Leu Asn Lys Asp Lys Val Glu

370 375 380

Val Gln Trp Leu Arg Asn Asn Met Val Val Val Gln Gly Asp Lys His

385 390 395 400

Gln Met Met Ser Glu Gly Lys Ile His Arg Leu Gln Ile Cys Asp Ile

405 410 415

Lys Pro Arg Asp Gln Gly Glu Tyr Arg Phe Ile Ala Lys Asp Lys Glu

420 425 430

Ala Arg Ala Lys Leu Glu Leu Ala Ala Ala Pro Lys Ile Lys Thr Ala

435 440 445

Asp Gln Asp Leu Val Val Asp Val Gly Lys Pro Leu Thr Met Val Val

450 455 460

Pro Tyr Asp Ala Tyr Pro Lys Ala Glu Ala Glu Trp Phe Lys Glu Asn

465 470 475 480

Glu Pro Leu Ser Thr Lys Thr Ile Asp Thr Thr Ala Glu Gln Thr Ser

485 490 495

Phe Arg Ile Leu Glu Ala Lys Lys Gly Asp Lys Gly Arg Tyr Lys Ile

500 505 510

Val Leu Gln Asn Lys His Gly Lys Ala Glu Gly Phe Ile Asn Leu Lys

515 520 525

Val Ile Asp Val Pro Gly Pro Val Arg Asn Leu Glu Val Thr Glu Thr

530 535 540

Phe Asp Gly Glu Val Ser Leu Ala Trp Glu Glu Pro Leu Thr Asp Gly

545 550 555 560

Gly Ser Lys Ile Ile Gly Tyr Val Val Glu Arg Arg Asp Ile Lys Arg

565 570 575

Lys Thr Trp Val Leu Ala Thr Asp Arg Ala Glu Ser Cys Glu Phe Thr

580 585 590

Val Thr Gly Leu Gln Lys Gly Gly Val Glu Tyr Leu Phe Arg Val Ser

595 600 605

Ala Arg Asn Arg Val Gly Thr Gly Glu Pro Val Glu Thr Asp Asn Pro

610 615 620

Val Glu Ala Arg Ser Lys Tyr Asp Val Pro Gly Pro Pro Leu Asn Val

625 630 635 640

Thr Ile Thr Asp Val Asn Arg Phe Gly Val Ser Leu Thr Trp Glu Pro

645 650 655

Pro Glu Tyr Asp Gly Gly Ala Glu Ile Thr Asn Tyr Val Ile Glu Leu

660 665 670

Arg Asp Lys Thr Ser Ile Arg Trp Asp Thr Ala Met Thr Val Arg Ala

675 680 685

Glu Asp Leu Ser Ala Thr Val Thr Asp Val Val Glu Gly Gln Glu

690 695 700

<210> 3

<211> 665

<212> DNA

<213> 野生型扩增序列

<400> 3

ttgagtacct attccgtgtg agtgcaagaa acagagttgg cactggtgag ccagtagaaa 60

ctgacaatcc tgtagaagca aggagtaaat atggtaagaa gttttaagta aattcaagtt 120

agcttttaag taaattgcag tctttgcctt catcatcgtt accccaaact catattttct 180

tcttctgtgg tgaaatccag atgttccagg ccctcctttg aatgtaacca tcactgatgt 240

gaatcgattt ggtgtctcac tgacatggga accaccagag tatgatggag gtgctgagat 300

cacaaactac gtcattgaat taagagacaa gacttctatc aggtgggata ctgccatgac 360

tgtgagagct gaagacctgt ctgcaactgt tactgatgtg gtagaaggac aggagtacag 420

tttccgagtg agagcccaaa atcgaattgg agttggaaaa ccaagtgcag ccacaccctt 480

cgtcaaagtt gctgatccaa ttggtaagcc catcaaaaaa gggaaataat tactgcatga 540

aatccagata ttaggcctat caattaaaat aaatcaagtt aaatgaaagt taataaaaag 600

gtagaatatc ataaaaattt ggataaagtt ttagaaaccc agactgtgcc tactttactt 660

agtga 665

<210> 4

<211> 663

<212> DNA

<213> TTN缺失突变型扩增序列

<400> 4

ttgagtacct attccgtgtg agtgcaagaa acagagttgg cactggtgag ccagtagaaa 60

ctgacaatcc tgtagaagca aggagtaaat atggtaagaa gttttaagta aattcaagtt 120

agcttttaag taaattgcag tctttgcctt catcatcgtt accccaaact catattttct 180

tcttctgtgg tgaaatccag atgttccagg ccctcctttg aatgtaacca tcactgatgt 240

gaatcgattt ggtgtctcac tgacatggga accaccagag tatgatggag gtgctgagat 300

cacaaactac gtcattgaat taagagacaa gacttctatc aggtgggata ctgccatgac 360

tgtgagagct gaagacctgt ctgcaactgt tactgatgtg gtagaaggac aggagta g 420

tttccgagtg agagcccaaa atcgaattgg agttggaaaa ccaagtgcag ccacaccctt 480

cgtcaaagtt gctgatccaa ttggtaagcc catcaaaaaa gggaaataat tactgcatga 540

aatccagata ttaggcctat caattaaaat aaatcaagtt aaatgaaagt taataaaaag 600

gtagaatatc ataaaaattt ggataaagtt ttagaaaccc agactgtgcc tactttactt 660

agtga 665

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> TTN-E81F

<400> 5

ttgagtacct attccgtgt 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> TTN-E81R

<400> 6

tcactaagta aagtaggcac a 21

Claims

1.一种检测突变的TTN基因片段的试剂在制备扩张型心肌病检测试剂盒中的用途，所述TTN基因片段的核苷酸序列如Seq ID No.4所示，其对应的野生型基因组序列的核苷酸序列为Seq ID No.3所示，所述突变为缺失突变，所述缺失突变的位置对应Seq ID No.3所示核苷酸序列的第418-419位碱基处。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包含特异性引物：

正向引物：TTN-E81F其核苷酸序列为：5' TTGAGTACCTATTCCGTGT 3'，和

反向引物：TTN-E81R其核苷酸序列为：5' TCACTAAGTAAAGTAGGCACA 3'。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包含Sanger测序试剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂还包含阳性对照重组质粒和阴性对照重组质粒。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂还包括DNA提取试剂、Taq DNAPolymerase、PCR Buffer、Mg²⁺、dNTPs、PCR稳定剂及增强剂。