CN113699226A - 一种ttn突变基因及扩张型心肌病检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域,具体涉及了一种TTN突变基因,在基因组位置chr2:179655434处,碱基G突变为碱基A;参考基因组版本是GRCh37。本发明还涉及一种扩张型心肌病检测试剂盒。本发明提供的人类TTN突变基因可以将扩张型心肌病患者和正常人群区分开,可以作为临床辅助诊断扩张型心肌病的生物标志物;检测该变异的携带者,可以为受试者提供优生优育指导和遗传咨询,减少患儿出生;为人类攻克扩张型心肌病提供可能的药物靶点,促进创新药物研发。
Description
技术领域
本发明涉及人类遗传学和内科心血管技术领域,尤其涉及一种TTN突变基因及扩张型心肌病检测试剂盒。
背景技术
扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)是一种原因不明的,以心腔左心室和/或双心室扩大,心肌收缩功能减弱为主要特征的心肌疾病。临床表现为进行性加重的心力衰竭、心律失常、血栓栓塞或猝死。
DCM的发病与遗传因素有关,根据遗传方式的不同,可以将DCM的致病基因分为常染色体显性致病基因和X连锁遗传致病基因,常染色体显性致病基因有TTN基因、ACTC基因、DES基因、MYH7基因、LMNA基因和TTNT2基因等。其中,TTN基因位于常染色体2p31,编码肌联蛋白(Titin蛋白),Titin蛋白是肌肉细胞中的细丝,分子量高达3000kda(约3.0×106u),几乎跨越了肌小节的一半。心肌收缩和舒张需要“传感器”将生物信号转成机械力,Titin蛋白就是这样一类传感器,会随着肌肉的收缩为折叠,会随着肌肉的舒张而伸展,维持肌肉弹性。
TTN基因与DCM的发病密切相关,但是目前报道的TTN基因的突变位点还非常有限,发现任何一个TTN基因的突变位点都是对本领域的重要技术贡献,都有助于预防或诊断DCM,为更多患者带来新生的希望。
发明内容
本发明的目的在于针对上述缺陷,提供一种TTN突变基因及扩张型心肌病检测试剂盒。
本发明通过对扩张型心肌病的家系成员进行分析,意料不到地发现了,家系中的扩张型心肌病患者具有如下突变:
基因 | 基因组位置 | 转录本号 | 外显子号 | 碱基改变 | 参考基因组版本 |
TTN | chr2:179655434 | NM_001267550 | exon11 | c.1800+1G>A | GRCh37/hg19 |
在基因组位置chr2:179655419-chr2:179655468处,野生型TTN基因的序列为,具体序列为ACAACAAGATCAAATGCACCTAAGTTATGAAAAGgtgatg acttcctgcc,其中g为突变前碱基。
在基因组位置chr2:179655419-chr2:179655468处,TTN突变基因的序列为SEQ IDNO:2。
具体序列为ACAACAAGATCAAATGCACCTAAGTTATGAAAAGAtgatgacttcctgcc,其中A为突变后碱基。
基于以上发现,本发明提供的技术方案如下:
一、本发明提供一种TTN突变基因,在基因组位置chr2:179655434处,碱基G突变为碱基A;参考基因组版本是GRCh37。
本发明可以采用基因组位置和基因组版本限定TTN突变基因,也可以通过TTN基因的CDS区域限定TTN突变基因(c.1800+1G>A),两种不同维度的限定方式得到的TTN突变基因相同。
二、本发明还提供了上述TTN突变基因在制备扩张型心肌病检测试剂盒中的应用。
三、本发明还提供了一种扩张型心肌病检测试剂盒,包括用于检测TTN突变基因的引物,引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
四、本发明的有益效果在于:
TTN突变基因可以作为临床辅助诊断扩张型心肌病的生物标志物,为人类攻克扩张型心肌病提供可能的药物靶点,促进创新药物研发。
TTN突变基因,以及基于TN突变基因开发的扩张型心肌病检测试剂盒,可以明确家系成员所检出变异的携带情况,对携带者进行风险评估,提前干预恶性心脏事件的发生;还能够为受试者提供优生优育指导和遗传咨询,减少患儿出生。
附图说明
图1为扩张型心肌病家系图;
图2为先证者及先证者哥哥的Sanger测序图;
图3为家系中非患病成员Sanger测序图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明:
实施例1-先证者验证实验
样本来源:武汉亚洲心脏病医院,在先证者(男,16岁)及其家属自愿签署知情同意书的前提下,寄送5-10mL全血样本,建立病历资料库,详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
先证者临床概况:
表1先证者的临床概况
采用Sanger测序法对先证者及其家属的TTN基因进行基因检测,具体步骤如下:
S1、提取基因组DNA;
采用江苏百世诺医疗科技有限公司的磁珠法全血基因组DNA提取试剂对先证者及其家属的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取,对DNA的浓度和纯度进行检测。
S2、使用经设计的引物组合对TTN基因进行扩增;
(1)配制PCR扩增试剂,PCR扩增试剂的组成具体参见下表2:
表2 PCR扩增试剂的组成
2×Taq MasterMix(Dye)中包含如下成分:Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2 +、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组份。
扩增所需的引物信息如下表3所示:
表3引物信息
序列编号 | 引物名称 | 序列(5’→3’) |
SEQ ID NO:3 | 正向引物(TTN-E11F) | CCCCTGAAATGGAAATCTGAC |
SEQ ID NO:4 | 反向引物(TTN-E11R) | ACTTGTTTACGGACATCTGC |
(2)目的片段扩增
将反应体系混合,在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应,扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸30s,共30循环。72℃终延伸2min。
取2μL的PCR产物,使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,选用1000bp Marker作为参考。
S3、采用3730XL Genetic Analyzer全自动测序仪对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对。
结果表明如图1-图3所示,先证者携带的TTN基因c.1800+1G>A杂合错义变异遗传自先证者父亲,先证者父亲又遗传自先证者爷爷。家系中,先证者姑姑、先证者姑姑的儿子,以及先证者姑姑的孙女也携带有TTN基因c.1800+1G>A杂合错义变异。
该致病突变较明确,后期为携带者建立随访计划,并提供与生育等有关的遗传咨询。
实施例2-一种扩张型心肌病检测试剂盒
本实施例提供用于检测人类TTN基因c.1800+1G>A杂合错义变异的试剂盒,包括2×Taq MasterMix(Dye)、根据TTN突变基因设计的引物等,试剂盒的具体组成如下表4所示。
利用本试剂盒筛选扩张型心肌病的具体步骤为:按照实施例1的步骤提取待测者DNA,然后使用经设计的引物组合(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)对TTN基因进行扩增,得到PCR产物,最后对PCR产物进行测序。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得参考序列和测序结果进行比对,判断待测者TTN基因是否携带c.1800+1G>A杂合错义变异,协助临床确诊待测者是否患有扩张型心肌病。
表4试剂盒组成
实施例3针对家系外的正常人的突变验证
参照实施例1的方法,对289例同种族无关正常人(即家系外正常人)进行TTN基因c.1800+1G>A突变位点检测,结果均未能检测到该突变,再次证明了TTN基因的c.1800+1G>A杂合错义变异为扩张型心肌病的致病突变。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 百世诺(北京)医疗科技有限公司
<120> 一种TTN突变基因及扩张型心肌病检测试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
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cccctgaaat ggaaatctga c 21
<210> 4
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<212> DNA
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acttgtttac ggacatctgc 20
Claims (4)
1.一种TTN突变基因,其特征在于,在基因组位置chr2:179655434处,碱基G突变为碱基A;参考基因组版本是GRCh37。
2.根据权利要求1所述的TTN突变基因,其特征在于,在基因组位置chr2:179655419-chr2:179655468处,TTN突变基因的序列为SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求1或2所述的TTN突变基因在制备扩张型心肌病检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求2所述的扩张型心肌病检测试剂盒,其特征在于,包括用于检测TTN突变基因的引物,引物序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20211126 |