CN113999901B

CN113999901B - 心肌特异性甲基化标记物

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Publication number: CN113999901B
Application number: CN202111263173.9A
Authority: CN
Inventors: 宋雷; 文路; 汤富酬; 王继征; 任杰; 姜琳
Original assignee: Peking University; Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Peking University; Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2041-10-28
Also published as: CN113999901A

Abstract

本发明涉及心脏特异性游离DNA甲基化标志物及其在急性心肌梗死诊断中的用途。具体而言，本发明涉及用于检测CGI区域的正向引物和反向引物以及探针。本发明还涉及包含所述引物和探针的组合物、试剂盒。本发明利用MCTA‑Seq技术，鉴定出心脏特异性甲基化标志物，并开发了用于无创检测心脏损伤的ddPCR检测方法，能够通过血浆cfDNA有效地检测出急性心肌梗死。

Description

心肌特异性甲基化标记物

技术领域

本发明涉及生物检测领域，并具体涉及心脏特异性游离DNA甲基化标志物及其在急性心肌梗死诊断相关领域中的用途。

背景技术

心血管疾病(包括急性心肌梗死(AMI))是世界范围内主要的死亡原因。心肌梗死与心肌细胞的死亡有着密切的关系。心肌细胞发生损伤时可在血液中检测到心肌肌钙蛋白。在现有的AMI诊断方式中，超敏肌钙蛋白(hs-cTn)被广泛用于AMI诊断，但是其对早期AMI患者的诊断准确率不够高。

越来越多的研究显示，循环游离DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)已经日益成为诊断和监测疾病的有力工具。目前，cfDNA已成功用于临床无创产前检查和肿瘤液体活检，并且cfDNA在移植排斥中的应用也处于正在进行的研究之中。但是，这种基于基因的诊断工具不适用于其中cfDNA来源于具有正常基因组的组织。

先前的研究表明，AMI患者的cfDNA浓度较正常人升高，并且系列采样显示cfDNA的峰值通常晚于肌酸激酶(CK)-MB(CK-MB，其是CK的三种同功酶之一)，但是增加的cfDNA的来源尚不清楚。

在最近一项里程碑式的研究中，Zemmour等研究人员证实了来自垂死的心肌细胞的DNA能够以cfDNA的形式释放到血液中。

另据报道，标志物FAM101A是心肌细胞中细胞类型特异性的非甲基化标志物，并且在干预和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)之前，AMI患者血浆中的非甲基化FAM101A水平升高。相对于非甲基化的标志物，肿瘤或组织特异性的高甲基化标志物的研究更为广泛，但目前尚无心脏特异性高甲基化标志物的报道。另外，尽管Zemmour等已经报道了FAM101A的微滴式数字PCR(ddPCR)分析，但由于非甲基化CpG位点之间的距离过长，因此效果仍欠佳。作为稳定的组织特异性表观遗传学修饰，DNA甲基化最近已经被研究用于评估cfDNA的组织来源。在血浆cfDNA组织来源的研究过程中，研究人员已经建立了使用全基因组和靶标富集DNA甲基化方法对组织部分进行反卷积分析的算法。

此外，由于心血管疾病诊断的需要较高的时效性，因而开发出针对心脏特异性标志物的快速简单的PCR方法非常重要。因此，在心血管疾病的诊断中，仍然存在对能够早期检测AMI的快速简单且有效的检测方法的需要。

发明内容

本发明利用基于基因组DNA的甲基化测序技术，甲基化CpG串联扩增和测序(MCTA-Seq)，探索心脏特异性的高甲基化标志物，以有效检测血液中的心脏损伤信号。本发明通过比较健康受试者的心脏、肝脏组织、白细胞和血浆的所有CpG岛(CpG island,CGI)位点的MCTA-Seq甲基化测序数据来选择潜在的心脏特异性标志物。本发明鉴定了CGI_CORO6基因座为心脏特异性高甲基化标志物，设计了相应的ddPCR测定，其能够有效检测AMI。本发明还发现PCI术后升高的总cfDNA水平来自心脏和白细胞(WBC)。

在一方面，本发明涉及用于在个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括一个或多个如表1所记载的CGI区域，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在一个实施方案中，所述甲基化标志物包括如表1所记载的5个CGI区域。

在另一方面，本发明涉及检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，所述评估包括在来自所述个体的生物样品中检测一个或多个CGI区域并将所述CGI区域的甲基化水平与对照进行比较，其中所述CGI区域的具体信息如表1所记载，其中相对于对照而言，一个或多个所述CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在一个实施方案中，所述生物样品是选自血液、全血或血浆的生物样品；任选地，所述生物样品是包含循环游离DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)的样品。

在又一方面，本发明涉及用于检测CGI区域的引物，所述引物扩增如表1所记载的CGI区域中的一个或多个CGI区域，任选地，引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测CGI_CORO6区域；任选地，所述正向引物包含5’-GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG-3’，所述反向引物包含5’-CGAAACTCGCAATCCAACCTC-3’。

在另一方面，本发明涉及检测生物样品中一个或多个CGCGCGG-CpG区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测个体中一个或多个CGI区域，所述检测包括：

1)从个体中提取DNA样品；

2)扩增至少一个CGI区域，所述CGI区域选自如表1所记载的区域；

3)测定所述CGI区域的甲基化水平，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在另一方面，本发明涉及用于检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求5所述的引物和扩增DNA所需的一种或多种试剂，所述试剂选自扩增缓冲液、dNTP和扩增DNA所需的酶；其中所述试剂盒用于诊断心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在又一方面，本发明涉及检测生物样品中一个或多个CGI区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，其中所述CGI区域选自如表1所记载的CGI区域，其中相对于对照而言，所述个体中一个或多个CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在另一方面，本发明涉及检测生物样品中一个或多个DNA区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，其中所述评估包括在来自所述个体的生物样品中检测一个或多个DNA区域并将所述DNA区域的甲基化水平与对照进行比较，其中所述DNA区域选自下列一个或多个CGI：

(1)CGI_CORO6:chr17:27942532-27945388，

(2)CGI_CACNA1C:chr12:2800139-2801062，

(3)CGI_CRIP1:chr14:105952603-105954296，

(4)CGI_OBSCN:chr1:228565949-228567121，

(5)CGI_ZNF503-AS2:chr10:77155128-77169600

其中相对于对照而言，一个或多个所述DNA区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在又一方面，本发明涉及本发明的引物或引物对在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒；任选地，所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA；进一步任选地，所述生物样品选自血液、全血或血浆；任选地，所述试剂盒还包含探针。

在一个方面，本发明提供引物对，其包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测CGI_CORO6；任选地，所述正向引物包含5’-GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG-3’，所述反向引物包含5’-CGAAACTCGCAATCCAACCTC-3’。

在另一个方面，本发明提供组合物，其包含引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测CGI_CORO6；任选地，所述正向引物包含5’-GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG-3’，所述反向引物包含5’-CGAAACTCGCAATCCAACCTC-3’。

在一个实施方案中，本发明的组合物还包含探针；任选地，所述探针的序列包含5’-AGATTTACGTCGTTTTAGCG-3’。

在另一个实施方案中，本发明的所述探针是经标记的；任选地，所述探针是经荧光标记的；进一步任选地，所述探针是由选自FAM、VIC和MGB的荧光团标记；又进一步任选地，所述探针包含5’-FAM-AGATTTACGTCGTTTTAGCG-MGB-3’。

在又一个方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明的引物对或组合物，其中所述试剂盒用于诊断心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在一个实施方案中，本发明的所述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒；任选地，所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA；进一步任选地，所述生物样品选自血液、全血或血浆。

在另一个方面，本发明提供本发明的引物对或组合物在制备试剂盒中的用途；任选地，所述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒；进一步任选地，所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA；又进一步任选地，所述生物样品选自血液、全血或血浆。

在又一个方面，本发明提供甲基化标志物或甲基化标志物的组合在制备试剂盒中的用途，所述甲基化标志物选自CORO6基因、CRIP1基因、OBSCN基因、CACNA1C基因、ZNF503-AS2基因；任选地，所述甲基化标志物选自位于CORO6基因的基因内区的CGI区域、位于CRIP1基因的启动子区的CGI区域、位于OBSCN基因的3’端的CGCGCGG-CpG区域、位于CACNA1C基因的启动子区的CGI区域、位于ZNF503-AS2基因的启动子区的CGI区域；进一步任选地，所述CGI区域选自CORO6基因、CRIP1基因、OBSCN基因、CACNA1C基因、ZNF503-AS2基因；任选地，所述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒；进一步任选地，所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA；又进一步任选地，所述生物样品选自血液、全血或血浆。

在另一个方面，本发明提供试剂盒，其包含检测甲基化标志物或甲基化标志物的组合的试剂，所述甲基化标志物选自CORO6基因、CRIP1基因、OBSCN基因、CACNA1C基因、ZNF503-AS2基因；任选地，所述甲基化标志物选自位于CORO6基因的基因内区的CGI区域、位于CRIP1基因的启动子区的CGI区域、位于OBSCN基因的3’端的CGI区域、位于CACNA1C基因的启动子区的CGI区域、位于ZNF503-AS2基因的启动子区的CGI区域；进一步任选地，所述CGI区域选自CGI_7630、CGI_4518、CGI_13274、CGI_3122-1、CGI_3122-2、CGI_977；其中所述试剂盒用于诊断心血管疾病；任选地，所述心血管疾病是心肌梗死；进一步任选地，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在一个实施方案中，前述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒；任选地，所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA；进一步任选地，所述生物样品选自血液、全血或血浆。

本发明的有益效果：

本发明利用MCTA-Seq技术，鉴定出了心脏特异性甲基化标志物，CORO6；探索了AMI患者中增加的cfDNA的组织来源，发现PCI术后升高的总cfDNA水平来自心脏和白细胞(WBC)；并开发了用于无创检测心脏损伤的ddPCR检测方法，能够通过血浆cfDNA有效地检测出AMI。

附图说明

图1显示的是通过MCTA-Seq鉴定心脏特异性高甲基化标志物。图1A的热图展示了本发明鉴定出的6种心脏特异性高甲基化标志物在包括心脏和白细胞的9种不同组织中的表达水平，其中每一行代表一种标志物，而每一列代表一种组织。通过标志物(n＝6)在组织中的甲基化水平来对它们进行排序，所述甲基化水平是通过它们的MCTA-Seq的每百万已定位的测序片段中甲基化等位基因数(MePM)值计算得到的。在该热图中，蓝色表示低DNA甲基化值，白色和黄色表示中DNA甲基化值，红色表示高DNA甲基化值，其以log₂(MePM)显示。以log₂(z-score)显示表达水平。图1B柱状图展示了6种心脏特异性标志物在9种不同组织中的总甲基化值(MePM)。图1C为6种代表性心脏特异性标志物在AMI患者(n＝20)血浆、正常对照样品(PN，n＝202)以及在白细胞(WBC，n＝81)中的甲基化水平的比较。****P<0.0001，双尾MWW检验。

图2是不同时间点下AMI血浆心脏来源cfDNA的动态变化。图2A为不同时间点下AMI(D0、D1、D2分别表示PCI术前入院时(n＝22)、术后第一天(n＝22)、术后第二天(n＝22))与正常对照(PN，n＝67)血浆cfDNA总量(ng/mL)的比较。纵坐标轴经过log₂转换。图2B为不同时间点下AMI与正常对照血浆来自心脏的cfDNA比例(％)的比较。图2C为不同时间点下AMI与正常对照血浆中来自各种组织的cfDNA量(GE/mL)。*P<0.1，**P<0.01，****P<0.0001，ns，无显著差异，双尾MWW检验。

图3为不同时间点(A、B和C)下通过AMI与正常对照血浆来自心脏的cfDNA比例(％)来诊断AMI的受试者特征(ROC)曲线，D0、D1、D2对应曲线下面积(AUC)值分别为0.8224、0.9239、0.7970。

图4是ddPCR方法检测AMI的结果。图4A为基于ddPCR检测CORO6负链中3个CpG位点甲基化状态的方法示意图(其中小写t表示原始序列为C在亚硫酸氢盐处理后转变为T，大写T表示原始序列为T)；FAM和VIC探针分别用于甲基化和非甲基化状态的检测。图4B为ddPCR检测CORO6位点(CGI_CORO6)在不同组织、富集的心肌细胞和WBC中的甲基化情况，用甲基化CORO6位点的比例表示(％)。图4C为ddPCR对甲基化的CORO6位点(CGI_CORO6)在AMI和正常对照血浆中的拷贝数进行定量(copies/mL)。图4D为通过AMI和健康对照组血浆中甲基化的CORO6位点的绝对浓度来诊断AMI的受试者特征(ROC)曲线，曲线下面积(AUC)值为0.6751。**P<0.01，双尾MWW检验。

具体实施方式

本发明可通过以下实施方案进行实施，但本发明并不限于此。

本文所用的术语具有本发明相关领域的普通技术人员所通常理解的含义。术语如“一个”、“一种”和“所述”不旨在仅指单数的实体，而是包括可用于说明特定实施方案的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但它们的使用并不限定本发明的范围，除非在权利要求中明确指出。

本发明所述“个体”可以是任何的人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物的例子包括灵长类、家畜动物(例如马、牛、羊、猪、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)、伴侣动物(例如犬、猫)和圈养野生动物(例如鹿、狐)。优选地，所述哺乳动物是人。根据本发明，所述生物样品选自血液、全血或血浆样品，所述生物样品优选是血浆样品。

本文中所指明的一系列DNA区域(标记)不仅相对于现有技术方法提供改进的诊断结果，另外还使开发筛查方法成为可能，所述筛查方法可以设计成专注于提供高水平的诊断特异性或高水平的诊断灵敏度。如本领域技术人员将理解的，在诊断学的语境下，“灵敏度”是指正确鉴定的阳性结果的比例，即，正确鉴定为具有所讨论疾病的个体的百分数；“特异性”是指正确鉴定的阴性结果的比例，即，正确鉴定为不具有所讨论疾病的个体的百分数。

本发明所述的“DNA区域”应当理解为指称基因组DNA的特定区段。这些DNA区域通过提到基因名称或一组染色体坐标来指定。这些基因名称和染色体坐标均将是本领域技术人员熟知并理解的。在本文中，染色体坐标对应于基因组的Hg19版。通常，一个基因可以通过参考其名称常规地确定，其中可以借助所述名称常规地获得其序列和染色体位置，或通过参考其染色体坐标常规地确定，其中也可以借助所述染色体坐标常规地获得基因名称及其序列。

DNA甲基化

DNA甲基化普遍存在于细菌、植物和动物中。DNA甲基化是一种DNA化学修饰，所述化学修饰经过多轮细胞分裂是稳定的，但是所述化学修饰不涉及生物的基础性DNA序列变化。染色质修饰和DNA修饰是表观遗传学的两个重要特征并且在细胞分化过程中发挥作用，允许细胞即便含有相同的基因组物质但确能够稳定维持不同的特征。在真核生物中，DNA甲基化仅在胞嘧啶的嘧啶环的编号5碳处发生。在哺乳动物中，DNA甲基化大多在CpG二核苷酸的编号5碳处发生。CpG二核苷酸占人类基因组的大约1％。

全部CpG中有70-80％的CpG是甲基化的。CpG可以成簇地群集，其被称为“CpG岛”，其存在于许多基因的5'调节区中并且经常是非甲基化的。在许多疾病过程如癌症中，基因启动子和/或CpG岛获得异常的过度甲基化，这与可遗传的转录性沉默相关。DNA甲基化可以按两种方式影响基因的转录。第一，DNA的甲基化本身可以物理阻碍转录蛋白与基因结合，从而阻断转录。第二，甲基化DNA可以被称为甲基-CpG-结合结构域蛋白(MBD)的蛋白结合。随后，MBD蛋白向基因座召集额外的蛋白，如组蛋白脱乙酰酶和可以修饰组蛋白的其他染色质重塑蛋白，从而形成紧凑无活性的染色质(其被称为沉默染色质)。DNA甲基化和染色质结构之间的这种联系非常重要。具体而言，甲基-CpG-结合蛋白2(MeCP2)的丢失已经在Rett综合征中显示意义并且甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)介导癌症中过度甲基化基因的转录性沉默。

“甲基化状态”应当理解为指甲基化在DNA区域内部一个特定核苷酸或多个核苷酸处的存在、不存在和/或其量。特定DNA序列(例如，如本文所述的DNA区域)的甲基化状态可以表示这个序列中每个碱基的甲基化状态，或可以表示这个序列中碱基对亚基的甲基化状态(例如，胞嘧啶的或一种或多种特定限制性酶识别序列的甲基化状态)，或可以表示这个序列内部关于区域甲基化密度的信息，而不提供该序列中何处发生甲基化的精确信息。甲基化状态可以任选地由“甲基化值”代表或表示。可以例如通过对采用甲基化依赖限制性酶进行限制酶切消化后存在的完整DNA的量定量，产生甲基化值。在这个例子中，如果DNA中的特定序列使用定量PCR定量，则与模拟处理的对照大致相等的模板DNA的量表示该序列未高度甲基化，而比模拟处理的样品中出现的模板量明显更少的模板量表示这个序列中存在甲基化DNA。因此，例如来自上述例子的值(即，甲基化值)代表甲基化状态并且因此可以用作甲基化状态的定量指示物。当需要将样品中序列的甲基化状态与阈值比较时，这特别有用。

本发明的方法基于生物样品的特定DNA区域的甲基化水平与这些DNA区域的对照甲基化水平比较。“对照水平”是“正常水平”，所述正常水平是正常对照细胞或细胞群体的DNA区域的甲基化水平或可以从中分离DNA用于分析的另一种生物样品中的甲基化水平。

DNA甲基化检测

可以在本发明方法中使用用于检测DNA甲基化的任何方法。许多方法可用于原代组织样品中或患者样品如血液、尿粪便或唾液中检测在特定基因座处差异性甲基化的DNA(综述参见Kristensen和Hansen，Clin Chem.55:1471-83，2009；Ammerpohl等人，BiochimBiophys Acta.1790:847-62，2009；Shames等人，Cancer Lett.251:187-98，2007；Clark等人，Nat Protoc.1:2353-64，2006)。基于亚硫酸氢钠处理的方法是分析靶基因中DNA甲基化的比例或程度的常用方法之一。DNA正常情况下用亚硫酸氢钠处理，并且使用将与甲基化状态无关地扩增DNA的引物和PCR条件扩增目的区域。随后可以通过测序(包括焦磷酸测序法)、限制性酶消化(COBRA)或通过解链曲线分析法评估整体扩增子或各个CpG位点的甲基化。可选地，可以使用基于连接的用于分析特定CpG位点处甲基化的方法。正在开发异常甲基化DNA的检测作为癌症诊断的手段，其中所述异常甲基化DNA从肿瘤中释放并进入体液。这里，在过度甲基化的序列情况下，需要使用允许从未甲基化的正常细胞DNA的背景中选择性扩增甲基化DNA序列的敏感方法。这类方法基于亚硫酸氢盐处理的DNA，例如；包括甲基化选择性PCR(MSP)、重度甲基(Heavy methyl)PCR、Head loop PCR和辅助物依赖性链反应(PCT/AU2008/001475)。

在一个优选实施方案中，本发明采用一种可用于研究ccf DNA甲基化模式的方法——甲基化CpG短串联扩增与测序技术(Methylated CpG Tandems AmplificationandSequencing,MCTA-Seq)(Wen L，Li J，Guo H，Liu X，Zheng S，Zhang D，et al.Genomescale detection of hypermethylated CpG islands in circulating cell-free DNAof hepatocellular carcinoma patients.Cell Res.2015；25:1250–64.)。该方法通过靶向捕获富含CGCGCGG的甲基化CGI区域(多位于基因表达调控区)，从而实现富集并构建文库，再基于Illumina二代测序平台，获得高通量测序数据，而后通过分析获得全基因组甲基化谱。

在一个具体实施方案中，首先亚硫酸氢盐将未甲基化的C转化成U，甲基化的C仍保留为C，区分不同甲基化状态的C。随后加入引物A，与转化后的序列进行互补配对，引物A由三部分组成：随机序列(random sequence，RS)、唯一分子标记(unique molecularidentifier，UMI)以及锚定序列。之后加入引物B，捕获含有甲基化CGCGCGG的序列，引物B由CpG短串联序列CGCGCGG和锚定序列构成。最后加入引物C和D通过锚定序列对与引物B配对的序列进行指数扩增，同时加上测序接头。

实施例

材料与方法

样品收集

AMI和对照样品收集自阜外医院。这些样品分别包括队列1和队列2的样品，其中队列1包括20例行PCI手术后的AMI患者，其3个左心房和心室组织的样品；队列2包括22对患者，其在PCI之前入院时(D0)、行PCI手术后1天(D1)和入院后2天(D2)的样品。对队列1和队列2的样品进行MCTA-Seq测定。还获得了116例行PCI手术前AMI患者以及25例健康对照个体的样品用于ddPCR测定。

白细胞和HCC患者样品获自北京世纪坛医院。190例正常对照受试者以及CRC患者样品获自北医三院。肺、胃、结肠、肾、胰腺、肌肉、皮肤、肝的样品购自BioChain。

本研究得到阜外医院伦理学委员会的批准。所有受试者均签署书面知情同意书，以收集样品并进行后续分析，然后再纳入研究。

血液样品处理

为了制备血浆，使用EDTA抗凝管收集4ml外周血，并在6小时内通过以下方法制备血浆样品：在室温下以1350g离心12min，然后将血浆转移到15ml管中，并再次在1350g下离心12分钟，然后转移到1.5或2ml试管中，再在13500g下离心5分钟，然后转移到新的试管中。制备的血浆样品(约2ml)立即在-80℃下保存。

DNA提取与文库构建

使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen)试剂盒根据厂商提供的说明书从WBC和组织提取基因组DNA。从AMI患者和对照受试者抽取2-4mL外周血并在6小时内进行处理。使用QIAamp Circulting Nucleic Acid Kit(Qiagen)试剂盒提取cfDNA并使用Qubit HsDNAKit试剂盒进行定量。如先前所述构建MCTA-Seq文库。简言之，通过EZ-96 DNAMethylation-Direct^TMMagPrep(Zymo research)对来自2mL血浆的cfDNA进行亚硫酸氢盐处理。将所有经亚硫酸氢盐转换的cfDNA进行MCTA-Seq文库制备。首先，在15μL反应体系中线性扩增所有经亚硫酸氢盐转换的DNA以获得半扩增子，所述15μL反应体系中含有1×NEBbuffer 2、250μM每种dNTP、0.33μM MCTA-Seq引物A和2.5单位的无3’至5’核酸外切酶活性的Klenow片段。在未加入Klenow片段的情况下组装反应体系并在95℃温育2分钟，然后保持在4℃。然后加入Klenow片段。然后，反应体系的反应条件如下：4℃15秒，10℃1分钟，20℃4分钟，30℃4分钟，37℃4分钟和75℃20分钟(以灭活Klenow片段)。在第二步中，向15μL反应体系中加入5μL含有1×E*Taq Buffer、1.5单位Hot Start E*Taq和1μM MCTA-Seq引物B的混合物从而在20μL反应体系中选择性扩增富集的CpG区。反应条件如下：95℃3分钟(以激活热启动聚合酶)，然后是50℃2分钟和72℃1分钟。然后，通过加入30μL溶液使用索引引物C和D在总50μL反应体系中扩增完全扩增子，其中30μL溶液含有1×E*Taq Buffer、250μM每种dNTP、2μM索引引物C(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3')和2μM索引引物D(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCT-3',索引引物D中加下划线的序列对应于Illumina索引引物)，反应条件为14个循环的95℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟以及最后一个循环的72℃5分钟。第三步扩增后，将六个样品与不同的Illumina索引序列混合以针对每个样品取30μL反应，然后使用DNA Clean&Concentrator^TM-5Kit(Zymo research)试剂盒纯化至浓缩体积。将所得产物在3％琼脂糖凝胶(Takara,Agarose LM SIEVE,D614)上进行电泳并将180-250bp的条带切下，然后纯化。对于血浆样品，通常需要另外进行两轮扩增(使用引物QP1(5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3')和QP2(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'))和凝胶纯化，以清除引物二聚体并获得足够多的材料以进行测序。在Illumina HiSeq2000平台上对最终文库进行测序以产生150bp的双端测序的测序片段。

心脏特异性甲基化标志物的鉴定

通过比较健康受试者的心脏、肝脏组织、白细胞和血浆的所有CGI位点的MCTA-Seq甲基化测序数据来选择潜在的心脏特异性标志物。

选择标准如下：

1)为排除肝源性DNA的影响，肝脏的MePM值应低于5(肝脏<5)；其被证实是血浆cfDNA的主要非造血来源；

2)心脏组织的MePM平均值为白细胞的100倍，以排除来自白细胞的释放(心脏/白细胞>100)；

3)心脏组织的甲基化水平应为正常人血浆的100倍(心脏/Pn>100)。

使用上述标准，鉴定了5个心脏特异性高甲基化基因组位点(表1)。这些不同的CGI区域位于CORO6基因的基因内区、CRIP1基因的启动子区、OBSCN基因的3’端、CACNA1C基因的启动子区、ZNF503-AS2基因的启动子区。在心脏组织中，这些位点的甲基化程度高于其他组织和白细胞。

表1相关CGI区域信息(染色体坐标对应于基因组的Hg19版)

染色体	起始位置	终止位置	基因名称	CGI分类
					17	27942532	27945388	CORO6	基因内
12	2800139	2801062	CACNA1C	启动子
					14	105952603	105954296	CRIP1	启动子
1	228565949	228567121	OBSCN	3’端
					10	77155128	77169600	ZNF503-AS2	启动子

为了进一步证实这些标志物在心脏中的特异性，分析了肺、胃、结肠、肾脏、胰腺、肌肉、皮肤、肝脏、心脏和白细胞等各种组织中这些位点的数据。分析结果证实了这些生物标志物在上述条件下在心脏中的特异性。

探针设计和微滴式数字PCR

选择这些位点中能够最佳地区分AMI和对照受试者表型的位于17号染色体上的CORO6基因片段进行进一步的研究，以开发微滴式数字PCR。由于探针长度有限(最长30bp)，它们只能包括CORO6基因座中两个或三个有价值的CpG位点。在此，选择能够包括3个位点的区域作为设计探针的区域。为了在相同样品中同时定量甲基化和非甲基化CORO6的拷贝数，设计了分别靶向模板的两种甲基化状态的两组引物和探针。对于甲基化状态，设计了标记有荧光FAM的探针。对于非甲基化状态，设计了标记有荧光VIC的探针。

两组引物和探针的序列如下：

甲基化状态：

5’-GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG-3’(正向引物)，

5’-CGAAACTCGCAATCCAACCTC-3’(反向引物)，

5’-FAM-AGATTTACGTCGTTTTAGCG-MGB-3’(探针)。

扩增序列信息(chr17:27942544-27942613)：

GGGAGACCAGAACTCTTGGAGCTTAGGGGAGACCCACGTCGCTCCAGCGGAGGCTGGACTGCGAGCCTCG

亚硫酸氢盐转化后序列信息：

GGGAGAttAGAAtTtTTGGAGtTTAGGGGAGAtttACGTCGtTttAGCGGAGGtTGGAtTGCGAGttTCG

非甲基化状态：

5’-GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG-3’(正向引物)，

5’-CAAATCCCAAACAAAACTCACAATCCA-3’(反向引物)，

5’-VIC-AGATTTATGTTGTTTTAGTGGAGGT-MGB-3’(探针)。

扩增序列信息(chr17:27942533-27942613)：

GGGAGACCAGAACTCTTGGAGCTTAGGGGAGACCCACGTCGCTCCAGCGGAGGCTGGACTGCGAGCCTCGTCTGGGACTCG

亚硫酸氢盐转化后序列信息：

GGGAGAttAGAAtTtTTGGAGtTTAGGGGAGAtttAtGTtGtTttAGtGGAGGtTGGAtTGtGAGttTtGTtTGGGAtTtG

开发了两种微滴式数字PCR探针，以定量心脏特异性标志物CORO6的甲基化和非甲基化DNA分子。该测定能够使用分别标记有不同荧光FAM和VIC的两种探针在相同的测定中定量CORO6的甲基化和非甲基化DNA分子。

对于每种样品，将经过经亚硫酸氢盐转换的来自1-2mL血浆的cfDNA用作微滴式数字PCR的模板，然后，每种样品的单链DNA分成一式两份以用于两个相同的测定。

首先，准备20μL的每种反应混合物，其由以下组成：10μL ddPCR Supermix forProbes(无dUTP)(Bio-Rad)、9.6μL经亚硫酸氢盐转换的DNA、终浓度为450nM的每种正向引物和反向引物、250nM的非甲基化特异性/甲基化特异性探针。然后，将20μL反应混合物和70μL微滴发生油(Bio-Rad)加载到QX200 ddPCR微滴发生器(Bio-Rad)中。之后，将各自含有一种模板或不含模板的微滴小心转移到96孔PCR板并立刻将板密封。对于每次运行，将完全甲基化的人基因组DNA(FMG,EMD Millipore)用作阳性对照，而无模板作为阴性对照。

在热循环仪中进行PCR，PCR条件：95℃10分钟，40个循环的94℃15秒和60℃1分钟，以及最后在98℃灭活孵育10分钟。PCR后，将板转移至QX200微滴检测仪(Bio-Rad)，使用QuantaSoft(1.7版)软件(Bio-Rad)分析每个样品的微滴。根据阳性对照和白细胞对照确定FAM和VIC通道的阳性荧光信号的截断值。分析后，得到每个样品中CGI_7630的甲基化和非甲基化分子的拷贝数。

数据处理

测序数据处理

先前描述了FASTQ格式的R2测序片段的处理和完全甲基化分子(FMM)的MePM的计算。

心脏来源的cfDNA分数的反卷积分析

使用以下方程对cfDNA的组织定位进行反卷积：

反卷积MCTA-Seq数据分析方法与本发明人之前报道的论文(Liu et al.,Clinical Epigenetics,Comprehensive DNA methylation analysis of tissue oforigin of plasma cell-free DNA by methylated CpG tandem amplification andsequencing(MCTA-Seq)，PMID:31234922)类似，但在该研究的8个方程组中加入心脏特异性甲基化标志物数据，总共生成待求解的代表9种非造血组织的9个方程组。

具体而言，PMID:31234922论文中采用了8组非造血组织特异性甲基化标志物，包括肝脏、肺、胃、结肠、肾脏、胰腺、肌肉和皮肤，对于某组组织特异性标记物i，表示其在血浆中的甲基化值，/>表示i在特定组织k中的甲基化值，P_k表示组织k在血浆中的比例，采用粒子群优化(particle swarm optimization)方法解出方程，根据/>和/>解出P_k值。

在本发明中，本发明人加入了由5个CGI组成的心脏特异性甲基化标记物组，计算每种组织中这5个CGI(共6个CGCGCGG-CpG)的甲基化值的总和，在心脏、肝脏、肺、胃、结肠、肾脏、胰腺、肌肉、皮肤和白细胞中分别为：243.3、55.9、61.4、71.8、34.5、17.1、61.0、22.1、8.8、0.1(见图1A、1B)，与原来8种非造血组织特异性甲基化标志物一起，总共生成待求解的代表9个方程组，最终解出心脏DNA在总体cfDNA中所占比例。

为了进一步消除来自白细胞的非特异性甲基化的影响，从所测量的组织分数中减去14个配对白细胞样品的平均组织分数值(对于肝脏、肺、胃、结肠、肾脏、胰腺、肌肉、皮肤和心脏分别为0.022％、0、0.28％、0.002％、0.019％、0.003％、0.2％、0.014％、0.016％)。此外，将其值小于白细胞样品的平均值+三个标准差(对于肝脏、肺、胃、结肠、肾脏、胰腺、肌肉、皮肤和心脏分别为0.11％、0、1.62％、0.023％、0.0209％、0.035％、1.2％、0.17％、0.2％)的测量的组织分数设为0。

生物信息学和统计学分析

自定义R脚本和R软件包用于构建热图并进行统计学分析。GraphPad Prism(PRISM版本5)软件用于绘制箱形图、柱状图、AUC曲线以及非多重检验的统计学分析，其中p＝0.01被设为统计学显著性的截断值。

实施例1-心脏组织特异性高CGI区域的鉴定

根据九种正常组织(包括肝脏(n＝3)、肌肉(n＝2)、肺(n＝2)、胃(n＝2)、肠(n＝2)、肾脏(n＝2)、胰腺(n＝2)、皮肤(n＝2)和白细胞(n＝81))和AMI患者血浆(n＝20)及正常对照个体(n＝202)的MCTA-Seq数据，鉴定出了5个心脏组织特异性高CGI区域(共6个心脏组织特异性高CGCGCGG-CpG区域，表1)，包括CORO6、CACNA1C(两个位点)、OBSCN、CRIP1和ZNF503-AS2，这些位点在正常对照个体、白细胞和肝脏中的背景都较低，结果见图1A、1B。

观察这些位点在AMI患者血浆中的甲基化情况，结果显示，相对于正常对照个体，AMI患者血浆中这些心脏特异性高CGCGCGG-CpG区域的甲基化水平显著增高(双尾MWW检验，P<0.01，图1B)。综合比较这6个位点，CORO6(该位点上检测到的甲基化CpG岛为CGI_7630)表现出最强的心脏特异性，其在肌肉等其他组织中的甲基化水平较低，在正常对照个体中的甲基化水平也极低，而其余位点在肝脏、肌肉等其他组织中有微弱的信号(图1C)。

实施例2-心机梗死过程中cfDNA的动态变化

为了探究心机梗死过程中cfDNA的动态变化，分别收集了PCI术前入院时(D0)、PCI术后第一天(D1)、PCI术后第二天(D2)的AMI患者血浆样本(n＝60，每个时间点收集20例样本)。首先观察cfDNA的浓度变化，发现刚入院时跟正常对照之间相似。接着，PCI术后第一天、第二天cfDNA浓度显著升高(图2A)。接着，为了探究PCI术后升高的cfDNA的组织来源，采用了之前研究血浆cfDNA组织来源的反卷积算法，推测出AMI中升高的cfDNA来自心脏和其他八种非造血组织的比例。结果显示，相对于正常对照个体，PCI术后第一天AMI血浆中来源于心脏的DNA比例显著升高，接着到PCI术后第二天显著下降(图2B)。虽然术后第二天，cfDNA总体浓度增加，但是来自于心脏的cfDNA却下降，反卷积分析显示，升高的cfDNA主要来自于血细胞(图2C)。当通过AMI与正常对照血浆来自心脏的cfDNA比例(％)来诊断AMI时，受试者特征(ROC)曲线显示，D0、D1、D2对应曲线下面积(AUC)值分别为0.8224(95％置信区间(CI):0.69–0.95，P<0.001)、0.9239(95％置信区间(CI):0.83–1.0，P<0.001)、0.7970(95％置信区间(CI):0.66–0.93，P<0.001)。

实施例3-心脏特异性甲基化/非甲基化cfDNA的绝对拷贝数和比例的定量

考虑到心肌梗死的检测需要一定的时效性，本发明考虑了较为快速的ddPCR实验，以对心脏特异性甲基化/非甲基化cfDNA的绝对拷贝数和比例进行定量。针对CORO6心脏特异性高甲基化区域(71bp)设计针对该区域甲基化状态和非甲基化状态的探针，分别用FAM和VIC标记(图4A)，使得在单管中能够区分甲基化和非甲基化的信号。首先在多种组织中，包括心脏、肌肉、肾脏、肝脏、皮肤、白细胞，以及相对富集的心肌细胞中检验了来自甲基化CORO6扩增子信号的比例。结果显示，相对富集的心肌细胞和心脏组织的甲基化CORO6扩增子的比例明显高于别的组织，验证了CORO6来自于心脏的真实信号(图4B)。接着用ddPCR的方法，结合两种标记的探针，对116例PCI术前(胸疼后24小时内)的AMI病例和25例对照个体进行检测。统计结果显示，AMI中CORO6信号显著高于对照组(图4C)。对CORO6的绝对拷贝数进行统计，曲线下面积(AUC)达到0.685(95％置信区间(CI):0.59–0.78，P＝0.0037)(图4D)。当以每毫升血浆中有至少1个拷贝CORO6信号作为阳性判断值，该方法诊断AMI的灵敏度为46％，特异性为80％。

因此，本发明利用MCTA-Seq技术，鉴定出了心脏特异性甲基化标志物，CORO6；探索了AMI患者中增加的cfDNA的组织来源，发现PCI术后升高的总cfDNA水平来自心脏和白细胞(WBC)；并开发了用于无创检测心脏损伤的ddPCR检测方法，能够通过血浆cfDNA有效地检测出AMI。

尽管已示出和描述了说明性实施方案，但本领域技术人员将理解，上述实施方案不应当被理解为对本发明内容进行限制，并且可在不背离本发明内容的精神、原则和范围的情况下进行变化、替换和修改。

Claims

1.用于在个体中评估患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病的DNA甲基化标志物片段的组合，所述组合包括说明书表1所记载的CORO6的CGI区域，其中相对于对照而言，所述个体中CGI区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病。

2.根据权利要求1所述的DNA甲基化标志物片段的组合，其中所述心血管疾病是心肌梗死。

3.根据权利要求2所述的DNA甲基化标志物片段的组合，其中所述心肌梗死是急性心肌梗死。

4.检测生物样品中DNA区域的甲基化水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于评估个体患有心血管疾病的风险或检测心血管疾病，其中所述评估包括在来自所述个体的生物样品中检测所述DNA区域的甲基化水平并将所述DNA区域的甲基化水平与对照进行比较，其中所述DNA区域包括说明书表1中所记载的CGI区域：

chr17:27942532-27945388，

其中相对于对照而言，所述DNA区域的较高的甲基化水平指示所述个体具有患有心血管疾病的风险或患有心血管疾病。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述心血管疾病是心肌梗死。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述心肌梗死是急性心肌梗死。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒包含引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物用于检测所述CGI区域的甲基化状态。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述正向引物为5’-GGGAGATTAGAATTTTTGGAGTTTAGG-3’，所述反向引物为5’-CGAAACTCGCAATCCAACCTC-3’。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述试剂盒还包含探针。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述探针的引物为5’-AGATTTACGTCGTTTTAGCG-3’。

11.根据权利要求8所述的用途，其中所述试剂盒还包含探针。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述探针的序列为5’-AGATTTACGTCGTTTTAGCG-3’。

13.根据权利要求9所述的用途，其中所述探针是经标记的。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述探针是经荧光标记的。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述探针是由选自FAM、VIC和MGB的荧光团标记。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述探针为5’-FAM-AGATTTACGTCGTTTTAGCG-MGB-3’。

17.根据权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒包含扩增DNA所需的一种或多种试剂，所述试剂选自扩增缓冲液、dNTP和扩增DNA所需的酶。

18.根据权利要求8-16中任一项所述的用途，其中所述试剂盒包含扩增DNA所需的一种或多种试剂，所述试剂选自扩增缓冲液、dNTP和扩增DNA所需的酶。

19.根据权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述生物样品选自血液、全血或血浆。

22.根据权利要求8-16中任一项所述的用途，其中所述试剂盒是微滴式数字PCR试剂盒。

23.根据权利要求22所述的用途，其中所述试剂盒用于检测生物样品中的cfDNA。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述生物样品选自血液、全血或血浆。