CN110938680A - Dna及rna同时检测的基因变异位点检测方法 - Google Patents
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Abstract
提供基于PCR扩增的高灵敏度的基因变异位点检测方法，通过对样品中包含目标变异位点的DNA和RNA的共扩增实现，通过引物设计方法实现对样品中DNA和RNA的同时扩增，能够更充分的利用样品中基因的变异信息，提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域的基因变异检测领域，具体涉及在一个体系中同时扩增DNA和RNA从而实现变异位点检测的方法，涉及利用该技术制备的DNA及RNA同时检测的试剂盒及其应用。
背景技术
随着技术水平的不断推进，医学的发展也趋于循证与严谨。治疗方法的确定常面临着个体差异的问题，即药物和相应的治疗方法难以在所有病人身上具有相同效用，同一药物在不同个体内间的效果差异可达数百倍。医疗机构或医务人员因主观或客观原因，可能难于排除这种差异带来的影响，而造成耗费医疗资源却未提高患者诊治价值的过度治疗。而造成个体差异的主要原因，则是基因及其表达的多样性。因此针对不同个体进行基因检测，尤其是疾病及用药相关的位点的检测，已收到广泛认可或写入治疗指南，同时基因突变的检测也越来越多的被用于疾病的早期筛查。
目前用于基因检测的样本，往往只选取DNA或RNA中的一种进行检测，因为二者在结构及性质上存在着较大的差异，导致从提取到检测的流程上都会有所区别。对于检测需要的信息，尤其是突变的信息，一般DNA和RNA都会含有，所以只检测其中的一种，就会造成另一种中有价值信息的遗漏，但从技术手段上来讲，检测单一的核酸类型确实更容易实现和优化。
在实际的检测中，分别检测DNA及RNA意味着更大的样本需求。同时，疾病早期筛查中涉及一些含量较低的突变或融合检测，可能意味着检测难度的提升或是检出的不稳定。而DNA及RNA在同一体系中的同时检测为上述的问题提供了可行的解决之道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种可以同时扩增DNA及RNA的引物设计方法；本发明的目的之二在于提供一种适用上述引物的扩增体系；本发明的目的之三在于提供一种基于上述引物设计原则及扩增体系研发的产品及其应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于PCR扩增的高灵敏基因变异位点检测方法，其特征在于：通过对样品中包含目标变异位点的DNA和RNA的共扩增实现。
所述检测方法的检测体系含有的共扩增引物的设计方法为以下a或b或c：
a：变异位点附近无内含子或距内含子较远，能在同一外显子上完成引物设计时，在同一外显子上完成引物设计；
b：变异位点附近存在内含子，不能在同一外显子上完成引物设计，且相邻的内含子长度较短，内含子长度小于约120bp时，在相邻外显子上完成引物对的设计，结果是DNA扩增子中包含一段长度较短的内含子，RNA扩增子中不含内含子；
c：变异位点附近存在内含子，不能在同一外显子上完成引物设计，且相邻的内含子长度较长，内含子长度大于约120bp时，在变异位点所在外显子上完成通用上游或通用下游引物的设计，在相邻内含子上完成DNA扩增所需下游或上游引物的设计，在相邻外显子上完成RNA扩增所需下游及上游引物的设计，结果是DNA扩增子包含部分相邻内含子，RNA扩增子包含部分相邻外显子。
本发明的检测方法的检测的样本来源选自动物、植物、细菌、病毒等包含DNA和/或RNA的物质。
优选地，检测的样本类型为体液。
更优选地，体液选自：血浆、血清、尿液等。
检测样本为体液时，本发明检测方法的扩增子长度小于约150bp或约140bp或约130bp或约120bp或约90bp。
另一方面，本发明还提供同时扩增DNA及RNA的体系，包括了上述方法设计的同时扩增DNA及RNA的引物对。
所述体系中还包括PCR缓冲液、dNTPs、二氯化镁、DNA聚合酶、逆转录酶。
优选地，所述体系中还包括相应的阻滞探针，以封闭背景干扰，提高检测准确度。
优选地，所述体系中还包括UDG酶、dUTP。
优选地，所述体系中还包括PCR增强剂，选自甲酰胺、甘油、DMSO、甜菜碱等。
优选地，所述体系中还包括相应扩增子的通用探针和/或染料。
优选地，所述体系在实施时，包括UDG酶与逆转录酶在合适温度下同时反应的步骤。
更优选地，所述UDG酶与逆转录酶在合适温度下同时反应的步骤为：50-55℃5-15min。
另一方面，本发明还提供高灵敏度的用于基因变异位点检测的试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTPs、二氯化镁、DNA聚合酶、其特征在于还包括根据上述共扩增引物设计方法设计的同时扩增DNA及RNA的引物对，以及逆转录酶。
优选地，所述试剂盒中还包括相应的阻滞探针。
优选地，所述试剂盒中还包括UDG酶、dUTP。
优选地，所述试剂盒中包括PCR增强剂，选自甲酰胺、甘油、DMSO、甜菜碱等。
优选地，所述试剂盒中包括相应扩增子的通用探针或染料。
从另一层面讲，为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
（1）同时扩增DNA及RNA的引物设计方法
对于能在同一外显子上完成引物设计的，则在同一外显子上完成设计。
对于不能在同一外显子上完成设计，且相邻的内含子长度较短的,一般内含子长度小于约120bp,即扩增子长度可控制在约150bp以下的序列，可在相邻外显子上完成引物对的设计，结果DNA扩增子中包含一段长度较短的内含子，RNA扩增子中不含内含子。
对于不能在同一外显子上完成设计，且相邻的内含子长度较长的，一般内含子长度大于约120bp，即扩增子长度大于150bp的，可在外显子上完成通用上游或通用下游引物的设计，在相邻内含子上完成DNA扩增所需下游或上游引物的设计，在相邻外显子上完成RNA扩增所需下游及上游引物的设计。即DNA扩增子包含部分相邻内含子，RNA扩增子包含部分相邻外显子。
（2）经优化的同时扩增DNA及RNA的体系。
所述体系中包括了上述方法设计的同时扩增DNA及RNA的引物对。
所述体系中还包括PCR缓冲液、dNTPs、和二氯化镁、DNA聚合酶、逆转录酶，UDG酶。
所述体系中可能还包括相应扩增子的通用探针。
优选的，所述扩增体系中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、MgCl22.5mM、dNTP250μM、引物250nM、blocker 500nM、探针500nM、DNA 聚合酶1U、反转录酶1U和模板0.05-20ng。
（3）实现DNA及RNA含有的特定信息的反应程序及检测方法。
反应程序包括：50℃ 5min UDG酶防污染，50℃ 15min 逆转录酶进行逆转录。95℃变性，50-60℃退火延伸。
或者优选地，反应程序包括：50℃ 15min UDG酶与逆转录酶同一反应程序进行反应。
反应程序还应包括正常的PCR程序即①90-95℃预变性；②90-95 ℃变性10s，55-65℃退火及延伸30s，进行50个循环且收集荧光信号③最后-40℃保存
（4）基于上述引物设计原则及扩增体系研发的EGFR基因基因突检测试剂盒。
所述EGFR基因突变检测试剂盒能够从DNA和RNA水平同时检测EGFR的基因突变状态。
本发明的有益效果在于：（1）实现了单体系对DNA及RNA的同时扩增，减少了样本量的需求。（2）提出了DNA和RNA同时检测的引物设计方法：减少了涉及DNA及RNA联合检测的设计复杂性（3）通过DNA及RNA的同时扩增实现了样本的充分利用，提高了含有突变/融合信息的核酸总量，从而提高了痕量突变/融合的检出率。（4）研发了EGFR基因DNA及RNA基因突变共检测试剂盒。
附图说明
图1：同时扩增DNA及RNA的引物设计方法，注释：跨外显子的引物依据实际情况设计。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J. 萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中所使用的仪器如下：Lightcycler 480、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。
本发明中所使用的试剂：UDG酶（NEB公司）DNA聚合酶（罗氏公司）、逆转录酶（thermo公司）、10×PCR Buffer（罗氏公司）、MgCl2（罗氏公司）、dNTP（TaKaRa）、dUTP（TakaRa）纯化水。
本发明中所使用探针：所有探针纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10nmol备用。
实施例1
本实施例以EGFR-T790M、EGFR-L858R、TP53-T329I为例来举例说明如何对目标基因进行引物设计及检测。
（1）反应质控品获得：
1)阴性质控品为经sanger测序EGFR及TP53基因未突变的人组织DNA及RNA，分别经稀释至2ng/ul使用；
2）阳性质控品：
①T790M及L858R阳性质控品为H1975细胞DNA及RNA。其中DNA提取试剂盒为为真公司石蜡包埋组织DNA提取试剂盒；RNA提取试剂盒为为真公司组织RNA提取试剂盒；DNA&RNA共提取试剂盒为QIAGEEN 核酸提取试剂盒；
提取完成后的DNA和RNA分别采用qubit进行定量，再稀释至指定浓度进行试验。对于共提取后的DNA&RNA采用qubit进行DNA浓度定量，在稀释至指定浓度进行试验。
其中含EGFR基因T790M，L858R突变位点的具体序列如下：
T790M C>T（如SEQ ID NO.1所示）
gaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccaccgtgcagctcatcaTgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaacacaaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaaggtaatcagggaagggagatacggggaggggagataag...ggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaa
注：T为突变位点，“…”为省略的内含子序列；
L858R T>G（如SEQ ID NO.2所示）
ggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcGggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagcattttcctgacaccagggacca...gtgcctatcaagtggatggcattggaatcaattttacacagaatctatacccaccagagtgatgtctggagctacg
注： G为突变位点，“…”为省略的内含子序列。
②P53基因T329I突变位点的DNA阳性质控品：T329I突变的DNA序列连接到pUC57-Amp载体，然后转化大肠杆菌后，经提取纯化，然后稀释成浓度为100拷贝数（浓度约为10- 6ng/ul）。
③T329I突变位点的阳性质控品RNA质控品：DNA阳性质控品经体外转录为RNA再用qubit定量，稀释浓度至10-6ng/ul，其中含TP53基因T329I变位点的具体序列如下：
DNA序列（如SEQ ID NO.3所示）:
ccattggaagggcaggcccaccacccccaccccaaccccagccccctagcagagacctgtgggaagcgaaaattccatgggactgactttctgctcttgtctttcagacttcctgaaaacaacAttctggtaaggacaagggttgggctggggacctggagggctggggacctggagggctggggggctggggggctgaggacctggtcctctgactgctcttttcacccatctacagtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccccgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccct
注： A为突变位点；
RNA序列（如SEQ ID NO.4所示）:
ccauuggaagggcaggcccaccacccccaccccaaccccagcccccuagcagagaccugugggaagcgaaaauuccaugggacugacuuucugcucuugucuuucagacuuccugaaaacaacAuucugucccccuugccgucccaagcaauggaugauuugaugcuguccccggacgauauugaacaaugguucacugaagacccagguccagaugaagcucccagaaugccagaggcugcuccccccguggccccugcaccagcagcuccuacaccggcggccccugcaccagcccccuccuggccccu
注：A为突变位点。
（2）引物探针序列获得：根据含突变/融合位点的序列按照本专利所述设计原则进行设计。
T790M:设计序列如下：
引物-1:T790M-F:CACCGTGCAGCTCATCAT（如SEQ ID NO.5所示）
引物-2:T790M-R1:GCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTC(同一外显子) （如SEQ ID NO.6所示）
引物-3:T790M-R2:CCCTTCCCTGATTACCTTT(内含子) （如SEQ ID NO.7所示）
引物-4:T790M-R3:CCAAGTAGTTCATGCCCTTT（RNA跨外显子）（如SEQ ID NO.8所示）
T790M-Blocker:CAGCTCATCACGCAGCTC-PO4（如SEQ ID NO.9所示）
L858R:设计序列如下：
引物-5:L858R-F:GATCACAGATTTTGGGCG（如SEQ ID NO.10所示）
引物-6:L858R-R1:TGCCTCCTTCTGCATGGTAT(同一外显子) （如SEQ ID NO.11所示）
引物-7:L858R-R2:ACCTCCTTACTTTGC(内含子) （如SEQ ID NO.12所示）
引物-8:L858R-R3:TCCACTTGATAGGCACTTTGCC（RNA跨外显子）（如SEQ ID NO.13所示）
L858R-Blocker:TTTGGGCTGGCCAAAC-PO4（如SEQ ID NO.14所示）
T329I:设计序列如下：
引物-9:TP53-F: GACTTCCTGAAAACAACA（如SEQ ID NO.15所示）
引物-10:TP53-R1:TGTAGATGGGTGAAAAGAG（内含子）（如SEQ ID NO.16所示）
引物-11:TP53-R2:ACAGCATCAAATCATCCATTG（下一外显子）（如SEQ ID NO.17所示）
T329I-Blocker:CTGAAAACAACGTTCTG-PO4（如SEQ ID NO.18所示）。
（3）根据设计的引物和Blocker，对各组分在如下条件下进行优化：1~10×PCR缓冲液、100μM ~250μMdNTPs、1X Evagreen或0.1~mM的探针、0.1~2μM blocker、0.05~2ng/μl模版DNA、1~5mM二氯化镁，0.1%-10%海藻糖。反应程序①为50-65℃逆转录15-30分钟；②92~97℃预变性同时灭活逆转录酶30~300s；③92~97 ℃变性10~20s，50~65℃退火及延伸10~30s，进行35~55个循环且收集荧光信号；④最后40℃保存。
（4）实验结果
对反应体系的优化结果显示，如表1所示的反应体系效果最佳。
表1、最优反应体系
| 原材料 | 体系（反应最终体系浓度） |
| 10×PCR buffer | 1× |
| MgCl<sub>2</sub> | 2.5mM |
| dNTP | 250μM |
| 引物（上下游） | 250nM |
| Blocker | 500nM |
| 探针/Evagreen | 500nM、1X |
| 海藻糖 | 1% |
| DNA 聚合酶 | 1U |
| 反转录酶 | 1U |
| DNA模板 | 0.05-20ng |
| 总体系 | 20μL |
最佳反应条件为：①为50-65℃逆转录15分钟；②95℃预变性同时灭活逆转录酶150s；③95 ℃变性10s，60℃退火及延伸30s，进行35~55个循环且收集荧光信号；④最后40℃保存。
依据最佳的反应体系T790M和L858和T329I不同引物组合方式检测效果如下表：
表2、T790M不同引物设计方法检测结果（探针法检测）
表3、L858R不同引物设计方法检测结果（探针法检测）
表4、T329I不同引物设计方法检测结果（染料法检测）
由上表分析可知：对于T790M ，直接在同一外显子上设计引物检测DNA和RNA的效果与跨外显子的引物设计相比，效果更优。对于L858R，跨外显子的引物同时检测DNA和RNA的效果比在同一外显子的引物效果更优。对于T329I 内含子较短的引物可直接设计在下一外显子。
实施例2
本实施例以采用了上述较优的T790M（引物-1，引物-2）和L858R（引物-5，引物-7，引物-8）的引物为例来阐述本发明相关优化结果。
反应用样品的获得：
使用T790M阳性细胞 NCI-H1975作为阳性核酸来源。使用Sanger测序为T790阴性的DNA组织样本作为阴性核酸来源。使用QIAGEEN核酸提取试剂盒提取H1975的细胞DNA及RNA。使用为真组织DNA提取试剂盒提取组织样本DNA。使用为真组织RNA提取试剂盒提取组织样本RNA。
（1）采用qubit定量阴性组织样本和H1975的核酸，并稀释至2ng/ul。使用组织DNA梯度稀释CDER提取的H1975细胞核酸，获得浓度为2ng/ul T790M突变比例为1%，0.5%，0.1%，0.05%的参考品。
使用EGFR一步法检测试剂盒检测四个样品，使用两种不同的扩增程序：一种为试剂盒标的标准扩增程序，用于同时扩增DNA及RNA;另一种为标称程序中删除50℃ 15min逆转录步骤后所得程序，用于扩增DNA而不扩增RNA，所得实验结果如表5所示：
表5、不同突变比例样品检测结果
| 程序 | 1% | 0.5% | 0.1% | 0.05% |
| 正常程序 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
| 无逆转录程序 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 |
可见对于浓度较高的标准品：如1%-0.1%的标准品其无论采用正常程序还是无逆转录程序均可准确检出参考品。当参考品浓度为0.05%时在仅扩增DNA的条件下无法正常检出，但因样本中含有成比例被稀释的阳性RNA，在经逆转录的一步法检测体系中即可被正常检出，可见同时检测多种核酸有助于提升试剂盒检测性能，提高样本的检出率。
（2）使用组织DNA梯度稀释H1975细胞DNA，获得浓度为2ng/ul T790M突变比例为1%，0.5%，0.1%，0.05%的参考品。将参考品一分为二，像其中投入浓度为0.01ng的H1975细胞RNA并采用含逆转录的PCR反应程序进行实验。所得实验结果表6所示：
表6、不同突变比例样品检测结果
| 标准品 | 1% | 0.5% | 0.1% | 0.05% |
| DNA | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 |
| DNA+0.01ngRNA | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 |
可见对于浓度较高的标准品：如1%-0.1%的标准品其无论采用正常程序还是无逆转录程序均可准确检出参考品。当参考品浓度为0.05%时在仅含DNA的参考品中无法正常检出，加入微量RNA后可检出。可见同时检测多种核酸有助于提升试剂盒检测性能，提高样本的检出率。
实施例3
选取10例组织样本检测为T790M突变或L858R突变的阳性血浆样本及阴性血浆样本进行验证。QIAGEEN 核酸提取试剂盒提取DNA及RNA，样本用量4ml。然后使用实施例2中含有逆转录程序与不含逆转录程序的两种PCR反应程序检测样本。检测结果表7所示。
表7、大体积样本DNA检测与共检测结果对比
| 检测重复组 | DNA检测结果 | 检测△cp值 | DNA+RNA检测结果 | 检测△cp值 | 组织样本检测结果 |
| 1 | L858R | 10.75 | L858R | 9.65 | L858R |
| 2 | L858R | 11.36 | L858R | 9.91 | L858R |
| 3 | L858R | 9.58 | L858R | 8.87 | L858R |
| 4 | L858R+T790M | 10.76/9.97 | L858R+T790M | 9.21/8.14 | L858R+T790M |
| 5 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 6 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 7 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 8 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 9 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 10 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
结果显示，使用本发明的方法可更大程度的使用检测模板量，即DNA和RNA共检测降低检测的cp值。
实施例4
对上述样本进行小体积血浆的提取及验证。用QIAGEEN 核酸提取试剂盒进行提取，样本用量500ul。
然后使用实施例2中含有逆转录程序与不含逆转录程序的两种PCR反应程序检测样本。检测结果表8所示。
表8、小体积样本DNA检测与共检测结果对比
| 样本编号 | DNA检测结果 | 检测△cp值 | DNA+RNA检测结果 | 检测△cp值 | 组织样本检测结果 |
| 1 | L858R | 10.49 | L858R | 9.26 | L858R |
| 2 | L858R | 9.52 | L858R | 8.44 | L858R |
| 3 | 阴性 | - | L858R | 10.78 | L858R |
| 4 | L858R | 9.64 | L858R+T790M | 8.97/10.21 | L858R+T790M |
| 5 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 6 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 7 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 8 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 9 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
| 10 | 阴性 | - | 阴性 | - | 阴性 |
结果显示，本发明同时检测多种核酸的方法有助于提升试剂盒检测性能，提高样本的检出率。
实施例5
采集非小细胞肺癌患者术前血血浆及配对组织样本30例。组织样本采用江苏为真以金标准sanger测序法进行检测。血浆样本分别采用江苏为真EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）及本方法设计的EGFR一步法检测试剂盒进行检测，分析两种方法与组织检出的一致性。
表9、本发明检测结果与已上市产品检测结果对比
表10、EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR法）检测结果统计
结果：
阳性符合率：10/12=83.3%；
阴性符合率：18/18=100%；
总体符合率：28/30=93.3%。
表11、本发明检测结果统计
结果：
阳性符合率：11/12=91.7%；
阴性符合率：18/18=100%；
总体符合率：28/30=96.7%。
结果显示，本发明同时检测多种核酸的方法检测性能优于已上市产品。说明同时检测多种核酸的方法有助于提升试剂盒检测性能，提高样本的检出率。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司
<120> DNA及RNA同时检测的基因变异位点检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 379
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (86)..(86)
<220>
<221> intron
<222> (187)..(223)
<220>
<221> misc_
<222> (223)..(223)
<223> 省略的内含子序列
<400> 1
gaagcctacg tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt gccgcctgct gggcatctgc 60
ctcacctcca ccgtgcagct catcatgcag ctcatgccct tcggctgcct cctggactat 120
gtccgggaac acaaagacaa tattggctcc cagtacctgc tcaactggtg tgtgcagatc 180
gcaaaggtaa tcagggaagg gagatacggg gaggggagat aagggcatga actacttgga 240
ggaccgtcgc ttggtgcacc gcgacctggc agccaggaac gtactggtga aaacaccgca 300
gcatgtcaag atcacagatt ttgggctggc caaactgctg ggtgcggaag agaaagaata 360
ccatgcagaa ggaggcaaa 379
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (104)..(104)
<220>
<221> intron
<222> (155)..(206)
<220>
<221> misc_
<222> (206)..(206)
<223> 省略的内含子序列
<400> 2
ggcatgaact acttggagga ccgtcgcttg gtgcaccgcg acctggcagc caggaacgta 60
ctggtgaaaa caccgcagca tgtcaagatc acagattttg ggcgggccaa actgctgggt 120
gcggaagaga aagaatacca tgcagaagga ggcaaagtaa ggaggtggct ttaggtcagc 180
cagcattttc ctgacaccag ggaccagtgc ctatcaagtg gatggcattg gaatcaattt 240
tacacagaat ctatacccac cagagtgatg tctggagcta cg 282
<210> 3
<211> 420
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (124)..(124)
<220>
<221> intron
<222> (130)..(238)
<400> 3
ccattggaag ggcaggccca ccacccccac cccaacccca gccccctagc agagacctgt 60
gggaagcgaa aattccatgg gactgacttt ctgctcttgt ctttcagact tcctgaaaac 120
aacattctgg taaggacaag ggttgggctg gggacctgga gggctgggga cctggagggc 180
tggggggctg gggggctgag gacctggtcc tctgactgct cttttcaccc atctacagtc 240
ccccttgccg tcccaagcaa tggatgattt gatgctgtcc ccggacgata ttgaacaatg 300
gttcactgaa gacccaggtc cagatgaagc tcccagaatg ccagaggctg ctccccccgt 360
ggcccctgca ccagcagctc ctacaccggc ggcccctgca ccagccccct cctggcccct 420
<210> 4
<211> 311
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (124)..(124)
<400> 4
ccauuggaag ggcaggccca ccacccccac cccaacccca gcccccuagc agagaccugu 60
gggaagcgaa aauuccaugg gacugacuuu cugcucuugu cuuucagacu uccugaaaac 120
aacauucugu cccccuugcc gucccaagca auggaugauu ugaugcuguc cccggacgau 180
auugaacaau gguucacuga agacccaggu ccagaugaag cucccagaau gccagaggcu 240
gcuccccccg uggccccugc accagcagcu ccuacaccgg cggccccugc accagccccc 300
uccuggcccc u 311
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgtgcag ctcatcat 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaggtactg ggagccaata ttgtc 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccttccctg attaccttt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccaagtagtt catgcccttt 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_
<222> (18)..(18)
<223> 磷酸化修饰
<400> 9
cagctcatca cgcagctc 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatcacagat tttgggcg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcctccttc tgcatggtat 20
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acctccttac tttgc 15
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tccacttgat aggcactttg cc 22
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_
<222> (16)..(16)
<223> 磷酸化修饰
<400> 14
tttgggctgg ccaaac 16
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacttcctga aaacaaca 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtagatggg tgaaaagag 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acagcatcaa atcatccatt g 21
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_
<222> (17)..(17)
<223> 磷酸化修饰
<400> 18
ctgaaaacaa cgttctg 17
Claims (14)
1.一种基于PCR扩增的高灵敏的基因变异位点检测方法，其特征在于：通过对样品中包含目标变异位点的DNA和RNA的共扩增实现。
2.根据权利要求1所述的检测方法，包括针对目标变异位点设计DNA和RNA的共扩增引物的设计步骤，该共扩增引物的设计方法为：
a：变异位点附近无内含子或距内含子较远，能在同一外显子上完成引物设计时，在同一外显子上完成引物设计；
b：变异位点附近存在内含子，不能在同一外显子上完成引物设计，且相邻的内含子长度较短，内含子长度小于约120bp时，在相邻外显子上完成引物对的设计，结果是DNA扩增子中包含一段长度较短的内含子，RNA扩增子中不含内含子；
c：变异位点附近存在内含子，不能在同一外显子上完成引物设计，且相邻的内含子长度较长，内含子长度大于约120bp时，在变异位点所在外显子上完成通用上游或通用下游引物的设计，在相邻内含子上完成DNA扩增所需下游或上游引物的设计，在相邻外显子上完成RNA扩增所需下游及上游引物的设计，结果是DNA扩增子包含部分相邻内含子，RNA扩增子包含部分相邻外显子。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，所述样本类型为体液。
4.根据权利要求3所述的检测方法，所述体液选自：血浆、血清、尿液等。
5.根据权利要求1-4任一项的检测方法，其特征在于：扩增子长度小于约150bp或约140bp或约130bp或约120bp或约90bp。
6.一种同时扩增DNA及RNA的体系，包括了根据权利要求2-5任一项方法设计的同时扩增DNA及RNA的引物对。
7.根据权利要求6的体系，所述体系中还包括PCR缓冲液、dNTPs、二氯化镁、DNA聚合酶、逆转录酶。
8.根据权利要求7的体系，所述体系中还包括阻滞探针。
9.根据权利要求6-8任一项所述的体系，所述体系中还包括UDG酶、dUTP。
10.适合于权利要求6-9任一项所述体系的反应程序，所述反应程序包括UDG酶与逆转录酶在合适温度下同时反应的步骤。
11.根据权利要求10所述的反应程序，所述同时反应的步骤具体为：50-55℃ 5-15min。
12.一种高灵敏基因变异位点检测试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTPs、二氯化镁、DNA聚合酶、其特征在于还包括根据权利要求2-6任一项方法设计的同时扩增DNA及RNA的引物对，还包括逆转录酶。
13.根据权利要求12的试剂盒，所述试剂盒中还包括相应的阻滞探针。
14.根据权利要求12的试剂盒，所述试剂盒中还包括UDG酶、dUTP。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911358465.3A CN110938680A (zh) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Dna及rna同时检测的基因变异位点检测方法 |
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| CN201911358465.3A CN110938680A (zh) | 2019-12-25 | 2019-12-25 | Dna及rna同时检测的基因变异位点检测方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
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Cited By (1)
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2019
- 2019-12-25 CN CN201911358465.3A patent/CN110938680A/zh active Pending
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