JP4922778B2 - 遺伝子検査結果判定法およびプログラムおよびその装置 - Google Patents
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Description
1)標準試料に比較して遺伝子量が変化した対立遺伝子の変化量の信頼度を算出する工程、
2)前記対立遺伝子の変化量及び前記対立遺伝子の組合せ発生頻度に基づいて、染色体異常の有無をそれぞれ判定する工程、
3)前記対立遺伝子の組合せ発生頻度と変化量の信頼度を比較し、いずれか高いほうの判定結果を最終判定結果とする工程。
1)標準試料に比較して遺伝子量が変化した対立遺伝子の変化量の信頼度を算出する手段
2)前記対立遺伝子の変化量及び前記対立遺伝子の組合せ発生頻度に基づいて、染色体異常の有無をそれぞれ判定する手段、
3)前記対立遺伝子の組合せ発生頻度と変化量の信頼度を比較し、いずれか高いほうの判定結果を最終判定結果として出力する手段。
実施例1 p53遺伝子領域内の3種類の対立遺伝子組合せを用いた判定法
1.検査試料の準備
本実施例では、末梢血より抽出したゲノム核酸を標準試料とし、膀胱癌組織および膀胱癌患者尿より抽出したゲノム核酸を検査試料として用いた。末梢血、組織、尿、からゲノム核酸の抽出凍結保存検体からの核酸の抽出は、プロテナーゼKで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら(Basic Method in Moleular Biology, Elsevir Science Publishing 社出版)や菅野らの(Lab. Invest. 68 p361-366 Sugano等(1993))の方法で行った。要約すると、65℃で15分間処理した後に、プロテアーゼK(1mg/mL)、EDTA(10mmol/L)、食塩(150mmol/L)を含むトリス−塩酸緩衝液(10mmol/L)を加えて37℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール:クロロフォルム=1:1溶液を加えて遠心分離することにより核酸を抽出した。抽出液に、0.1容の酢酸ナトリウム溶液(3mol/L)と2.5容の冷無水エタノールを加え、−20℃で2時間冷却し、核酸を沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして1μgのグリコーゲンを加え、核酸の回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、1mLの80%エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。この核酸を含む沈殿物は、TE緩衝液で再溶解した。採取された末梢血は,採取後直ちに4℃に保存され、その後2日以内に核酸抽出された。抽出された核酸は-25℃で凍結保存した。
本実施例では、PCR-SSCP法を用いて対立遺伝子変化量を検出した。本検出の流れとしては、まず、検査試料の検査対象の多型部位に対する対立遺伝子をPCR増幅し、増幅した核酸断片を1本鎖に変性し、SSCP法により対立遺伝子の量をシグナル強度として検出した。
本実施例では標準試料の対立遺伝子(NA、Na)のシグナル(ピーク高さ)と検査試料の2つの対立遺伝子(TA、Ta)のシグナルを比較して、検査試料の対立遺伝子の変化量を、次の式で推定した。(Genes. Chromosomes & Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996))。なお、標準試料をN、検査試料をTとし、2つの対立遺伝子は電気泳動したとき先に先にバンドが現れるほうを大文字、遅れて現れるほうを小文字で示した。
(式1)
対立遺伝子の変化量(%)=(NA/Na−TA/Ta)×100/{NA/Na}
本実施例では標準試料の2つの対立遺伝子(NA、Na)のシグナル(ピーク高さ)と検査試料の2つの対立遺伝子(TA、Ta)のシグナルを比較して、各多型において減少したシグナルを検出し、そのシグナルの検出時間から対立遺伝子の組合せを決定した。この結果を表3の結果を合わせて表4に示す。本実施例においては、減少した対立遺伝子を検出したが、変化しない対立遺伝子を検出することもできる。
本実施例では、異常有無の判定方法として表5に対立遺伝子の変化量が40%以上を陽性として太字(網掛け)で表記し、7%以上40%未満を判定保留として斜体文字で表記し、7%未満を陰性として通常表記した。また、本発明法の比較として、従来の判定法である、DNA濃度が十分大きい場合における測定のバラツキの3SDを取ったCut off値をもとにした変化量の判定結果を併記した。
次に、p53遺伝子領域内の3つの対立遺伝子の取り得る全ての組合せと、約100人のハプロタイプ解析結果より得られた各組合せの発生頻度を表6に示した。この発生頻度より、全てへテロ接合体となる組合せの発生確率を算出した結果を表7に示す。本実施例においては、発生確率を組合せの信頼度とした。
表8の結果より、3つの対立遺伝子から得られた総合的な判定結果を最終判定として、陽性と陰性で判定し、表9に示した。従来の判定方法では、3つの判定結果のうち、陽性となる判定値が2つ以上ある場合に陽性とした。さらに、判定結果の真偽を評価するために、他の多型部位を複数調べて真の異常の有無を調べ、その判定結果を真の判定として表9に併記し、真の判定結果より本発明の判定法と従来法の感度(%)、特異度(%)を算出した。また、本発明の判定法の判定結果が陽性の場合はその判定の信頼度を算出した。また、陽性と陰性とで判定結果の信頼度を算出した。本実施例における信頼度の算出方法としては、対立遺伝子の変化量が40%以上、または7%未満の場合は100%とし、判定保留領域に対しては発生確率を信頼度とした。
配列番号2:プライマー
配列番号3:プライマー
配列番号4:プライマー
配列番号5:プライマー
配列番号6:プライマー
Claims (14)
- 遺伝子多型部位における対立遺伝子の量比を検査し、検査試料の染色体異常を判定する方法であって、
検査試料において、連鎖する2以上の多型部位について2つの対立遺伝子の量比を検査し、該2つの対立遺伝子の量比を標準試料の対立遺伝子の量比と比較することによって、対立遺伝子の量比の変化量を決定する工程と、
前記標準試料の測定誤差範囲を超えて量比の変化量を示す前記検査試料の対立遺伝子を判定する工程と、
前記対立遺伝子の組合せをハプロタイプと仮定した場合の該対立遺伝子の組合せ発生頻度を決定する工程と、
装置の記憶装置に維持される既知の対立遺伝子の組合せのデータベースと照合することにより量比の変化量を示す前記対立遺伝子の組合せ発生確率を決定する工程と、
多型領域における対立遺伝子量の測定バラツキのデータベースを参照することにより前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度を、閾値を基に決定し、染色体異常の有無を決定する工程と、
量比の変化量を示す前記対立遺伝子の組合せ発生頻度とそれぞれ決定した前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度とを比較する工程と、
前記発生頻度又は信頼度のいずれが高いかを決定し、該2つのうち高いほうを最終判定結果として示す工程と、
を含む、前記方法。 - 前記最終判定結果の信頼度を表示する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対立遺伝子の組合せとその発生頻度、前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度、及び前記最終判定結果の信頼度を表示する工程をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記対立遺伝子の組合せをハプロタイプと仮定した場合において、発生確率が99.7%以上のディプロタイプを有する前記検査試料は染色体異常であると判定することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子多型部位における対立遺伝子の量比を検査し、染色体異常を判定するためのプログラムであって、
検査試料において、連鎖する2以上の多型部位について2つの対立遺伝子の量比を検査し、該2つの対立遺伝子の量比を標準試料の対立遺伝子の量比と比較することによって、対立遺伝子の量比の変化量を決定する手段と、
前記標準試料の測定誤差範囲を超えて量比の変化量を示す前記検査試料の対立遺伝子を判定する手段と、
前記対立遺伝子の組合せをハプロタイプと仮定した場合の該対立遺伝子の組合せ発生頻度を決定する手段と、
装置の記憶装置に維持される既知の対立遺伝子の組合せのデータベースと照合することにより量比の変化量を示す前記対立遺伝子の組合せ発生確率を決定する手段と、
多型領域における対立遺伝子量の測定バラツキのデータベースを参照することにより前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度を、閾値を基に決定し、染色体異常の有無を決定する手段と、
量比の変化量を示す前記対立遺伝子の組合せ発生頻度とそれぞれ決定した前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度とを比較する手段と、
前記発生頻度又は信頼度のいずれが高いかを決定し、該2つのうち高いほうを最終判定結果として示す手段と、
を含む、前記プログラム。 - さらに、前記最終判定結果の信頼度を出力する手段を有する、請求項5に記載のプログラム。
- さらに、前記対立遺伝子の組合せとその発生頻度、前記対立遺伝子の量比の変化量のデータ信頼度、及び前記最終判定結果の信頼度を出力する手段を有する、請求項5又は6に記載のプログラム。
- さらに、検査によって得られた組合せ発生頻度を含む検査試料の各種データと、前記データを加えて再計算した各ハプロタイプの発生頻度を格納する手段を有する、請求項5〜7のいずれか1項に記載のプログラム。
- 前記対立遺伝子の組合せをハプロタイプと仮定した場合において、発生確率が99.7%以上のディプロタイプを有する前記検査試料は染色体異常であると判定することを特徴とする、請求項5〜8のいずれか1項に記載のプログラム。
- 遺伝子多型部位における対立遺伝子の量比を検査し、染色体異常を判定するための装置であって、
メモリーと該メモリー上に格納されたプログラムとを含むコンピューターを含み、該プログラムは、該コンピューターに、
検査試料において、連鎖する2以上の多型部位について2つの対立遺伝子の量比を検査し、該2つの対立遺伝子の量比を標準試料の対立遺伝子の量比と比較することによって、対立遺伝子の量比の変化量を決定し、
前記標準試料の測定誤差範囲を超えて量比の変化量を示す前記検査試料の対立遺伝子を判定し、
前記対立遺伝子の組合せをハプロタイプと仮定した場合の該対立遺伝子の組合せ発生頻度を決定し、
前記装置の記憶装置に維持される既知の対立遺伝子の組合せのデータベースと照合することにより量比の変化量を示す前記対立遺伝子の組合せ発生確率を決定し、
多型領域における対立遺伝子量の測定バラツキのデータベースを参照することにより前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度を、閾値を基に決定し、染色体異常の有無を決定し、
量比の変化量を示す前記対立遺伝子の組合せ発生頻度とそれぞれ決定した前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度とを比較し、
前記発生頻度又は信頼度のいずれが高いかを決定し、該2つのうち高いほうを最終判定結果として示すように実行させる、前記装置。 - コンピュータープログラミングは、さらに前記コンピューターに前記最終判定結果の信頼度を表示するように実行させる、請求項10に記載の装置。
- コンピュータープログラミングは、さらに前記コンピューターに前記対立遺伝子の組合せとその発生頻度、前記対立遺伝子の量比の変化量の信頼度、及び前記最終判定結果の信頼度を表示するように実行させる、請求項10又は11に記載の装置。
- コンピュータープログラミングは、さらに前記コンピューターに、検査によって得られた組合せ発生頻度を含む、前記装置の記憶装置中の検査試料の各種データと、前記データを加えて再計算した各ハプロタイプの発生頻度を格納するように実行させる、請求項10〜12のいずれか1項に記載の装置。
- コンピュータープログラミングは、さらに前記コンピューターに、前記対立遺伝子の組合せをハプロタイプと仮定した場合において、発生確率が99.7%以上のディプロタイプを有する前記検査試料は染色体異常であると判定するように実行させる、請求項10〜13のいずれか1項に記載の装置。
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