CN105441540A - 检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用 - Google Patents

检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用 Download PDF

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CN105441540A CN201510885058.3A CN201510885058A CN105441540A CN 105441540 A CN105441540 A CN 105441540A CN 201510885058 A CN201510885058 A CN 201510885058A CN 105441540 A CN105441540 A CN 105441540A
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虞闰六
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Abstract

本发明公开了检测非综合症型耳聋基因多态性的引物，主要包括扩增耳聋基因的5对特异引物，9条测序引物，主要包括GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因、12SrRNA四种基因，具体涉及10个单核苷酸多态性，即GJB2(35DELG、176-191DEL16、235DELC、299-300DEL？AT)、GJB3(538C>T、547G>A)、SLC26A4(2168A>G、IVS7A>G)和线粒体12SrRNA(1494C>T、1555A>G)。本发明还公开了包含上述引物的试剂盒，不仅灵敏度高，而且结果直观，判读更加准确、快速，可以实现准确、快捷、高通量非综合症型耳聋基因多态性的检测。

Description

检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用。
背景技术
耳聋是一组临床异质性很高的疾病，发病年龄、严重程度及损害部位各不相同，60％以上的耳聋与遗传因素有关，其中80％为无其他临床症状的非综合性耳聋(NSHI)。人类基因组计划极大地推动了遗传性耳聋病因学研究，近年来国内外科学家通过大量研究发现，大多数遗传性耳聋属于单基因病。迄今为止，已发现400多个伴有听觉障碍的综合征，鉴定出与之相关的遗传缺陷30多个，而在非综合性遗传性耳聋中，已定位了100多个致病位点，克隆了70多个耳聋基因。国内自2004年起进行了全国范围的聋病分子流行病学调查，结果发现21％的聋人带有GJB2基因突变、14.5％的聋人带有SLC26A4基因突变、3.8％和0.6％的聋人分别带有线粒体DNAA1555G和C1494T突变，另有6％的正常人群携带致聋突变。其中GJB2基因的突变与NSHI密切相关，该基因主要功能是编码缝隙连接蛋白Connexin26，与常染色体显性遗传性耳聋DFNA3和常染色体隐性遗传性耳聋DFNB1也有关，其突变是非综合征型常染色体隐性遗传性语前聋的主要原因，故称其为耳聋易感基因。GJB3基因也是间隙连接蛋白基因家族中的一种，该基因突变不仅能导致常染色体显性非综合征型聋，也能导致常染色体隐性非综合征型聋。临床多表现为高频听力受损的进行性语后聋。SLC26A4基因(PDSgene)是Pendred综合征(又称耳聋-甲状腺肿综合征)的致病基因，SLC26A4基因与GJB2基因是常染色体隐性遗传耳聋家庭产前诊断的主要对象。由其突变导致的前庭水管扩大是内耳最常见的畸形，表现为波动性或进行性感音神经性听力损失，程度达重度到极重度；发病多在儿童时期，发病前常有颅内压增高的诱发因素。12SrRNA基因与儿科临床联系较密切，该基因突变的携带者在使用了氨基糖苷类抗生素后极易致聋。12SrRNA基因的遗传方式为线粒体遗传，特点是女性能将突变的基因传给儿子和女儿，但只有女儿能传给下一代。故线粒体遗传也称母系遗传。
以上这几个基因是我国聋病分子流行病学调查结果，是导致中国大部分非综合征性遗传性耳聋(NSHI)的几个最常见的致病基因，通过对以上基因进行检测，可以诊断近60％的遗传性耳聋。检测出耳聋患者及其家属是否携带目前研究的耳聋热点基因，有助于提高新生儿聋病和高危聋儿的检出率，扩大耳聋的防治与干预范围。对于语前聋患者可以做到早发现早治疗，尽早利用残余听力配戴助听器或植入电子耳蜗，使患儿聋而不哑；对于语后聋患者，可以部分预测以后发病的风险和发病的年龄阶段，从而尽早预防，并对患者的婚配、生育提供遗传信息；对于有线粒体基因突变的患者，可以避免使用氨基糖苷类等耳毒性药物，防止药物性耳聋。总之，通过基因检测，有利于优生优育，提高人口素质。
目前，国内已运用基因芯片技术开展了耳聋基因检测，但其昂贵的检测成本不能为广大民众所接受。一代测序方法Sanger测序亦可对耳聋基因进行检测，但其也存在着检测时间长，检测费用昂贵的缺点。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。本发明旨在建立一种基于焦磷酸测序技术的快速、准确和高通量的非综合性耳聋相关基因多态性检测方法。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，提供一种操作简便、成本低廉、快捷、准确的检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种检测非综合症型耳聋基因多态性的引物，包括如下引物：
扩增GJB2基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
扩增GJB3基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
扩增SLC26A4-1基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；
扩增SLC26A4-2基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
扩增12SrRNA基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；
其中，SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10的5′端进行生物素标记；
GJB235DELG测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；
GJB2176-191DEL16测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；
GJB2235DELC测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；
GJB2299-300DELAT测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；
GJB3538C>T/547G>A测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；
SLC26A42168A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；
SLC26A4IVS7A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：17所示；
12SrRNA1494C>T测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；
12SrRNA1555A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示。
上述检测非综合症型耳聋基因多态性的引物在制备检测非综合症型耳聋基因多态性试剂中的应用也在本发明的保护范围内。
一种检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒，该试剂盒还包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂；
(2)PCR反应液：PCRBuffer，MgCl225mmol/L，dNTPs10mmol/L，TaqDNA聚合酶5U/μL，甘油，SEQIDNO：1～10所示的引物10μmol/L；
(3)单链纯化试剂：体积分数为75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate水溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素，dNTP，测序引物SEQIDNO：11～1910μmol/L。
上述检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒在检测非综合症型耳聋基因多态性中的应用也在本发明的保护范围之内。
一种利用焦磷酸测序技术检测非综合症型耳聋基因多态性的方法，该方法包括如下步骤：
(1)提取标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物，PCR扩增得到基因片段；
(3)将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果分析。
步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为：
PCR扩增采用50μl体系，其中基因组DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl24μL，dNTP3μL，上下游引物各取0.15μL，Taq酶0.3μL，甘油2.5μL，加水补充至50μL；
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
有益效果：应用焦磷酸测序技术可以快速准确检测耳聋基因的多态性，可广泛应用于临床上耳聋患者个体化医疗方案制定及预防。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
附图说明
图1为本发明GJB2野生型纯合子(35delG)焦磷酸测序结果；
图2为本发明GJB2野生型纯合子(176-191del16)焦磷酸测序结果；
图3为本发明GJB2野生型纯合子(235delC)焦磷酸测序结果；
图4为本发明GJB2野生型纯合子(299-300delAT)焦磷酸测序结果；
图5为本发明GJB3野生型纯合子(538C>T)焦磷酸测序结果；
图6为本发明GJB3野生型纯合子(547G>A)焦磷酸测序结果；
图7为本发明SLC26A4野生型纯合子(2168A>G)焦磷酸测序结果；
图8为本发明SLC26A4野生型纯合子(IVS7-2A>G)焦磷酸测序结果；
图9为本发明12SrRNA野生型纯合子(1555A>G)焦磷酸测序结果；
图10为本发明12SrRNA野生型纯合子(1494C>T)焦磷酸测序结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂。
(1)DNA提取试剂：
购自QIAGEN公司。
(2)PCR反应液：
扩增引物SEQIDNO：1～10，由上海英俊生物科技有限公司合成；
PCRBuffer：购自美国Fermentas公司；
MgCl2：购自美国Fermentas公司；
dNTPs：购自美国Fermentas公司；
TaqDNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司；
0.2mol/LNaOH：购于上海试四赫维化工有限公司；
10mMTris-Acetate(pH7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；
结合缓冲液：由10mMTris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司)，2MNaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mMEDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween20(购于美国Sigma公司)组成；
退火缓冲液：由20mMTris-Acetate(pH7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；
亲和素标记的磁珠(购于GEhealthcareBioscienceAB)。
(4)测序试剂：
测序引物SEQIDNO：11～19，由上海英俊生物科技有限公司合成；
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司；
底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司；
四种dNTP(dATPS，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。
实施例2：检测方法。
仪器：Bio-RadS1000PCR仪，BeckmanMicrofuge22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGENPyroMarkQ96ID测序仪。
(1)提取全血标本中的DNA，步骤如下：
a.实验前试剂材料准备与检查工作如下：检查试剂盒保质期以及确保WashBuffer1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；高压灭菌有效期内的1.5mLEppendorf管和各类移液枪头。
b.从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
c.分别移取900uL细胞裂解液加至灭菌的1.5mLEppendorf管；
d.小心移取300uL全血转移至上述加有细胞裂解液的1.5mLEP管；
e.盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；13,000rpm室温离心20秒；弃上清，留白色沉淀；
f.移取300uL细胞核裂解液入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
g.移取100uL蛋白沉淀液入上述Eppendorf管中，盖上管盖，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；
h.移取上清转移到新的已灭菌1.5mLEppendorf管；
i.移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；13,000rpm室温离心1min；
j.弃去上清，移取300uL75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；13,000rpm室温离心1min；
k.弃去上清，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；
l.加入50～100ulDNARehydrationSolution至沉淀；溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后将DNA溶解。
m.保存核酸标本至4℃冰箱。
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；
其中，所述的PCR扩增采用50μl体系，其中DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTP(10mmol/L)3μL，10μmol/L上下游引物各取0.15μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，甘油2.5μL，加水补充至50μL。反应条件94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
每个标本共9管PCR产物：利用SEQIDNO：1～2所示的引物PCRGJB2基因(35DELG、176-191DEL16、235DELC、299-300DELAT)4管、利用SEQIDNO：3～4所示的引物PCRGJB3基因(538C>T、547G>A)1管、利用SEQIDNO：5～6及SEQIDNO：7～8所示的引物PCRSLC26A4基因(2168A>G、IVS7-2A>G)2管，利用SEQIDNO：9～10所示的引物PCR线粒体12SrRNA(1494C>T、1555A>G)2管。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：
a.在使用前，保证所有溶液都达到室温；
b.在PSQ96板中加入45μl退火缓冲液，然后每孔加入对应的测序引物SEQIDNO：11-19(10uM)1uL；GJB2PCR扩增产物中分别加入35DELG、176-191DEL16、235DELC、299-300DELAT(SEQIDNO：11-14)4种测序引物、GJB3PCR扩增产物中加入538C>T、547G>A(SEQIDNO：15)1种测序引物、SLC26A4PCR扩增产物中分别加入2168A>G、IVS7-2A>G(SEQIDNO：16-17)2种测序引物和线粒体12SrRNAPCR扩增产物中分别加入1494C>T、1555A>G(SEQIDNO：18-19)2种测序引物。
c.使用漩涡震荡仪混匀亲和素标记的磁珠，将需要使用的磁珠总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在磁珠中加入结合缓冲液，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；
d.将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；
e.在真空准备工作站中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、洗涤液和120ml变性缓冲液；
f.打开真空准备工作站的泵，将抽真空装置在高纯水中清洗30秒，移到PCR板中，抓取磁珠，放入70％乙醇中5秒，然后移到变性缓冲液中5秒，再移到洗涤液中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将抽真空装置放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠；
h.使用高纯水清洗抽真空装置。
g.将放有样品的PSQ96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序。
(5)测序结果读取基因型多态性。
将本发明所述的试剂盒用于48例临床标本中，对上述十个耳聋基因多态性位点进行检测，检测结果与Sanger测序法结果进行比对，检测结果如下表：
样本号 采用本试剂盒结果 采用Sanger测序结果
1 未突变 未突变
2 未突变 未突变
3 未突变 未突变
4 12SrRNA 1555A突变为G 12SrRNA 1555A突变为G
5 未突变 未突变
6 未突变 未突变
7 未突变 未突变
8 未突变 未突变
9 未突变 未突变
10 未突变 未突变
11 未突变 未突变
12 未突变 未突变
13 12SrRNA 1555A突变为G 12SrRNA 1555A突变为G
14 未突变 未突变
15 未突变 未突变
16 未突变 未突变
17 12SrRNA 1494C突变为T 12SrRNA 1494C突变为T
18 未突变 未突变
19 未突变 未突变
20 未突变 未突变
21 未突变 未突变
22 未突变 未突变
23 未突变 未突变
24 未突变 未突变
25 未突变 未突变
26 未突变 未突变
27 未突变 未突变
28 未突变 未突变6 -->
29 GJB3 538C杂合突变为T GJB3 538C杂合突变为T
30 未突变 未突变
31 未突变 未突变
32 未突变 未突变
33 未突变 未突变
34 未突变 未突变
35 未突变 未突变
36 未突变 未突变
37 12SrRNA 1555A突变为G 12SrRNA 1555A突变为G
38 未突变 未突变
39 未突变 未突变
40 未突变 未突变
41 未突变 未突变
42 未突变 未突变
43 未突变 未突变
44 未突变 未突变
45 12SrRNA 1555A突变为G 12SrRNA 1555A突变为G
46 未突变 未突变
47 未突变 未突变
48 未突变 未突变
48例全血样本中，所有的样本两种方法学检测结果一致，6例标本中有发生基因突变，其中含4例12SrRNA1555位点A纯合突变为G，1例12SrRNA1494位点C纯合突变为T，1例GJB3538位点C杂合突变为T，其余42例均未发生突变。
综上所述，运用焦磷酸测序可以成功检测非综合症型耳聋相关基因多态性；且单个SNP位点检测经与Sanger测序方法比较，符合率为100％。与Sanger测序检测方法相比，能有效降低检测成本，节省检测时间。因此，本试剂盒所提供的方法可准确、高通量、快速检测非综合症型耳聋相关基因多态性，该方法在个性化医疗上有较大的推广应用价值，用于临床能有利于优生优育及治疗方案，也可以将该平台运用于其他疾病相关基因多态性检测。

Claims (6)

1.一种检测非综合症型耳聋基因多态性的引物，其特征在于，包括如下引物：
扩增GJB2基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
扩增GJB3基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；
扩增SLC26A4-1基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；
扩增SLC26A4-2基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；
扩增12SrRNA基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；
其中，SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10的5′端进行生物素标记；
GJB235DELG测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；
GJB2176-191DEL16测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；
GJB2235DELC测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；
GJB2299-300DELAT测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；
GJB3538C>T/547G>A测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；
SLC26A42168A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；
SLC26A4IVS7A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：17所示；
12SrRNA1494C>T测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；
12SrRNA1555A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示。
2.权利要求1所述的检测非综合症型耳聋基因多态性的引物在制备检测非综合症型耳聋基因多态性试剂中的应用。
3.一种检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括如下试剂：
(1)DNA提取试剂；
(2)PCR反应液：PCR缓冲液，MgCl225mmol/L，dNTPs10mmol/L，TaqDNA聚合酶5U/μL，甘油，SEQIDNO：1～10所示的引物10μmol/L；
(3)单链纯化试剂：体积分数为75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate水溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素，dNTPs，测序引物SEQIDNO：11～1910μmol/L。
4.权利要求3所述的检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒在检测非综合症型耳聋基因多态性中的应用。
5.一种利用焦磷酸测序技术检测非综合症型耳聋基因多态性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)提取标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物，PCR扩增得到基因片段；
(3)将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序结果分析。
6.根据权利要求5所述的用焦磷酸测序技术检测非综合症型耳聋基因多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为：
PCR扩增采用50μl体系，其中基因组DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl24μL，dNTP3μL，上下游引物各取0.15μL，Taq酶0.3μL，甘油2.5μL，加水补充至50μL；
PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
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