JPWO2013129542A1 - Hla−a*31:01アレルの検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
HLA−A*31:01を特徴づける1またはそれ以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてHLA−A*31:01の存在の有無を判定することを特徴とする、HLA−A*31:01の検出方法。
[2]
配列特異的プライマーPCR法とインベーダープラス法の組み合わせにより一塩基多型が分析される、前記方法。
[3]
少なくともrs1059449、rs41541222、rs1059471、rs1059457、およびrs41562315から選択される1またはそれ以上の一塩基多型が分析される、前記方法。
[4]
少なくともrs41562315が分析される、前記方法。
[5]
前記方法によりHLA−A*31:01を検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法。
[6]
前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、前記方法。
[7]
下記(A)および(B)を含む配列特異的プライマーセット:
(A)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける第1の一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの3’末端に有する第1のプライマー;
(B)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける第2の一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの3’末端に有する第2のプライマーであって、前記第1のプライマーと対になってHLA−A*31:01の前記第1の一塩基多型から前記第2の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。
[8]
前記第1の一塩基多型がrs41541222またはrs1059457であり、前記第2の一塩基多型がrs41562315である、前記プライマーセット。
[9]
HLA−A*31:01を特徴づける一塩基多型をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブを含むプローブセット。
[10]
前記一塩基多型がrs1059471またはrs1059457である、前記プローブセット。
[11]
前記プライマーセットおよび前記プローブセットを含む、HLA−A*31:01の検出用試薬であって、
前記インベーダーのターゲットである一塩基多型は、前記第1の一塩基多型と前記第2の一塩基多型の間に存在する一塩基多型である、試薬。
本発明の検出方法は、HLA−A*31:01を特徴づける1またはそれ以上の一塩基多型(SNP)を分析し、該分析結果に基づいてHLA−A*31:01の存在の有無を判定することを特徴とする、HLA−A*31:01の検出方法である。上記「1またはそれ以上」とは、1であってもよく、2であってもよく、3であってもよく、それ以上であってもよい。本発明において、「HLA−A*31:01の存在の有無の判定」には、被検者がHLA−A*31:01アレルを有するかどうかの判定、および被検者がHLA−A*31:01アレルを有する可能性が高いか低いかの判定が含まれる。すなわち、本発明の検出方法においては、例えば、被検者がHLA−A*31:01アレルを有するかどうかが判定されてよい。また、本発明の検出方法においては、例えば、被検者がHLA−A*31:01を有する可能性の高低が判定されてよい。なお、本発明において、SNPの「分析」とSNPの「解析」は同義である。
HLA−A*31:01アレルは、カルバマゼピン(CBZ)により誘発されるcADR(CBZ-induced cADR)と関連することが知られている(非特許文献2、3)。よって、HLA−A*31:01アレルの検出結果に基づき、CBZ等の抗てんかん薬による薬疹リスクを判定できる。すなわち、本発明は、本発明の検出方法によりHLA−A*31:01アレルを検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法(以下、本発明の判定方法ともいう)を提供する。なお、本発明において、「薬疹リスク」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを示すリスク、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを示すリスクを含む。よって、本発明において、「検査」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを予測するための検査、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。本発明の判定方法においては、被検者がHLA−A*31:01アレルを有する場合に、抗てんかん薬による薬疹リスクが高いと判定される。また、本発明の判定方法においては、被検者がHLA−A*31:01アレルを有さない場合に、抗てんかん薬による薬疹リスクが低いと判定される。
本発明はまた、HLA−A*31:01アレルを検出するためのプライマーやプローブなどの検出試薬を提供する。
(A)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける第1の一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの3’末端に有する第1のプライマー;
(B)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける第2の一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの3’末端に有する第2のプライマーであって、前記第1のプライマーと対になってHLA−A*31:01の前記第1の一塩基多型から前記第2の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。
(C)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、該一塩基多型をプローブの3’末端に有し、且つ、該一塩基多型の塩基がA、T、G、Cから選択される塩基である、インベーダープローブ;
(D)5’から3’方向に向けて、フラップ配列、および配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける一塩基多型を5’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含むアレルプローブであって、前記インベーダープローブと対になってHLA−A*31:01が存在する場合にインベーダー反応が進行するように設計された、プローブ。
ゲノムDNAサンプルとしては、3グループのHapMapサンプル、すなわち、互いに血縁関係のない90名の日本人および漢民族のサンプル(JCH);90名の北欧系および西欧系のユタ州住民のサンプル(CEU);90名のナイジェリアのイバダンのヨルバ人のサンプル(YRI)を用いた。全てのHapMapサンプルは、Coriell Institute for Genomic Researchから購入した。HapMapサンプルのHLA−A遺伝子型データは、非特許文献7(Erlich RL. et al. BMC Genomics. 2011;12:42.)から取得した。JCHサンプル中13名(14.4%)およびCEUサンプル中4名(4.4%)がHLA−A*31:01アレルを有しており、YRIサンプルはいずれもHLA−A*31:01アレルを有していなかった。
プライマーおよびプローブの設計は、既報(Hosono N. et al. Pharmacogenet Genomics. 2010;20:630-633.)を参考に、以下の手順で行った。また、プローブの配列設計にはUniversal Invader Design Softwareを用いた。HLA−Aアレルの情報は、IMGT/HLA Database (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)から取得した。
インベーダープラスアッセイは、ABI 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、96ウェルプレートで行った。反応液は、総反応液量10 μl当たり、1 x Signal Buffer、1 x FRET Mix (FRET22/FRET7)、Cleavase VIII 60 ng(以上、いずれもThird Wave Technologies製)、10 μM ROX (Sigma, MO, USA)、900 nM 各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、400 nM インベーダープローブ、800 nM アレルプローブ、0.25 U Ex Taq HS DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan)、400 μM dNTP mixture (Takara, Shiga, Japan)、およびゲノムDNA 5 ngからなる。PCRは、95℃ 20秒で開始し、35サイクル×(98℃ 3秒と68℃ 30秒)で行った。PCR後、続けて、99℃ 30秒と63℃ 10分でインベーダー反応を行った。総反応時間は約45分であった。インベーダー反応中、蛍光シグナルを30秒毎に測定した。さらに、2%アガロースゲルを用いてインベーダープラスアッセイ後のPCR産物の電気泳動を行い、各プライマーセットの効率と特異性を評価した。
JCHサンプル(n=90)を解析した結果を図4に示す。いずれのプライマー/プローブセットを用いた場合にも、偽陽性のシグナルは認められず、HLA−A*31:01陽性サンプル(n=13)をHLA−A*31:01陰性サンプル(n=77)と正しく区別することができた。また、アガロースゲル電気泳動の結果によれば、いずれのプライマーセットを用いた場合にも、SSP−PCR工程でターゲットのゲノム領域が選択的に増幅されていることが示唆された。
Claims (11)
- HLA−A*31:01を特徴づける1またはそれ以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてHLA−A*31:01の存在の有無を判定することを特徴とする、HLA−A*31:01の検出方法。
- 配列特異的プライマーPCR法とインベーダープラス法の組み合わせにより一塩基多型が分析される、請求項1に記載の方法。
- 少なくともrs1059449、rs41541222、rs1059471、rs1059457、およびrs41562315から選択される1またはそれ以上の一塩基多型が分析される、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくともrs41562315が分析される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法によりHLA−A*31:01を検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法。
- 前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、請求項5に記載の方法。
- 下記(A)および(B)を含む配列特異的プライマーセット:
(A)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける第1の一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの3’末端に有する第1のプライマー;
(B)配列番号1に示す塩基配列またはその相補配列におけるHLA−A*31:01を特徴づける第2の一塩基多型を3’末端に有する10塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの3’末端に有する第2のプライマーであって、前記第1のプライマーと対になってHLA−A*31:01の前記第1の一塩基多型から前記第2の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。 - 前記第1の一塩基多型がrs41541222またはrs1059457であり、前記第2の一塩基多型がrs41562315である、請求項7に記載のプライマーセット。
- HLA−A*31:01を特徴づける一塩基多型をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブを含むプローブセット。
- 前記一塩基多型がrs1059471またはrs1059457である、請求項9に記載のプローブセット。
- 請求項7または8に記載のプライマーセットおよび請求項9または10に記載のプローブセットを含む、HLA−A*31:01の検出用試薬であって、
前記インベーダーのターゲットである一塩基多型は、前記第1の一塩基多型と前記第2の一塩基多型の間に存在する一塩基多型である、試薬。
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