WO2013129542A1 - Ｈｌａ－ａ＊３１：０１アレルの検出方法 - Google Patents
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Abstract
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出する方法を提供する。ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける１またはそれ以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無を判定する。
Description
本発明はＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの検出方法、当該検出方法による検出結果を利用した抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法、および当該検出方法に用いられる試薬に関する。
薬疹は、薬物による皮膚障害（cutaneous adverse drug reactions；cADRs）の代表的なものであり、薬物によって引き起こされる皮膚や粘膜の急性炎症反応として特徴付けられる。薬疹は、用量非依存性、予測不可能であり、且つ、しばしば命に関わる。薬疹は症状の軽微なものから重篤なものまで多岐にわたるが、重篤なものとしては、３大重症薬疹として知られるスティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson syndrome；ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis；ＴＥＮ）、および薬剤性過敏症症候群（Drug-induced hypersensitivity syndrome；ＤＩＨＳ）が挙げられる。
ほぼ全ての薬物は薬疹を誘発するリスクを有することが報告されているが、中でも、抗てんかん薬であるカルバマゼピン（carbamazepine；ＣＢＺ）はＳＪＳ、ＴＥＮ、およびＤＩＨＳを含む種々の薬疹を誘発しうることが知られている。
これまでの研究により、Ｔ細胞性アレルギー反応が薬疹の発症に関与していると考えられているが、詳細な発症機序は明らかとなっていない。また、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ－６）の再活性化が発熱や肝炎等のＤＩＨＳの諸症状に関与することが示唆されているが、その発症機序は明らかとなっていない。
ＣＢＺに関しては、台湾人被検者を用いた研究により、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen；ＨＬＡ）－Ｂ＊１５０２アレルがＣＢＺにより誘発されるＳＪＳやＴＥＮと極めて強く関連していることが証明されている（非特許文献１）。しかしながら、ＨＬＡ遺伝子座のアレル頻度は人種によって顕著に異なり、例えば、ＨＬＡ－Ｂ＊１５０２アレルは東南アジア人では８．６％の頻度で存在するが（非特許文献１）、日本人や白人では０．１％の頻度でしか存在しない（http://www.allelefrequencies.net）。したがって、日本人や白人では、ＨＬＡ－Ｂ＊１５０２アレルはＣＢＺにより誘発されるＳＪＳやＴＥＮの予測に有用な遺伝的因子とは言えない。
近年、日本人被検者において、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルとＣＢＺにより誘発されるｃＡＤＲ（CBZ-induced cADR）との関連が見出された。すなわち、ＣＢＺにより誘発されるｃＡＤＲ患者の６０．７％がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有していたのに対し、ＣＢＺ耐性被検者では１２．５％のみがＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有していた（オッズ比＝１０．８、Ｐ＝３．６４×１０－１５）（非特許文献２）。また、ヨーロッパ人集団においても、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルとＣＢＺにより誘発されるｃＡＤＲとの関連が報告されている（非特許文献３）。したがって、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する被検者を同定するための遺伝薬理学的試験は、日本人およびヨーロッパ人の両集団において、ＣＢＺにより誘発されるｃＡＤＲの発生率を低減するのに有用である。
ＨＬＡの遺伝型を同定する方法はいくつか報告されているが（非特許文献４～６）、それらの方法は多くの手間と時間を要するという点で改善の余地があった。また、近年、次世代シーケンサーを利用したＨＬＡの遺伝型の同定が行われているが（非特許文献７～９）、反応時間が長くコストがかかるという点で改善の余地がある。
また、ＰＣＲ法とインベーダー法とを組み合わせることによりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出することは知られていない。
Chung WH. et al. Nature. 2004 Apr 1;428(6982):486.
Ozeki T. et al. Hum Mol Genet. 2011;20:1034-1041.
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Lind C. et al. Hum Immunol. 2010;71:1033-1042.
Gabriel C. et al. Hum Immunol. 2009;70:960-964.
本発明は、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを簡便、迅速、且つ正確に検出できる一塩基多型を見出した。また、本発明者らは、ＰＣＲ法とインベーダー法とを組み合わせることによりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを簡便、迅速、且つ正確に検出できることを見出した。これらの知見に基づき、本発明者らは本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける１またはそれ以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無を判定することを特徴とする、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出方法。
[２]
配列特異的プライマーＰＣＲ法とインベーダープラス法の組み合わせにより一塩基多型が分析される、前記方法。
[３]
少なくともrs1059449、rs41541222、rs1059471、rs1059457、およびrs41562315から選択される１またはそれ以上の一塩基多型が分析される、前記方法。
[４]
少なくともrs41562315が分析される、前記方法。
[５]
前記方法によりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法。
[６]
前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、前記方法。
[７]
下記（Ａ）および（Ｂ）を含む配列特異的プライマーセット：
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第１の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第１のプライマー；
（Ｂ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第２の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第２のプライマーであって、前記第１のプライマーと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の前記第１の一塩基多型から前記第２の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。
[８]
前記第１の一塩基多型がrs41541222またはrs1059457であり、前記第２の一塩基多型がrs41562315である、前記プライマーセット。
[９]
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブを含むプローブセット。
[１０]
前記一塩基多型がrs1059471またはrs1059457である、前記プローブセット。
[１１]
前記プライマーセットおよび前記プローブセットを含む、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出用試薬であって、
前記インベーダーのターゲットである一塩基多型は、前記第１の一塩基多型と前記第２の一塩基多型の間に存在する一塩基多型である、試薬。
[１]
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける１またはそれ以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無を判定することを特徴とする、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出方法。
[２]
配列特異的プライマーＰＣＲ法とインベーダープラス法の組み合わせにより一塩基多型が分析される、前記方法。
[３]
少なくともrs1059449、rs41541222、rs1059471、rs1059457、およびrs41562315から選択される１またはそれ以上の一塩基多型が分析される、前記方法。
[４]
少なくともrs41562315が分析される、前記方法。
[５]
前記方法によりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法。
[６]
前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、前記方法。
[７]
下記（Ａ）および（Ｂ）を含む配列特異的プライマーセット：
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第１の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第１のプライマー；
（Ｂ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第２の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第２のプライマーであって、前記第１のプライマーと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の前記第１の一塩基多型から前記第２の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。
[８]
前記第１の一塩基多型がrs41541222またはrs1059457であり、前記第２の一塩基多型がrs41562315である、前記プライマーセット。
[９]
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブを含むプローブセット。
[１０]
前記一塩基多型がrs1059471またはrs1059457である、前記プローブセット。
[１１]
前記プライマーセットおよび前記プローブセットを含む、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出用試薬であって、
前記インベーダーのターゲットである一塩基多型は、前記第１の一塩基多型と前記第２の一塩基多型の間に存在する一塩基多型である、試薬。
＜１＞ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出方法
本発明の検出方法は、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける１またはそれ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を分析し、該分析結果に基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無を判定することを特徴とする、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出方法である。上記「１またはそれ以上」とは、１であってもよく、２であってもよく、３であってもよく、それ以上であってもよい。本発明において、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無の判定」には、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有するかどうかの判定、および被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する可能性が高いか低いかの判定が含まれる。すなわち、本発明の検出方法においては、例えば、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有するかどうかが判定されてよい。また、本発明の検出方法においては、例えば、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を有する可能性の高低が判定されてよい。なお、本発明において、ＳＮＰの「分析」とＳＮＰの「解析」は同義である。
本発明の検出方法は、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける１またはそれ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を分析し、該分析結果に基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無を判定することを特徴とする、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出方法である。上記「１またはそれ以上」とは、１であってもよく、２であってもよく、３であってもよく、それ以上であってもよい。本発明において、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無の判定」には、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有するかどうかの判定、および被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する可能性が高いか低いかの判定が含まれる。すなわち、本発明の検出方法においては、例えば、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有するかどうかが判定されてよい。また、本発明の検出方法においては、例えば、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を有する可能性の高低が判定されてよい。なお、本発明において、ＳＮＰの「分析」とＳＮＰの「解析」は同義である。
ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、ＨＬＡクラスＩ分子の重鎖をコードする遺伝子である。ＨＬＡ－Ａ遺伝子として、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の29910309～29913661の領域が挙げられる。ＨＬＡ－Ａ遺伝子のアレルとしては１７２９種がIMGT/HLA Databaseに登録されており（２０１１年１０月１３日付；バージョン３．６．０）、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルはその１つである。ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの塩基配列を配列番号１に示す。
分析されるＳＮＰは、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ（HLA-A*31:01-discriminating SNP）であれば特に制限されない。「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」とは、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と、他のＨＬＡ－Ａアレルから選択される１またはそれ以上のアレルとを区別できるＳＮＰをいう。
以下、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける程度を「特異性スコア（Specificity score）」という概念を導入して説明する。「特異性スコア」とは、既知の１７２９種のＨＬＡ－Ａアレルについて、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と他のＨＬＡ－Ａアレルとの差異を、翻訳開始点から始めて１塩基毎に得点化したものである。具体的には、まずレファレンスとなるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の翻訳開始点の塩基を、他のＨＬＡ－Ａアレルの相当する塩基と各々比較して、塩基が違えば＋１を加算する。翻訳開始点の塩基、すなわち開始コドンＡＴＧのＡはいずれのＨＬＡ－Ａアレルでも共通であるため翻訳開始点における特異性スコアはゼロである。この操作を順次１塩基ごとに全長３２１６ｂｐ（アレルごとに多少の差がある）の塩基に渡って繰り返していくと、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の塩基位置をパラメータとした特異性スコアが算出される。定義上、特異性スコアが高い程、その塩基位置がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に特異的である、すなわち、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と他の多くのＨＬＡ－Ａアレルとを区別できることを示す。また、言い換えれば、ある塩基位置の特異性スコアがＸである場合、その塩基位置のＳＮＰは、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と、他のＨＬＡ－Ａアレルの内、Ｘ種のアレルとを区別できるＳＮＰである。
ＨＬＡ－Ａ遺伝子領域における特異性スコアの分布を図１に示す。特に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子のエクソン２の後半には特異性スコアの高いＳＮＰｓが存在する。例えば、エクソン２に存在するrs1059449、rs41541222、およびrs1059471は特異性スコアが１５００以上であり、エクソン２に存在するrs1136659およびrs80321556は特異性スコアが１０００以上である。これらのＳＮＰｓはいずれもＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出に特に好ましく用いることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。なお、ＳＮＰｓの中には単一のＳＮＰに複数のrs番号が割り当てられているものも存在する。本発明においてrs番号で特定されるＳＮＰは、当該rs番号が割り当てられている限り、当該rs番号のみが割り当てられているものであってもよく、当該rs番号以外のrs番号が同時に割り当てられているものであってもよい。
また、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」は、被検者が属する人種における各ＨＬＡ－Ａアレルのアレル頻度を考慮して選択するのが好ましい。すなわち、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」は、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と、被検者が属する人種においてアレル頻度が高い他のＨＬＡ－Ａアレルとを区別できるＳＮＰであるのが好ましい。例えば、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」は、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と、被検者が属する人種においてアレル頻度＞０．００１％で存在するＨＬＡ－Ａ＊３１：０１以外のＨＬＡ－Ａアレルとを区別できるＳＮＰであるのが好ましい。
例えば、既知の１７２９種のＨＬＡ－Ａアレルの内、日本人集団においてアレル頻度＞０．００１％で存在するものとしては、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを含む全部で４２種が中央骨髄センターより報告されている（後述する図２に記載の４２種）。よって、日本人被検者のＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出する場合、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」は、少なくとも、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と、それ以外の４１種のＨＬＡ－Ａアレルから選択される１またはそれ以上のアレルとを区別できるＳＮＰであるのが好ましい。例えば、上記例示したrs1059449、rs41541222、rs1059471は、特に制限されないが、日本人被検者におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出に好ましく用いることができる。
本発明において、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」としては、特異性スコアが高いＳＮＰが好ましい。特異性スコアが高いＳＮＰとしては、例えば、特異性スコアで降順に並べた際の上位１０のＳＮＰｓから選択されるものが好ましく、上位５のＳＮＰｓから選択されるものがより好ましい。特異性スコアが高いＳＮＰとして、具体的には、例えば、rs41541222、rs1059449、rs1059471、rs1136659、rs1059506、rs1059536、rs1059517、rs80321556、rs9260156、rs1059509が挙げられる。本発明においては、少なくとも１つの特異性スコアが高いＳＮＰが分析されるのが好ましく、少なくとも２つの特異性スコアが高いＳＮＰが分析されるのがより好ましい。特異性スコアは、例えば、全ＨＬＡ－Ａアレルについて算出されたものであってもよく、被検者が属する人種においてアレル頻度＞０．００１％で存在するＨＬＡ－Ａアレルについて算出されたものであってもよい。
また、本発明において、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」は、既知のＨＬＡ－Ａ遺伝子の配列情報に基づき、上述の特異性スコア、およびＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と他の各ＨＬＡ－Ａアレルとの塩基配列の相同性を考慮して選択することができる。例えば、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」は、特異性スコアが高く、且つ、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１との相同性及び被検者の属する集団におけるアレル頻度がいずれも高いＨＬＡ－ＡアレルがＨＬＡ－Ａ＊３１：０１とともに検出されないようなＳＮＰであるのが好ましい。
また、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」を配列特異的プライマーＰＣＲにより解析する場合、当該ＳＮＰとしては、ＰＣＲによる増幅産物のサイズがおよそ２００ｂｐ以下、具体的には、例えば１２０～１６０ｂｐ程度となるものが好ましい。
また、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ」としては、上記のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰが挙げられる。ここで「上記のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰ」とは、上記のＳＮＰとｒ２＞０．５、好ましくはｒ２＞０．８、さらに好ましくはｒ２＞０．９、特に好ましくはｒ２＝１の関係を満たすＳＮＰをいう。上記のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。また、上記のＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、例えば、複数人（通常は２０～４０人程度）から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。例えば、rs1059471と連鎖不平衡にあるＳＮＰとしてはrs41562315が挙げられる。
本発明においては、例えば、少なくともrs1059449、rs41541222、rs1059471、rs1059457、およびrs41562315から選択される１またはそれ以上のＳＮＰが分析されてよい。これら５つのＳＮＰｓについて、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号２～６に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
また、本発明においては、例えば、少なくともrs41562315が分析されてよい。また、本発明においては、例えば、少なくともrs41562315、rs41541222、およびrs1059457が分析されてもよく、少なくともrs41562315、rs1059457、およびrs1059471が分析されてもよい。
本発明において、上記ＳＮＰを解析することには、上記ＳＮＰに相当するＳＮＰを解析することが含まれる。「上記ＳＮＰに相当するＳＮＰ」とは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子領域における該当ＳＮＰを意味する。すなわち、「上記ＳＮＰに相当するＳＮＰを解析する」ことには、仮に人種の違いなどによってＨＬＡ－Ａ遺伝子配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、ＨＬＡ－Ａ遺伝子領域における該当ＳＮＰを解析することが含まれる。
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液や尿等の体液、口腔粘膜等の細胞、毛髪等の体毛が挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。ＳＮＰの解析においては、例えば、解析対象のＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定してもよいし、解析対象のＳＮＰがＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と同一の種類の塩基であるか否かを決定してもよい。すなわち、例えば、あるＳＮＰの塩基の種類がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１においてＡである場合に、当該ＳＮＰの解析においては、当該ＳＮＰがＡＴＧＣのいずれの塩基であるかを決定してもよいし、当該ＳＮＰがＡであるか否かを決定してもよい。また、ＳＮＰの解析においては、二本鎖ＤＮＡのいずれの鎖を分析してもよい。
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。本発明において、このような、解析対象のＳＮＰに対応する塩基を３’末端に有するプライマーを用いて、解析対象のＳＮＰが特定の塩基である場合にのみＤＮＡ断片が増幅される手法を、「配列特異的プライマーＰＣＲ（sequence-specific primer PCR；ＳＳＰ－ＰＣＲ）法」という場合がある。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２－２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
また、本発明において、ＳＮＰの解析は、配列特異的プライマーＰＣＲ法とインベーダープラス法とを組み合わせて行うのが好ましい。インベーダープラス法は、Third Wave Technologies社が開発した、ＰＣＲとインベーダー反応を単一の容器内で連続的に行う手法である。インベーダー法は、開裂酵素（cleavage enzyme（Cleavaseともいう））と蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer；ＦＲＥＴ）カセットを利用して特定のＳＮＰを検出する手法であり、ハイスループットなＳＮＰジェノタイピングに広く用いられている。インベーダー法は、ハイブリダイゼーション法と比較してより特異的にターゲットのＳＮＰを認識できる点で好ましい。
この方法では、例えば、反応液中に、配列特異的プライマー（配列特異的フォワードプライマー及び配列特異的リバースプライマー）、インベーダープローブ、アレルプローブ、蛍光ラベルされたFRETプローブ、Cleavase、dNTP、Taqポリメラーゼ、および解析対象のＤＮＡを含めて配列特異的プライマーＰＣＲを行い、続けて、インベーダー反応を行う。各配列特異的プライマーは解析対象のＳＮＰに対応する塩基を３’末端に有し、配列特異的プライマーＰＣＲ工程において解析対象のＳＮＰが特定の塩基である場合にのみＤＮＡ断片の増幅が起こるように設計される。アレルプローブおよびインベーダープローブは、増幅断片中のインベーダーのターゲットとなるＳＮＰの両側にそれぞれハイブリダイズするように設計される。アレルプローブは、前記ハイブリダイズする部分の５’側末端に解析対象のＳＮＰに対応する塩基を有し、そのさらに５’側にフラップ配列を有する。つまり、アレルプローブは、５’末端から順に、フラップ配列、インベーダーのターゲットとなるＳＮＰ、解析対象のＤＮＡ特異的配列からなる配列を含むように設計される。インベーダープローブは、インベーダーのターゲットとなるＳＮＰ部位がプローブの３’末端に位置するように設計されるが、当該３’末端の塩基の種類は任意である。アレルプローブ中のインベーダーのターゲットとなるＳＮＰに対応する塩基は、増幅断片中の当該ＳＮＰが特定の塩基である場合にのみ当該ＳＮＰ塩基とハイブリダイズし、さらにインベーダープローブの３’末端の塩基（種類は任意）が当該ハイブリダイズ箇所に侵入することで、当該ＳＮＰ部位において三重構造が形成される。次に、Cleavaseが三重構造を認識してアレルプローブをＳＮＰに相当する塩基と前記ハイブリダイズする部分の５’側末端の間で切断し、３’側末端にＳＮＰ塩基が付加されたフラップ配列が遊離する。遊離したフラップ配列はFRETプローブとハイブリダイズして同様の三重構造を形成し、Cleavaseが三重構造を認識してFRETプローブから蛍光ラベルを遊離させることで、蛍光シグナルが得られる。すなわち、ターゲットとなる３つのＳＮＰｓがそれぞれ特定の塩基である場合に、ＤＮＡ断片の増幅とインベーダー反応が起こり、蛍光シグナルが得られる。ＰＣＲおよびそれに続くインベーダー反応は、常法に従って行うことができる。また、Cleavaseとしては、例えば、Cleavase VIIIやCleavase 2.0を用いることができる。
この方法では、例えば、配列特異的プライマーＰＣＲのターゲットとなる２つのＳＮＰｓおよびインベーダーのターゲットとなるＳＮＰに基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出することができる。これらのＳＮＰは、例えば、各ＳＮＰの特異性スコア、増幅断片のサイズ、各ＳＮＰ周辺のミスマッチの有無等の諸条件を考慮して適宜選択することができる。
また、上記ではターゲットとなる３つのＳＮＰｓに基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出する場合を例示したが、所望の検出精度を実現できる限り、ターゲットとなるＳＮＰｓの個数を増減してもよい。例えば、所望の検出精度を実現できる限り、配列特異的プライマーＰＣＲは配列特異的プライマーと、多型の判定に関わらない汎用プライマーとの組み合わせで行ってもよい。
なお、インベーダー反応においては、複数種のFRETプローブと、それに対応するフラップ配列を有するアレルプローブを利用することで、あるＳＮＰ部位における複数種類の塩基を同時に検出し分けることや、複数のＳＮＰｓ部位の塩基がそれぞれ特定の塩基であるか否かを同時に検出することもできる。
このようにして解析対象のＳＮＰがいずれの塩基であるか、または解析対象のＳＮＰがＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と同一の種類の塩基であるか否かを決定することで、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有するか否か、あるいは、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する可能性の高低を決定できる。
本発明の検出方法においては、解析対象のＳＮＰ（ｓ）の全てがＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と同一の種類の塩基である場合に、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する、あるいは、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する可能性があると決定できる。本発明の検出方法において、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルと共に、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレル以外のＨＬＡ－Ａアレルが検出される場合は、当該ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレル以外のＨＬＡ－Ａアレルの数や被検者の属する人種におけるアレル頻度を考慮して、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有するか否か、あるいは、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する可能性の高低を決定できる。なお、本発明の検出方法において、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルと共に、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレル以外のＨＬＡ－Ａアレルが検出される場合、必要に応じて、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルと、当該ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレル以外のＨＬＡ－Ａアレルとを区別するための操作を行ってもよい。
＜２＞抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルは、カルバマゼピン（ＣＢＺ）により誘発されるｃＡＤＲ（CBZ-induced cADR）と関連することが知られている（非特許文献２、３）。よって、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの検出結果に基づき、ＣＢＺ等の抗てんかん薬による薬疹リスクを判定できる。すなわち、本発明は、本発明の検出方法によりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法（以下、本発明の判定方法ともいう）を提供する。なお、本発明において、「薬疹リスク」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを示すリスク、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを示すリスクを含む。よって、本発明において、「検査」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを予測するための検査、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。本発明の判定方法においては、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する場合に、抗てんかん薬による薬疹リスクが高いと判定される。また、本発明の判定方法においては、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有さない場合に、抗てんかん薬による薬疹リスクが低いと判定される。
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルは、カルバマゼピン（ＣＢＺ）により誘発されるｃＡＤＲ（CBZ-induced cADR）と関連することが知られている（非特許文献２、３）。よって、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの検出結果に基づき、ＣＢＺ等の抗てんかん薬による薬疹リスクを判定できる。すなわち、本発明は、本発明の検出方法によりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法（以下、本発明の判定方法ともいう）を提供する。なお、本発明において、「薬疹リスク」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを示すリスク、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを示すリスクを含む。よって、本発明において、「検査」とは、抗てんかん薬の投与により薬疹が発生するかどうかを予測するための検査、及び抗てんかん薬の投与により薬疹の程度が悪化するかどうかを予測するための検査を含む。本発明の判定方法においては、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有する場合に、抗てんかん薬による薬疹リスクが高いと判定される。また、本発明の判定方法においては、被検者がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有さない場合に、抗てんかん薬による薬疹リスクが低いと判定される。
薬疹としては、特に制限されず、スティーブンス・ジョンソン症候群（Stevens-Johnson syndrome；ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（toxic epidermal necrolysis；ＴＥＮ）、薬剤性過敏症症候群（Drug-induced hypersensitivity syndrome；ＤＩＨＳ）、多型性紅斑（erythema multiforeme；ＥＭ）、播種状紅斑丘疹（maculopapular eruption；ＭＰＥ）、紅斑（erythema）、紅皮症（erythroderma）、および固定薬疹（fixed drug eruption）等が挙げられる。
抗てんかん薬としては、特に制限されないが、イミノスチルベン系の薬剤であるのが好ましく、カルバマゼピン（ＣＢＺ）であるのがより好ましい。
本発明の判定方法を適用できる人種としては、特に制限されないが、例えば、日本人や白人が挙げられる。
本発明の判定方法においては、抗てんかん薬による薬疹リスクと関連する他のＳＮＰｓから選択される１またはそれ以上のＳＮＰｓを併せて解析してもよい。そのようなＳＮＰｓとしては、例えば、ヒトの第６染色体短腕２１．３３領域（６ｐ２１．３３領域）に含まれるＳＮＰｓが挙げられる（特許文献２）。６ｐ２１．３３領域に含まれるＳＮＰｓとして、具体的には、例えば、rs1633021、rs2571375、rs1116221、rs2844796、rs1736971、rs1611133、rs2074475、rs7760172、rs2517673、rs2524005、rs12665039、およびrs1362088、並びにそれらＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓが挙げられる（特許文献２）。
＜３＞本発明の検出用試薬
本発明はまた、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出するためのプライマーやプローブなどの検出試薬を提供する。
本発明はまた、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出するためのプライマーやプローブなどの検出試薬を提供する。
プライマーとしては、上記多型部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１においてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰを含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、配列番号２～６のいずれかにおいて塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０～５０塩基が好ましく、１５～３５塩基がより好ましく、２０～３５塩基がさらに好ましい。
上記多型部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位をシークエンシングするために用いることのできるプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０～１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０～１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。なお、増幅されたＤＮＡ断片中の多型の解析は、例えば、インベーダー法等の上記例示した手法により実施できる。
ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマー（配列特異的プライマーともいう）としては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。配列特異的プライマーと対になって用いられるプライマーは、他の配列特異的プライマーであってもよいし、多型の判定に関わらない汎用プライマーであってもよい。配列特異的プライマーと他の配列特異的プライマーとを組み合わせて用いる場合、より正しくＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出できると期待される。
ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルが存在する場合にＤＮＡ断片が増幅される配列特異的プライマーとしては、例えば、配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有するプライマーが挙げられる。
また、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルが存在する場合にＤＮＡ断片が増幅される配列特異的プライマーのセットとしては、例えば、下記（Ａ）および（Ｂ）を含むセットが挙げられる。
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第１の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第１のプライマー；
（Ｂ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第２の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第２のプライマーであって、前記第１のプライマーと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の前記第１の一塩基多型から前記第２の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第１の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第１のプライマー；
（Ｂ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第２の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第２のプライマーであって、前記第１のプライマーと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の前記第１の一塩基多型から前記第２の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。
上記「該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する」とは、上記１０塩基以上の長さの配列中の上記ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ部位が、プライマーの３’末端に位置していることを意味する。上記「１０塩基以上の長さ」とは、例えば、１０塩基以上の長さであってもよく、１５塩基以上の長さであってもよく、２０塩基以上の長さであってもよい。また、上記「１０塩基以上の長さ」とは、例えば、５０塩基以下の長さであってもよく、３５塩基以下の長さであってもよい。
上記各配列特異的プライマーは、５’側に任意の塩基配列を有していてもよい。具体的には、例えば、第１のプライマーについて、前記「１０塩基以上の長さ」が１５塩基で、プライマーの全長が２０塩基である場合、プライマーの３’側１５塩基は配列番号１の塩基配列またはその相補配列における第１のＳＮＰを３’末端に有する１５塩基の配列からなり、残りの部分、すなわち５’側５塩基は任意の配列であってよいことを意味する。
第１および第２のＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰは、例えば、各ＳＮＰの特異性スコア、増幅断片のサイズ、各ＳＮＰ周辺のミスマッチの有無等の諸条件を考慮して適宜選択することができる。具体的には、例えば、前記第１の一塩基多型はrs41541222またはrs1059457であってよく、前記第２の一塩基多型はrs41562315であってよい。rs41541222、rs1059457、およびrs41562315に対応する配列特異的プライマーとして、具体的には、例えば、プライマーＦ１（CCGTGGATAGAGCAGGAGAGGCCT；配列番号７）、プライマーＦ２（GAGAGGCCTGAGTATTGGGACCAGGAG；配列番号８）、プライマーＲ（TGACCTGCGCCCCGGGCT；配列番号９）がそれぞれ挙げられる。また、配列特異的プライマーは、例えば、これらのプライマーの３’側１０塩基以上からなる塩基配列を有するプライマーであってもよく、当該塩基配列の５’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列を有するプライマーであってもよい。
なお、上記各配列特異的プライマーにおいて、３’末端の塩基をＨＬＡ－Ａ＊３１：０１以外のアレルに対応する塩基に変更することで、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１以外のアレルが存在する場合にＤＮＡ断片が増幅される配列特異的プライマーを設計することができる。
また、プローブとしては、上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰを含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブや、配列番号２～６のいずれかにおいて塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５～３５塩基であり、より好ましくは２０～３５塩基である。
また、インベーダー法に用いられるプローブセットとしては、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブを含むセットが挙げられる。そのようなプローブは、例えば、Universal Invader Design Software等のソフトウェアを利用して設計することができる。インベーダー／アレルプローブは、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１が存在する場合にインベーダー反応が進行するように設計することができる。
そのようなインベーダー／アレルプローブのセットとしては、例えば、下記（Ｃ）および（Ｄ）を含むセットが挙げられる。
（Ｃ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、該一塩基多型をプローブの３’末端に有し、且つ、該一塩基多型の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択される塩基である、インベーダープローブ；
（Ｄ）５’から３’方向に向けて、フラップ配列、および配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型を５’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含むアレルプローブであって、前記インベーダープローブと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１が存在する場合にインベーダー反応が進行するように設計された、プローブ。
（Ｃ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、該一塩基多型をプローブの３’末端に有し、且つ、該一塩基多型の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択される塩基である、インベーダープローブ；
（Ｄ）５’から３’方向に向けて、フラップ配列、および配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型を５’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含むアレルプローブであって、前記インベーダープローブと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１が存在する場合にインベーダー反応が進行するように設計された、プローブ。
上記「該一塩基多型をプローブの３’末端に有し、且つ、該一塩基多型の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃから選択される塩基である」とは、上記１０塩基以上の長さの配列中の上記ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づけるＳＮＰ部位が、プローブの３’末端に位置しているが、その塩基の種類は任意のものでよいことを意味する。上記「１０塩基以上の長さ」とは、例えば、１０塩基以上の長さであってもよく、１５塩基以上の長さであってもよく、２０塩基以上の長さであってもよい。また、上記「１０塩基以上の長さ」とは、例えば、５０塩基以下の長さであってもよく、３５塩基以下の長さであってもよい。
上記インベーダープローブは５’側に任意の塩基配列を有していてもよい。また、上記アレルプローブは５’側および／または３’側に任意の塩基配列を有していてもよい。例えば、インベーダープローブについて、前記「１０塩基以上の長さ」が１５塩基で、プローブの全長が２０塩基である場合、プローブの３’側１５塩基は配列番号１の塩基配列またはその相補配列における第１のＳＮＰを３’末端に有する１５塩基の配列からなり、残りの部分、すなわち５’側５塩基は任意の配列であってよいことを意味する。
インベーダーのターゲットであるＳＮＰは、例えば、ＳＮＰの特異性スコアやＳＮＰ周辺のミスマッチの有無等の諸条件を考慮して適宜選択することができる。具体的には、例えば、インベーダーのターゲットであるＳＮＰは、rs1059457またはrs1059471であってよい。rs1059457をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブとして、具体的には、例えば、インベーダープローブ１（CCTGAGTATTGGGACCAGGAT；配列番号１０）およびアレルプローブ１（ＦＡＭ）（ATGACGTGGCAGACGACACGGAATGTGAAGG；配列番号１１）が挙げられる。また、rs1059471をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブとして、具体的には、例えば、インベーダープローブ２（TGAAGGCCCACTCACAGAA；配列番号１２）およびアレルプローブ２（ＦＡＭ）（ATGACGTGGCAGACTTGACCGAGTGGACC；配列番号１３）が挙げられる。また、インベーダープローブは、例えば、これらのインベーダープローブの３’側１０塩基以上からなる塩基配列を有するプローブであってもよく、当該塩基配列の５’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列を有するプローブであってもよい。また、アレルプローブは、例えば、これらのアレルプローブ塩基配列におけるフラップ配列とそれに続く１０塩基以上の塩基配列を有するプローブであってもよく、当該塩基配列の５’末端および／または３’末端に任意の塩基配列が付加された塩基配列を有するプローブであってもよい。
上記アレルプローブ１（ＦＡＭ）およびアレルプローブ２（ＦＡＭ）の５’側１４塩基は、ＦＡＭ用のフラップ配列である。よって、インベーダー法にＦＡＭ以外のラベルを利用する場合は、当該フラップ配列をＦＡＭ以外のラベルに対応したものに変更することができる。
本発明の検出用試薬は、配列特異的プライマーセットおよびインベーダー法に用いるプローブセットを含むものであってもよい。これらプライマーセットおよびプローブセットを組み合わせて用いる場合、インベーダーのターゲットである一塩基多型は、前記第１の一塩基多型と前記第２の一塩基多型の間に存在する一塩基多型から選択すればよい。
また、本発明の検出用試薬はこれらのプライマーおよび／またはプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬、インベーダー反応用のFRETプローブやCleavase等から選択されるものを含むものであってもよい。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、本実施例において、「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１：０２」と「ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１」は同じものである。
本実施例では、配列特異的プライマーＰＣＲとインベーダープラス法とを組み合わせてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの検出を行った。
（１）ゲノムＤＮＡサンプル
ゲノムＤＮＡサンプルとしては、３グループのＨａｐＭａｐサンプル、すなわち、互いに血縁関係のない９０名の日本人および漢民族のサンプル（ＪＣＨ）；９０名の北欧系および西欧系のユタ州住民のサンプル（ＣＥＵ）；９０名のナイジェリアのイバダンのヨルバ人のサンプル（ＹＲＩ）を用いた。全てのＨａｐＭａｐサンプルは、Coriell Institute for Genomic Researchから購入した。ＨａｐＭａｐサンプルのＨＬＡ－Ａ遺伝子型データは、非特許文献７（Erlich RL. et al. BMC Genomics. 2011;12:42.）から取得した。ＪＣＨサンプル中１３名（１４．４％）およびＣＥＵサンプル中４名（４．４％）がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有しており、ＹＲＩサンプルはいずれもＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有していなかった。
ゲノムＤＮＡサンプルとしては、３グループのＨａｐＭａｐサンプル、すなわち、互いに血縁関係のない９０名の日本人および漢民族のサンプル（ＪＣＨ）；９０名の北欧系および西欧系のユタ州住民のサンプル（ＣＥＵ）；９０名のナイジェリアのイバダンのヨルバ人のサンプル（ＹＲＩ）を用いた。全てのＨａｐＭａｐサンプルは、Coriell Institute for Genomic Researchから購入した。ＨａｐＭａｐサンプルのＨＬＡ－Ａ遺伝子型データは、非特許文献７（Erlich RL. et al. BMC Genomics. 2011;12:42.）から取得した。ＪＣＨサンプル中１３名（１４．４％）およびＣＥＵサンプル中４名（４．４％）がＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有しており、ＹＲＩサンプルはいずれもＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを有していなかった。
（２）プライマーおよびプローブの設計
プライマーおよびプローブの設計は、既報（Hosono N. et al. Pharmacogenet Genomics. 2010;20:630-633.）を参考に、以下の手順で行った。また、プローブの配列設計にはUniversal Invader Design Softwareを用いた。ＨＬＡ－Ａアレルの情報は、IMGT/HLA Database (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)から取得した。
プライマーおよびプローブの設計は、既報（Hosono N. et al. Pharmacogenet Genomics. 2010;20:630-633.）を参考に、以下の手順で行った。また、プローブの配列設計にはUniversal Invader Design Softwareを用いた。ＨＬＡ－Ａアレルの情報は、IMGT/HLA Database (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)から取得した。
既知の１７２９種のＨＬＡ－Ａアレルの内、日本人集団においてアレル頻度＞０．００１％で存在するものとしては、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを含む全部で４２種が中央骨髄センターより報告されている（ｎ＝２２３５８９）。そこで、当該４２種のＨＬＡ－Ａアレルに限定して、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを特徴づけるＳＮＰｓ（HLA-A*31:01-discriminating SNPs）の探索を行った。その結果、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを他のＨＬＡ－Ａアレルから区別できるいくつかのＳＮＰｓがエクソン２において見出された。前記４２種のＨＬＡ－ＡアレルのアラインメントとＳＮＰｓを図２に示す。
dbMHC Sequence Alignment Viewerを用いて各ＨＬＡ－Ａアレルを比較したところ、塩基位置３７２のrs41541222が、最も区別的（discriminative）なＳＮＰとして同定された。なお、「塩基位置」とは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の翻訳開始点（すなわち、開始コドンＡＴＧのＡ）を塩基番号１として、以下、同遺伝子の３’方向に順にカウントしたものである。また、２番目に区別的なＳＮＰは塩基位置４１９のrs1059471、３番目に区別的なＳＮＰは塩基位置３６７のrs1059449であった。
これらＳＮＰｓの位置を考慮し、最も区別的なrs41541222に対応する塩基を３’末端に有するフォワードプライマーＦ１を設計した。
次に、２番目に区別的なrs1059471に対応する塩基を３’末端に有するリバースプライマーの設計を試みた。しかしながら、当該リバースプライマーとＦ１を組み合わせた場合、おそらくは増幅サイズが短いことが原因で、適切なインベーダー／アレルプローブをUniversal Invader Design Softwareを用いて設計できなかった。そこで、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける他の候補ＳＮＰの探索を行ったところ、エクソン２近傍のイントロン２内にrs41562315（塩基位置４８５）が見出された。イントロン領域の配列情報は不完全であったが、利用可能な１１０個のゲノム配列を比較したところ、rs41562315はrs1059471と完全連鎖不平衡にあることが示唆された。そこで、rs41562315に対応する塩基を３’末端に有するリバースプライマーＲを設計した。
次に、インベーダーのターゲット部位周辺の塩基のミスマッチの個数を考慮して、塩基位置３９０のrs1059457をインベーダーのターゲット部位として選択した。Universal Invader Design Softwareを用いて、rs1059457をインベーダーのターゲット部位とするインベーダープローブ１およびアレルプローブ１（ＦＡＭ）を設計した。なお、以下、フォワードプライマーＦ１、リバースプライマーＲ、インベーダープローブ１、およびアレルプローブ１（ＦＡＭ）からなるプライマー／プローブセット（primers/probes set）をセット１と称する。
さらに、セット１によるＨＬＡタイピングの結果を補強するため、第２のプライマー／プローブセット（以下、セット２と称する）を設計した。リバースプライマーＲはセット１とセット２で共通とした。セット２のフォワードプライマーＦ２は、セット１のインベーダーのターゲット部位であるrs1059457に対応する塩基を３’末端に有するように設計した。また、２番目に区別的なＳＮＰであるrs1059471をインベーダーターゲット部位として選択し、インベーダープローブ２およびアレルプローブ２（ＦＡＭ）を設計した。
各セットのプライマーおよびプローブの位置を図３に、塩基配列を表１に示す。
なお、セット１とセット２のいずれを用いた場合にも、日本人集団においてアレル頻度＞０．００１％で存在するＳＮＰｓの内、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１以外にＨＬＡ－Ａ＊３１：１１が検出されると考えられる。しかしながら、日本人集団におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：１１のアレル頻度は０．００２％と極めてまれであり、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１のアレル頻度は８．６５％（すなわちＨＬＡ－Ａ＊３１：１１のアレル頻度の４３２５倍）であることから、上記設計した各プライマー／プローブセットはＨＬＡ－Ａ＊３１：０１選択的であると判断した。
（３）インベーダープラスアッセイ
インベーダープラスアッセイは、ABI 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、９６ウェルプレートで行った。反応液は、総反応液量10 μl当たり、1 x Signal Buffer、1 x FRET Mix (FRET22/FRET7)、Cleavase VIII 60 ng（以上、いずれもThird Wave Technologies製）、10 μM ROX (Sigma, MO, USA)、900 nM 各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、400 nM インベーダープローブ、800 nM アレルプローブ、0.25 U Ex Taq HS DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan)、400 μM dNTP mixture (Takara, Shiga, Japan)、およびゲノムＤＮＡ 5 ngからなる。ＰＣＲは、９５℃ ２０秒で開始し、３５サイクル×（９８℃ ３秒と６８℃ ３０秒）で行った。ＰＣＲ後、続けて、９９℃ ３０秒と６３℃ １０分でインベーダー反応を行った。総反応時間は約４５分であった。インベーダー反応中、蛍光シグナルを３０秒毎に測定した。さらに、２％アガロースゲルを用いてインベーダープラスアッセイ後のＰＣＲ産物の電気泳動を行い、各プライマーセットの効率と特異性を評価した。
インベーダープラスアッセイは、ABI 7500 Fast real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用い、９６ウェルプレートで行った。反応液は、総反応液量10 μl当たり、1 x Signal Buffer、1 x FRET Mix (FRET22/FRET7)、Cleavase VIII 60 ng（以上、いずれもThird Wave Technologies製）、10 μM ROX (Sigma, MO, USA)、900 nM 各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、400 nM インベーダープローブ、800 nM アレルプローブ、0.25 U Ex Taq HS DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan)、400 μM dNTP mixture (Takara, Shiga, Japan)、およびゲノムＤＮＡ 5 ngからなる。ＰＣＲは、９５℃ ２０秒で開始し、３５サイクル×（９８℃ ３秒と６８℃ ３０秒）で行った。ＰＣＲ後、続けて、９９℃ ３０秒と６３℃ １０分でインベーダー反応を行った。総反応時間は約４５分であった。インベーダー反応中、蛍光シグナルを３０秒毎に測定した。さらに、２％アガロースゲルを用いてインベーダープラスアッセイ後のＰＣＲ産物の電気泳動を行い、各プライマーセットの効率と特異性を評価した。
（４）結果
ＪＣＨサンプル（ｎ＝９０）を解析した結果を図４に示す。いずれのプライマー／プローブセットを用いた場合にも、偽陽性のシグナルは認められず、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１陽性サンプル（ｎ＝１３）をＨＬＡ－Ａ＊３１：０１陰性サンプル（ｎ＝７７）と正しく区別することができた。また、アガロースゲル電気泳動の結果によれば、いずれのプライマーセットを用いた場合にも、ＳＳＰ－ＰＣＲ工程でターゲットのゲノム領域が選択的に増幅されていることが示唆された。
ＪＣＨサンプル（ｎ＝９０）を解析した結果を図４に示す。いずれのプライマー／プローブセットを用いた場合にも、偽陽性のシグナルは認められず、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１陽性サンプル（ｎ＝１３）をＨＬＡ－Ａ＊３１：０１陰性サンプル（ｎ＝７７）と正しく区別することができた。また、アガロースゲル電気泳動の結果によれば、いずれのプライマーセットを用いた場合にも、ＳＳＰ－ＰＣＲ工程でターゲットのゲノム領域が選択的に増幅されていることが示唆された。
また、ＣＥＵサンプル（ｎ＝９０）およびＹＲＩサンプル（ｎ＝９０）を解析した結果を図５に示す。いずれのプライマー／プローブセットを用いた場合にも、ＣＥＵサンプル中のＨＬＡ－Ａ＊３１：０１陽性サンプル（ｎ＝４）を正しく検出できた。また、いずれのプライマー／プローブセットを用いた場合にも、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１陽性サンプルの存在しないＹＲＩサンプルでは陽性シグナルは現れず、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１以外のＨＬＡ－Ａアレルとの交差反応は認められなかった。
以上より、セット１とセット２のいずれのプライマー／プローブセットを用いた場合にも、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの有無を正しく検出できることが明らかとなった。
なお、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析によれば、セット１とセット２のいずれを用いた場合にも、既知の１７２９種のＨＬＡ－Ａアレルの内、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に加えて５２種のＨＬＡ－Ａアレルが検出される可能性がある。５２種の内、４５種のＨＬＡ－Ａアレルは、Allele frequency netの登録情報によればアレル頻度がゼロであり、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出に影響しないと考えられる。一方、残りの７種は、比較的低い頻度ではあるが種々の人種に分布している（０．００６％～５．５％）（表２）。例えば、白人集団はＨＬＡ－Ａ＊３１０２アレルを１％以上の頻度で有している。よって、セット１またはセット２のプライマー／プローブセットで白人集団を解析すると、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１に加えて、ＨＬＡ－Ａ＊３１０２が１％以上の頻度で検出される可能性がある。このような誤検出を防ぐには、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１とＨＬＡ－Ａ＊３１０２を区別できるＳＮＰをターゲットとする他のプライマー／プローブセットを設計し、セット１またはセット２のプライマー／プローブセットと併用すればよい。セット１とセット２のいずれもＦＡＭチャネルのみを利用してＨＬＡ－Ａ＊３１：０１のシグナルを検出しているため、他のプライマー／プローブセットでＶＩＣ蛍光チャネルを利用すれば同時に解析できる。ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１とＨＬＡ－Ａ＊３１０２を区別できるＳＮＰとしては、例えば、rs1059460が挙げられる。
また、上述の通り、セット１とセット２のいずれを用いた場合にも、日本人集団においてまれに存在するＨＬＡ－Ａ＊３１：１１をＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と区別できない。ＨＬＡ－Ａ＊３１：１１と薬疹リスクとの関連は未知であるが、上記と同様、他のプライマー／プローブセットを併用することでＨＬＡ－Ａ＊３１：１１をＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と区別できる。ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１とＨＬＡ－Ａ＊３１：１１を区別できるＳＮＰとしては、例えば、エクソン３における塩基位置９３６のＳＮＰ（ｒｓ番号なし）が挙げられる。
さらに、ＨＬＡクラスＩアレルは互いに相同性が高いことが知られていることから、ゲノム上の他のＨＬＡ領域から増幅が起こる可能性を以下の手順で検討した。UCSC Blat Search（http://genome.ucsc.edu/index.html）で検索したところ、セット１またはセット２のプライマーセットで増幅される領域と比較的高い相同性（最大で８７．６％）を有する領域が、ＨＬＡ－Ｌ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃ領域に見出された。そこで、それらの領域がセット１またはセット２のプライマーセットで増幅されるかどうかを、IMGT/HLA Database version 3.6.0の登録データに基づきdbMHC Sequence Alignment Viewerを用いて検討した。なお、イントロン領域の配列情報は不完全であるためリバースプライマーＲの３’末端のミスマッチの有無は無視した。その結果、２３２９種のＨＬＡ－Ｂアレル中の２つのアレル（ＨＬＡ－Ｂ＊４０：２２ＮおよびＨＬＡ－Ｂ＊４０：１３４）は増幅される可能性があったが、１２９１種のＨＬＡ－Ｃアレルおよび５種のＨＬＡ－Ｌアレル中に増幅される可能性のあるアレルはなかった。上記２つのＨＬＡ－Ｂアレルはインベーダーのターゲット部位の塩基もＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と同一であるためセット１またはセット２のプライマー／プローブセットではＨＬＡ－Ａ＊３１：０１と区別できないが、Allele frequency netの登録情報によればこれら２つのＨＬＡ－Ｂアレルのアレル頻度はゼロであるため、セット１またはセット２のプライマー／プローブセットでゲノム上の他のＨＬＡ領域が増幅される可能性は低いと考えられる。
本発明によれば、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを検出することができる。特に、本発明の一態様においては、特定のＳＮＰ（ｓ）を測定することによりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを簡便、迅速、且つ正確に検出できる。また、特に、本発明の一態様においては、ＰＣＲ法とインベーダー法とを組み合わせることによりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルを簡便、迅速、且つ正確に検出できる。また、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルの検出結果を利用して、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１アレルと関連する抗てんかん薬による薬疹リスクを予測することができる。したがって、本発明は、抗てんかん薬の投与の可否を決定するのに有効であり、抗てんかん薬による薬物治療に貢献するものである。
Claims (11)
- ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける１またはそれ以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の存在の有無を判定することを特徴とする、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出方法。
- 配列特異的プライマーＰＣＲ法とインベーダープラス法の組み合わせにより一塩基多型が分析される、請求項１に記載の方法。
- 少なくともrs1059449、rs41541222、rs1059471、rs1059457、およびrs41562315から選択される１またはそれ以上の一塩基多型が分析される、請求項１または２に記載の方法。
- 少なくともrs41562315が分析される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～４のいずれか１項に記載の方法によりＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を検出し、該検出結果に基づいて抗てんかん薬による薬疹リスクを検査することを特徴とする、抗てんかん薬による薬疹リスクの判定方法。
- 前記抗てんかん薬がカルバマゼピンである、請求項５に記載の方法。
- 下記（Ａ）および（Ｂ）を含む配列特異的プライマーセット：
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第１の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第１のプライマー；
（Ｂ）配列番号１に示す塩基配列またはその相補配列におけるＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける第２の一塩基多型を３’末端に有する１０塩基以上の長さの配列を含み、且つ、該一塩基多型をプライマーの３’末端に有する第２のプライマーであって、前記第１のプライマーと対になってＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の前記第１の一塩基多型から前記第２の一塩基多型までを含む領域を増幅するように設計された、プライマー。 - 前記第１の一塩基多型がrs41541222またはrs1059457であり、前記第２の一塩基多型がrs41562315である、請求項７に記載のプライマーセット。
- ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１を特徴づける一塩基多型をインベーダーのターゲットとするインベーダープローブおよびアレルプローブを含むプローブセット。
- 前記一塩基多型がrs1059471またはrs1059457である、請求項９に記載のプローブセット。
- 請求項７または８に記載のプライマーセットおよび請求項９または１０に記載のプローブセットを含む、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１の検出用試薬であって、
前記インベーダーのターゲットである一塩基多型は、前記第１の一塩基多型と前記第２の一塩基多型の間に存在する一塩基多型である、試薬。
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