JP2002233379A

JP2002233379A - 核酸の増幅方法

Info

Publication number: JP2002233379A
Application number: JP2001031859A
Authority: JP
Inventors: Takashi Uemori; 隆司上森; Osamu Takeda; 理武田; Junko Yamamoto; 純子山本; Hiroyuki Mukai; 博之向井; Kiyozou Asada; 起代蔵浅田; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Holdings Inc
Current assignee: Takara Holdings Inc
Priority date: 2001-02-08
Filing date: 2001-02-08
Publication date: 2002-08-20

Abstract

(57)【要約】【課題】オリゴヌクレオチドプライマーの存在下に鎖
置換型ＤＮＡ合成反応を行なうことを特徴とする簡便
で、効率の良い核酸の増幅方法を提供すること。【解決手段】鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存
在下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマー
により目的とする領域のＤＮＡを増幅する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学分野に
おいて有用なＤＮＡの合成方法に関し、鋳型となる核酸
の増幅方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの
合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレ
オチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほと
んどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により
実施されている。例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション法（ＰＣＲ法）があるが、それは米国特許番
号第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号お
よび第４，８００，１５９号に詳細に記述されている。
もう一つの例としては、トレンズインバイオテクノ
ロジー（Trends in Biotechnology １０、ｐ１４６―
ｐ１５２、１９９２）に記載の当該方法と逆転写酵素反
応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙
げられる。上記の方法の開発により、ＤＮＡから、若し
くはＲＮＡから目的とする領域を増幅することが可能に
なった。

【０００３】これらのＤＮＡ合成方法は、目的とするＤ
ＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡ
の一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプラ
イマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成
（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしく
は、“シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白
質核酸酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜
４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ
反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステッ
プを同一温度で行なう２ステップ反応により実施され
る。

【０００４】さらに別法としては、欧州特許出願公開第
３２０，３０８号に記述されているリガーゼ・チェイン
・リアクション（ＬＣＲ）法が挙げられる。上記３法
は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生す
るために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要が
ある。このように温度によって反応が制約されるため、
反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要があ
る。

【０００５】従って、上記の方法には広い温度範囲で、
かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高
価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。
また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうた
め設定温度にするために要する時間が必要であり、その
ロス時間はサイクル数に比例して増大していく。

【０００６】そこで、上記問題点を解決すべく等温状態
で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、日本国
特許番号第２０７６０９６号あるいは第２０８７４８７
号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；strand displacemen
t amplification）法、自立複製（３ＳＲ；self-sustai
ned sequence replication）法、日本国特許番号第２６
５０１５９号に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；nucl
eic acid sequencebased amplification）法、ＴＭＡ(t
ranscription-mediated amplification)法、日本国特許
番号第２７１０１５９号に記載のＱベータレプリカーゼ
法、さらに米国特許番号第５８２４５１７号、国際公開
パンフレット第９９／０９２１１号あるいは国際公開パ
ンフレット第９５／２５１８０号あるいは、国際公開第
９９／４９０８１号等に記載の種々の改良ＳＤＡ法が挙
げられる。米国特許番号第５，９１６，７７７号には、
等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記
載されている。これらの等温核酸増幅法又はオリゴヌク
レオチド合成方法の反応においては、プライマーの伸長
や、一本鎖伸長生成物（又は元の標的配列）へのプライ
マーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長
は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こ
る。

【０００７】これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤ
ＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリ
メラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置
換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）
の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライ
マーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要が
ある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質とし
て、修飾されたデオキシヌクレオチド３リン酸、例えば
３リン酸の中α位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子
（Ｓ）に置換されたデオキシヌクレオチド３リン酸を大
量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう
遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻
な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたＤ
ＮＡ断片中に修飾ヌクレオチド、たとえばαＳ置換デオ
キシヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のＤ
ＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；restriction en
zyme fragment length polymorphism）解析に供しよう
とする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことが
ある。

【０００８】また、米国特許番号第５，８２４，５１７
号記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成さ
れ、少なくとも３’末端がＤＮＡであるキメラプライマ
ーを必要とする。また、国際公開パンフレット第９９／
０９２１１号に記載の改良ＳＤＡ法は、３’突出末端を
生じさせる制限酵素が必要である。さらに、国際公開パ
ンフレット第９５／２５１８０号に記載の改良ＳＤＡ法
は、少なくとも２組のプライマー対を必要とする。さら
に、国際公開パンフレット第９９／４９０８１号に記載
の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少な
くとも１種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸
を必要とする。一方、米国特許番号第５，９１６、７７
７号は、オリゴヌクレオチドを合成するために、３'末
端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使用してＤ
ＮＡを合成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼにより
プライマー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニック
をいれて分離させ、テンプレートを消化し、さらにプラ
イマーを回収して再利用するというものである。該方法
では、プライマーを再利用する際には反応系よりプライ
マーを分離した上で鋳型を再度アニーリングさせる必要
がある。また、国際公開パンフレット第００／２８０８
２号に記載のＬＡＭＰ法は、増幅に４種類のプライマー
を必要とし、また、増幅産物は増幅の標的とされた領域
が繰り返された、サイズの一定しないＤＮＡである。

【０００９】上記のように従来の等温核酸増幅法は、ま
だまだ種々の問題をかかえており、低ランニングコスト
で、かつ結果的に得られたＤＮＡ断片をさらに遺伝子工
学的な処理に使用することが可能な核酸の増幅方法が求
められていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、オリ
ゴヌクレオチドプライマーの存在下に鎖置換型ＤＮＡ合
成反応を行なうことを特徴とする簡便で、効率の良い核
酸の増幅方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ存在下、少
なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーにより目
的とする領域のＤＮＡを増幅する方法を見出し、優れた
遺伝子増幅反応系を構築し、本発明を完成するに至っ
た。

【００１２】即ち、本発明の第１の発明は、核酸を増幅
するための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸の鎖を少なくとも１種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラー
ゼにより処理して、該核酸の鎖に相補的なプライマーの
伸長生成物を合成し、ここで前記プライマーは、鋳型と
なる核酸の塩基配列に実質的に相補的であって；（ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸に上記（ａ）で使
用されたプライマーと同じ塩基配列を有する、新たに伸
長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがア
ニーリングし；そして（ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸の鎖置換を行い、再生さ
れたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の工程
に再度利用される；ことを含んでなる核酸の増幅方法に
関する。

【００１３】本発明の第２の発明は、核酸を増幅するた
めの方法であって、（ａ）鋳型となる核酸の鎖を２種類のオリゴヌクレオチ
ドプライマーのうちの１種のプライマー及び鎖置換型Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより処理して、該核酸の鎖に相補的
なプライマーの伸長生成物を合成し、ここで前記プライ
マーは、鋳型となる核酸に実質的に相補的であって；（ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸に上記（ａ）で使
用されたプライマーと同じ塩基配列を有する、新たに伸
長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがア
ニーリングし；（ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸の鎖置換を行い、再生さ
れたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の工程
に再度利用され、；（ｄ）上記工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型として
（ａ）で使用されたプライマーと異なる種類のオリゴヌ
クレオチドプライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ
により処理して、置換鎖に相補的なプライマーの伸長生
成物を合成し、ここで前記プライマーは、置換鎖に実質
的に相補的であって；（ｅ）上記工程で得られる２本鎖核酸に上記（ｄ）で使
用されたプライマーと同じ塩基配列を有する、新たに伸
長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがア
ニーリングし；そして（ｆ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸の鎖置換を行い、再生さ
れたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｅ）の工程
に再度利用される；ことを含んでなる核酸の増幅方法に
関する。

【００１４】本発明の第１の発明及び第２の発明におい
て、鋳型となる核酸はＤＮＡ配列であってもよい。ま
た、２本鎖ＤＮＡを２種類の相補的な１本鎖ＤＮＡに変
性する前処理をしたものを鋳型として用いてもよい。さ
らに、変性処理しない２本鎖ＤＮＡを鋳型となる核酸と
して用いてもよい。本発明においては、反応は等温で行
ってもよい。さらに、本発明の方法において、工程
（ａ）の前にＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素による逆
転写反応により１本鎖のｃＤＮＡを調製する工程を含
み、該１本鎖のｃＤＮＡを鋳型となる核酸として用いて
もよい。この場合、逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイ
ルス由来のＡＭＶＲＴａｓｅ，モロニーネズミ白血病
ウイルス由来のＭＭＬＶＲＴａｓｅ、モロニーネズミ
白血病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活
性の欠失した変異体であるSuperscript II ^TM及びラウス
関連ウイルス２由来のＲＡＶ−２ＲＴａｓｅからなる
群から選択されることが好ましい。また逆転写酵素は、
耐熱性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼであっても
よく、特に限定はされないが例えば、バチルスステア
ロサーモフィラス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠
損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、もしくは、バチルス
カルドテナックス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠
損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択され
るＤＮＡポリメラーゼであってもよい。

【００１５】本発明の第３の発明は、核酸を増幅するた
めの方法であって、（ａ）デオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有す
るＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも１種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを鋳型となる核酸と混合する工
程、ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列
に実質的に相補的であり；及び（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物
を反応開始から反応終了まで実質的に等温でインキュベ
ートする工程、を包含し、鋳型となる核酸の相補鎖を２
コピー以上生成させることを特徴とする核酸の増幅方法
に関する。

【００１６】本発明の第３の発明において、プライマー
からの伸長は、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼに
より行われることが好ましく、該ＤＮＡポリメラーゼと
しては、特に限定はされないが例えば、大腸菌由来のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルスステア
ロサーモフィラス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠
損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルスカルドテ
ナックス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ
ポリメラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメラ
ーゼであることが好ましい。また本発明の第３の発明に
おいて、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相
同なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施しても
よい。さらに、鋳型となる核酸が、１本鎖ＤＮＡ、２本
鎖ＤＮＡ由来のそれぞれの１本鎖、またはＲＮＡから逆
転写反応によって得られたｃＤＮＡからなる群より選択
される核酸であってもよい。該核酸は、変性処理をしな
い２本鎖ＤＮＡであってもよい。

【００１７】

【発明の実施の形態】本明細書においてデオキシリボヌ
クレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、
糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレ
オチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シ
トシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。
さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデ
オキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチ
ドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記の
デオキシリボヌクレオチドに包含される。

【００１８】本明細書においてリボヌクレオチド（本明
細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボー
スで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分に
アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するもの
が挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾
リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の
酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド
［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載
する］やこの他の誘導体等も含まれる。

【００１９】本明細書においてキメラオリゴヌクレオチ
ドプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリ
ボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。該
プライマーはデオキシリボヌクレオチドアナログおよび
／または修飾リボヌクレオチドを含有していてもよい。

【００２０】本明細書において３’末端側とは、核酸、
例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にか
けての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸におい
てその中央より５’末端にかけての部分を指す。

【００２１】本明細書においてＤＮＡポリメラーゼと
は、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵
素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前
記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素とし
ては、例えば鎖置換(Strand displacement)活性を有す
るＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活
性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラ
ーゼが挙げられる。

【００２２】本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳
型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ
鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングして
いる相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（strand displac
ement）することができる活性のことをいう。また、本
明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列か
ら遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。

【００２３】以下、本発明を詳細に説明する。（１）本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマー本発明の方法において、使用されるオリゴヌクレオチド
プライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列
を有し、その３'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が可能であれ
ば良い。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」と
は、使用される反応条件、例えばストリンジェントな条
件において鋳型となるＤＮＡにアニーリングし、続くＤ
ＮＡ伸長反応が可能な塩基配列を意味する。このような
オリゴヌクレオチドプライマーの設計は、当業者に公知
であり、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ（宝酒造、第１
３頁〜第１６頁、１９９６年）を参考に設計する事がで
きる。また、市販のプライマー構築ソフト、例えば、OL
IGO^TM Primer Analysis software（宝酒造社製）を使用
することができる。

【００２４】本発明の方法において使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に
実質的に相補的な塩基配列を有し、その３’末端よりＤ
ＮＡ鎖の伸長が可能であるオリゴヌクレオチドプライマ
ーであればよく、その３’末端又は３’末端側にリボヌ
クレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプラ
イマーであってもよい。当該プライマーは通常、増幅し
ようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しよ
うとする領域に対応する塩基配列の３’側部分に相補的
に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配
列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮ
Ａにアニーリング可能な塩基配列を意味する。

【００２５】本発明の方法において使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーとしては、特に限定されるもので
はないが、例えばデオキシリボヌクレオチド又はリボヌ
クレオチドで構成されたものが好適に使用できる。さら
に、１以上の修飾リボヌクレオチドあるいは修飾デオキ
シリボヌクレオチドを含有するものであってもよい。す
なわち、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーには、
当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌク
レオチドあるいはデオキシリボヌクレオチド、又は修飾
リボヌクレオチドあるいはデオキシリボヌクレオチドを
使用することができ、さらにこれらを組合せて使用する
ことができる。このような修飾リボヌクレオチドとして
は、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基
に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）
リボヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキ
シ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。この
ような修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオ
チドプライマーは、例えば、米国特許番号第５，００
３，０９７号記載の硫化反応試薬（グレンリサーチ社
製）を用いた方法で調製した（α−Ｓ）リボヌクレオチ
ド３リン酸、あるいは２−ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＣＥホス
ホアミダイド試薬（グレンリサーチ社製）を用いて作製
することができる。

【００２６】本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、増幅後のＤＮＡ断片を一本鎖もしくは
二本鎖のいずれの形態で得たいかによって１種類もしく
は２種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖
ＤＮＡが望まれる場合には１種類のオリゴヌクレオチド
プライマーを、また、二本鎖が望まれる場合には２種類
の該プライマーが使用される。

【００２７】本発明の方法において使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーは、特に限定するものではない
が、約１１ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長
さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１５ヌクレ
オチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーであ
る。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核
酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補
的な配列であることが好ましい。

【００２８】本発明において特に限定はされないが例え
ば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを
本発明のＤＮＡ合成方法にプライマーとして使用するこ
とができる。一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’ （ａ：１１以上の整数、ｂ：０又は１以上の整数、ｃ：
０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチ
ド及び／又はデオキシリボヌクレオチドアナログ、Ｎ：
未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチ
ド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されて
いてもよい）例えば、上記一般式においてａ＝１１以上でｂ、ｃ＝０
の任意の整数であるオリゴヌクレオチドプライマー、あ
るいはａ＝１１以上の任意の整数で、ｂ＝１、ｃ＝０の
キメラオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ＝２、ｃ＝０
のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ＝３〜５、
ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、さらに
ｂ＝２、ｃ＝０〜５のキメラオリゴヌクレオチドプライ
マー等がいずれも本発明に好適に使用できる。この場
合、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプ
ライマーの３'末端又は３'末端側のリボヌクレオチドの
長さは、好ましくは１ヌクレオチド〜１５ヌクレオチ
ド、さらに好ましくは、１ヌクレオチド〜１０ヌクレオ
チド、特に好ましくは１ヌクレオチド〜５ヌクレオチド
である。また、上記一般式中のｃの数は、特に限定はな
く、本発明の方法に使用できる数を選択すればよい。

【００２９】さらに本発明の方法において使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機
能を失わない範囲で１以上のデオキシリボヌクレオチド
アナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレ
オチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用する
ことができる。該デオキシリボヌクレオチドアナログと
しては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノ
シンヌクレオチドあるいは７−デアザグアニンのような
修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドアナログが
挙げられる。

【００３０】デオキシリボヌクレオチドアナログのプラ
イマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成を抑
制する観点からも有効である。さらに、同様の目的でリ
ボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限
定するものではないが、例えば、（α―Ｓ）リボヌクレ
オチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用でき
る。

【００３１】これらのオリゴヌクレオチドプライマー
は、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド
バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Applied Biosystem In
c.）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホ
アミダイト法により合成できる。また、別法としてリン
酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネ
ート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであ
っても良い。

【００３２】本発明のＤＮＡ合成反応中において、ＤＮ
Ａポリメラーゼで伸長したＤＮＡ鎖を鎖置換（ストラン
ドディスプレイスメント、strand displacement）でき
るように、例えば、３’末端側に１塩基から数塩基のミ
スマッチするような構造を有するものも本発明に使用さ
れるオリゴヌクレオチドプライマーに含まれる。すなわ
ち、鋳型ＤＮＡにアニーリングした、上記の一般式で表
されるオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長
を行って生成した二本鎖ＤＮＡに鎖置換能を有するＤＮ
Ａポリメラーゼを作用させた場合には、新しいオリゴヌ
クレオチドプライマーが相補的な部分にアニーリングす
ることができる。その結果、新しくアニーリングしたプ
ライマーの伸長に従って、鎖置換反応がすすむ。

【００３３】（２）本発明に使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼ本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、前述の鎖置
換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、
バチルスカルドテナックス（Bacillus caldotenax、
以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルスステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus、以下Ｂ．ｓｔ
と称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラ
ーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変
異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤ
ＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメント（クレノウ
断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できる鎖置
換型ＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれ
のものも好適に使用できる。

【００３４】Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である
好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａＤＮＡポリ
メラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレ
アーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、
その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは
遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっ
ても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその
他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加
えたものであっても良く、このような酵素の例として、
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ
ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポ
リメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。

【００３５】さらに、本発明の方法に使用するＤＮＡポ
リメラーゼは、鎖置換型増幅反応を行う際に、２本鎖Ｄ
ＮＡに新たに核酸伸長反応に用いられるオリゴヌクレオ
チドプライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部分にアニーリ
ングするような作用を有しているものが好適に使用でき
る。特に限定はないが例えば、ＢｃａＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき
る。また、本発明の方法において鎖置換能を有するＤＮ
Ａポリメラーゼと２本鎖ＤＮＡに新たに核酸伸長反応
に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーが鋳型ＤＮ
Ａの相補的な部分にアニーリングするような作用を有す
る物質の共存下に行われる核酸増幅反応も本発明の方法
に含まれる。

【００３６】（３）本発明に使用される組成物本発明に使用される反応バッファーには、緩衝成分、マ
グネシウム塩やその他の金属塩、ｄＮＴＰを含有するも
のが使用される。また、使用する酵素の金属要求性等に
応じて塩の種類及び濃度を最適化するのは当然のことで
ある。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、ビシ
ン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナト
リウム、リン酸カリウム等）が好適に使用できる。特に
ビシン、トリシン、ヘペス、あるいはリン酸塩を緩衝成
分として含有するバッファーが本発明に好適である。特
に限定はされないが、例えば、反応温度が高い場合は、
温度変化によるｐＨの変化が少ないビシン緩衝液が好ま
しく、また使用するＤＮＡポリメラーゼの種類によって
はヘペス緩衝液が好ましい場合がある。従って、反応温
度、使用するＤＮＡポリメラーゼ等によって、最適な緩
衝液を選択すればよい。該緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ
〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは２０ｍＭ〜５０ｍ
Ｍの範囲であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好まし
くはｐＨ７．０〜９．２の範囲のものが使用される。例
えば、２２ｍＭ〜４６ｍＭのトリシンを含有するｐＨ
７．５〜９．２のバッファー、あるいは２５ｍＭ〜５０
ｍＭのリン酸カリウムを含有するｐＨ７．０〜８．０の
バッファーが好適に使用できる。また、マグネシウム塩
としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウ
ム、酢酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムが好適
に使用でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍ
Ｍ、特に好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。ま
た、ＤＮＡ伸長反応の基質となるｄＮＴＰｓ（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃
度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、特に好ましく
は０．２ｍＭ〜１．２ｍＭの範囲である。使用するプラ
イマーの量は、反応液量５０μｌ当たり１ｐｍｏｌ〜１
０００ｐｍｏｌの範囲であり、特に１０ｐｍｏｌ〜１５
０ｐｍｏｌの範囲が好ましい。さらに、反応液中には増
幅反応の安定化等を目的とした添加物を共存させること
ができ、それぞれ最終濃度として０．１％以下のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％以下のジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）、４ｍＭ以下のプトレスシン２塩酸
塩あるいは０．０１％以下のプロピレンジアミンを添加
してもよい。この他、ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロロ
リジノン）、グリセロール、ポリエチレングリコール、
ジメチルスルホキシドおよび／またはホルムアミドを含
んでもよく、これらの有機溶媒の添加により、オリゴヌ
クレオチドプライマーの非特異的なアニーリングが軽減
されることが期待される。

【００３７】さらに、ＤＮＡポリメラーゼが有している
逆転写活性を阻害するような物質、例えばホスホノギ酸
（ＰＦＡ、phosphonoformic acid）を添加して本発明の
方法を実施してもよい。逆転写活性を阻害する物質を添
加した場合には、標的核酸以外の非特異的な産物の増幅
が低減される。

【００３８】さらにオリゴヌクレオチドプライマーの非
特異的なアニーリングを軽減させる別の態様としては、
本発明の検出方法、増幅方法あるいは製造方法におい
て、増幅反応に先立って、鋳型となる核酸と本発明で使
用されるオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング
処理を行ってもよい。該処理はアニーリングを増強する
物質、例えばスペルミン、スペルミジン等のポリアミン
類やプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液を
使用して実施することが好ましい。上記のポリアミン類
を含有するアニーリング溶液としては塩を含有するもの
が好適に使用でき、特に限定するものではないが、例え
ば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢
酸ナトリウム等とポリアミン類とを含有するアニーリン
グ溶液が挙げられる。

【００３９】アニーリング処理は、通常、プライマー、
鋳型となる核酸を含有する上記のアニーリング溶液を、
２本鎖核酸が変性する温度、例えば、９０℃以上で保持
した後、本発明の方法に使用される反応温度以下まで冷
却して実施される。

【００４０】アニーリング処理の工程の後、上記混合液
にさらに必要な他の成分、例えばＤＮＡポリメラーゼ、
ｄＮＴＰ等を添加して本発明の核酸増幅反応が開始され
る。

【００４１】本発明に使用される組成物には、さらに、
国際公開パンフレット第９９／５４４５５号に記載の酸
性物質あるいは陽イオン錯体を共存させても良い。さら
に、２本鎖ＤＮＡに新たに核酸伸長反応に用いられるオ
リゴヌクレオチドプライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部
分にアニーリングするような作用を有する物質を含んで
も良い。前述の酵素については、種類によって好適に使
用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その
際は、増幅産物量が最大になるように該組成物の組成比
及び使用酵素ユニット数を調整すればよい。いずれの場
合においても、使用する酵素の種類にあわせて、組成物
の組成を至適化するのは、当然のことである。

【００４２】（４）本発明の核酸配列の増幅方法本発明の方法は、上記（１）に示されたオリゴヌクレオ
チドプライマーを少なくとも１種類使用し、さらに
（２）に示された鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを組合わ
せて実施することができる。当該方法では、伸長反応の
基質となるヌクレオチド３リン酸としてＰＣＲ法等に使
われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。当該ｄＮＴ
Ｐは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限り
においては、ｄＮＴＰのアナログ、たとえば７−デアザ
−ｄＧＴＰ等を含んでいてもよい。また、当該方法で
は、オリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該
プライマーは、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の
合成方法と同様に調製することができる。さらに、本発
明の方法においては、オリゴヌクレオチドプライマーと
キメラオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて使
用することもできる。

【００４３】本発明の方法において鋳型となる核酸、す
なわちＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、合成ＲＮＡのい
ずれであってもよく、当該核酸を含む可能性のあるあら
ゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さ
らに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用し
てもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はな
いが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞
便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リ
ンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物
及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイ
ド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のよう
な核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混
入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物
学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有
する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等
を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有
調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞
破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核
酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富
化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中
に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいは
ＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。

【００４４】これら材料からの核酸含有調製物の調製に
は特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処
理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレ
ンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの
例においては、さらに操作を加えて核酸を精製すること
が有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在する
とき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール
抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動
または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施され
る。

【００４５】ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅した
い場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によっ
て合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施
すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮ
Ａには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能
なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの
他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、
あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。

【００４６】上記の逆転写反応に使用されるプライマー
は、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニール
するものであれば特に限定されるものではない。該プラ
イマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有す
るプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ
（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有す
るプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。
逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを
行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、
更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌク
レオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオ
チド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下
である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後
のｃＤＮＡを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に
鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能なオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用することができる。この
ようなプライマーは、上記（１）に記載された性質を有
し、かつＲＮＡからの逆転写反応に使用できるものであ
れば特に限定はない。

【００４７】上記の逆転写反応に使用される酵素として
は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するもの
であれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイル
ス由来逆転写酵素（ＡＭＶＲＴａｓｅ）、モロニーネ
ズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶＲＴａ
ｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２
ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられ
る。このほか、逆転写活性を併せ持つ鎖置換型ＤＮＡポ
リメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目
的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適で
あり、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメ
ラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好
熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好まし
く、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｓｔＤＮＡ
ポリメラーゼ）、さらにＢｃａＤＮＡポリメラーゼが
好ましい。例えば、ＢｃａＤＮＡポリメラーゼは、逆
転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条
件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮ
Ａを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有
する酵素も、当該活性を有している範囲において天然
体、変異体のいずれもが使用できる。

【００４８】また、別の態様としては、増幅しようとす
る塩基配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡをあらかじめ複
製した後、本発明の方法の鋳型となる核酸として用いて
もよい。該複製の方法としては、特に限定はされない
が、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入し
たベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた
形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列
を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する
方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複
製されるものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ
系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド
系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、
宿主は、使用されるベクターを保持することができるも
のであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸
菌等が例示される。

【００４９】さらに、上記複製方法の別態様としては、
増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型として
ＲＮＡポリメラーゼで該塩基配列を有するＲＮＡを転写
した後、該ＲＮＡをそのまま、あるいは逆転写反応によ
りｃＤＮＡとして本発明の方法の鋳型に用いてもよい。
上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片はＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に
限定はなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にＲ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプタ
ーあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよ
いし、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有する
プライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したもの
であってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩
基配列を含む核酸断片を、上記のように配置されたＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、ＲＮＡの
形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであ
れば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系の
いずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環
状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好
適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用い
られるＲＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、
ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
あるいはＴ３ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に使用でき
る。

【００５０】上記方法により単離したゲノムＤＮＡや核
酸増幅断片のような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若し
くはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのよ
うな一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明において鋳型ＤＮ
Ａとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの場合
は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）を行
わずに本発明の方法に使用することもできる。

【００５１】また、ＲＮＡ由来の配列を有する核酸の増
幅を目的とする場合には、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反
応によって得られたＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸から１
本鎖ｃＤＮＡを調製して用いることにより増幅反応を開
始することができる。さらに、本発明のＤＮＡの合成方
法に逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有するＤＮＡポリ
メラーゼを使用することにより、ＲＮＡを鋳型とした逆
転写反応と、当該反応によって生成したｃＤＮＡを鋳型
にしたＤＮＡ増幅反応とを１種類のＤＮＡポリメラーゼ
で行なうことができる。

【００５２】上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中
に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少
なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列
の十分な結合を提供するようなものがよい。

【００５３】本発明の方法では、特に限定するものでは
ないが、鋳型ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合にはそれらを
変性して一本鎖にすることにより鋳型ＤＮＡ鎖へのプラ
イマーの結合を可能にさせることもできる。二本鎖ＤＮ
Ａが変性する温度、例えば約９５℃で保持することは好
ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、
オリゴヌクレオチドプライマーを標的物に結合させるた
めには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要がある。上
記のような二本鎖を一本鎖ＤＮＡに変性する工程、もし
くは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡ
（一本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後、等温条件下にお
いて、連続的に核酸が増幅される。ここで、「連続的
に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応
が進行していることを意味する。また、本明細書におい
て「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程におい
て機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味す
る。

【００５４】本発明の核酸増幅反応は、例えば、クレノ
ウ断片のような常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用するこ
とにより常温（例えば３７℃）でも実施できるが、耐熱
性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して高温、例えば
５０℃以上で、さらに例えば６０℃以上で実施すること
ができる。この場合、プライマーの非特異的なアニーリ
ングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳
型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリ
メラーゼの伸長性も向上する。さらに該方法において
は、逆転写反応および核酸の増幅を連続して行なう態様
も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、
あるいは逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用
して、ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡを増幅すること
ができる。

【００５５】本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交
換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に
使用でき、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を欠失したＢｃａＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が
特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴＤ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されてお
り、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Escheric
hia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭＢＰ−
３７２０）より日本特許第２９７８００１号に記載の方
法によって調製することもできる。

【００５６】本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
は、プライマー部分の３’末端から下流への伸長鎖合成
に伴い、先に伸長されたＤＮＡ鎖の置換を行う必要があ
る。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことであ
る。このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌由来
のＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異
体であるクレノウ断片、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ由
来の同様の断片（ニューイングランドバイオラブス社
製）、Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．
０およびシークエネース２．０（米国バイオケミカル
社）、ジーン（Gene）第９７巻、１３〜１９頁（１９９
１）記載のＴ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９ＤＮ
Ａポリメラーゼも使用することができる。通常は５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであ
っても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害する
ことが可能な場合は、本発明のＤＮＡ合成方法に使用で
きる。

【００５７】本発明の核酸の増幅方法は、実質的に等温
の範囲で実施する事ができる。すなわち本発明において
等温とは、各工程の反応温度を大きく変化させず、各工
程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。こ
の場合において、最適の反応条件となるように温度を設
定するのは当然である。

【００５８】本発明の核酸の増幅方法の１つの特徴とし
ては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要
がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸の合成
方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上
下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があ
り、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置
を必要とするが、本発明の方法においては一定温度を保
持できる装置のみでも実施することができる。このよう
に、本発明の方法は、単一の温度で実施することができ
る。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリング
が低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的
にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシ
ーのレベルを設定して実施される。特に限定するもので
はないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の
方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効
率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の
活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好まし
い。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温
度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約
３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜
約７０℃である。特に高温条件下で反応を行う場合に
は、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマー
を使用することが好ましい。各反応温度に適したプライ
マーの配列及び長さの設定については、例えば、そのＴ
ｍ値を参考にしてもよく、あるいは市販のプライマー設
計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯ^TM ＰｒｉｍｅｒＡｎ
ａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用
してもよい。例えば、本発明の方法において反応温度を
５５℃から６０℃あるいは６５℃に設定した場合、該方
法に使用するプライマーの長さとしては、特に限定する
ものではないが、例えば１２ヌクレオチド〜１００ヌク
レオチドの長さ、好ましくは１４ヌクレオチド〜５０ヌ
クレオチドの長さ、さらに好ましくは１５ヌクレオチド
〜４０ヌクレオチドの長さのプライマーが使用できる。
このように反応温度を上げることの効果としては、鋳型
ＤＮＡの二次構造を解消できることが挙げられ、ＧＣ含
量の高い鋳型核酸を使用した場合にも所望の核酸が増幅
される。また、長鎖長の領域を増幅する場合においても
同様の効果がある。該効果は、約６０ｂｐ〜約２０ｋｂ
ｐの範囲で、さらに約１１０ｂｐ〜約４．３ｋｂｐの範
囲で、特に約１３０ｂｐ〜約１５００ｂｐの範囲で認め
られる。

【００５９】さらに、鋳型となる核酸のＧＣ含量に応じ
て反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができ
る。例えば、鋳型となる核酸としてＧＣ含量の低いもの
を使用する場合には、増幅する鎖長やプライマーのＴｍ
値にもよるが、５０〜５５℃で本発明の増幅反応を行う
ことができる。

【００６０】また、本発明の方法において、逆転写酵素
活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳ
ＴＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃ
ＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来
の核酸の増幅を簡便に実施することができる。また、Ｒ
ＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、そ
の生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方法に鋳型ＤＮＡとし
て使用することもできる。

【００６１】いずれの場合においても、本発明の方法に
おいては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応
温度を低下させて反応を停止させるか、または基質のう
ちのいずれか一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰
り返される。

【００６２】本発明の核酸の増幅方法は、核酸の増幅を
利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、標識、塩
基配列の決定に使用することができる。また、本発明の
核酸の増幅方法は、ｉｎｓｉｔｕ核酸増幅方法、ＤＮ
Ａチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは
多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増
幅方法、変異解析のための点突然変異検出法、多型解析
のための１塩基多型（ＳＮＰ）検出法として使用するこ
とができる。

【００６３】本発明の核酸の増幅方法の別様態として、
一本鎖のＤＮＡを調製することが可能なことが挙げられ
る。この目的のためには、１種のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用する方法のみならず、２種のオリゴヌク
レオチドプライマーを使用する方法を使用することもで
きる。例えば、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる場合は、一方のオリゴヌクレオチドプライマー量
を他方の量に対して過剰にして増幅反応を行なう、いわ
ゆるアシンメトリック（非対称）−ＰＣＲ法において採
用される方法と同様のプライマー比率によって行なうこ
とができる。この結果、一方の鎖を置換した産物の量
が、他方の鎖を置換した産物の量に比べて過剰になる。

【００６４】本発明の核酸の増幅方法によれば実質的に
その相補鎖を含有しない一本鎖のＤＮＡを調製すること
ができ、例えば、ＤＮＡチップのような核酸固定化物を
作製するための一本鎖ＤＮＡ、標的核酸検出のための一
本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法のためのメガ
プライマーを容易にしかも短時間に作製することができ
る。また、本発明の方法を使用することにより、センス
配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増
幅させることが可能である。従って、本発明はセンス配
列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方法と
しても有用である。

【００６５】また、本発明の方法は、ビシン、トリシ
ン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝液中で行うこ
とにより微量の鋳型となる核酸からでも所望の核酸配列
領域を増幅することができる。

【００６６】さらに、本発明の核酸の増幅方法には経時
的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないた
め、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施すること
ができる。したがって、例えば医薬用途等に使用される
核酸の工業的大量製造が可能である。

【００６７】本発明の方法は；（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リ
ン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び少な
くとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを混合し
て反応混合物を調製する工程、ここで該プライマーの一
つは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であ
り；及び（ｂ）反応産物を生成するのに十分な時間、反応混合物
を反応開始から反応終了まで実質的に等温でインキュベ
ートする工程、を包含し、鋳型となる核酸の相補鎖を２
コピー以上生成させることを特徴とする核酸の増幅方法
である。

【００６８】本発明の方法においては、２本鎖又は１本
鎖ＤＮＡ、ＲＮＡからの逆転写反応により得られたｃＤ
ＮＡを鋳型として下記の工程が並行して連続し、繰返し
起こることを特徴としている。

【００６９】［１］鋳型となるＤＮＡが１種もしくは２
種のオリゴヌクレオチドプライマーとアニーリングする
工程。［２］プライマーの３’末端から鎖置換型ＤＮＡポリメ
ラーゼによって、ＤＮＡ伸長反応を行なう工程。［３］２本鎖ＤＮＡに、新しいプライマーが鋳型ＤＮＡ
の相補的な領域にアニーリングする工程。［４］［３］でアニーリングしたオリゴヌクレオチドの
３’末端からＤＮＡ伸長反応を行なう工程。［５］［４］の工程で得られた二本鎖ポリヌクレオチド
を用いて［１］〜［４］の工程を繰り返す工程。

【００７０】すなわち、本発明の第１の形態としては；
一本鎖のＤＮＡを鋳型として、少なくとも１種類のオリ
ゴヌクレオチドプライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて行なう核酸の増幅方法である。本発明の第
２の形態としては；一本鎖のＤＮＡを鋳型として、２種
類のオリゴヌクレオチドプライマー及び鎖置換型ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて行なう核酸の増幅方法である。本
発明の第３の形態としては；二本鎖のＤＮＡを鋳型とし
て、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマー
及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いて行なう核酸の
増幅方法である。本発明の第４の形態としては；二本鎖
のＤＮＡを鋳型として、２種類のオリゴヌクレオチドプ
ライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いて行な
う核酸の増幅方法である。

【００７１】本発明の核酸増幅方法においては、１本鎖
鋳型ＤＮＡに対し、それに相補的なオリゴヌクレオチド
プライマーが結合する。鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの
作用により、該プライマーの３’末端に鋳型となるＤＮ
Ａ鎖に相補的な核酸配列のデオキシヌクレオチドを付加
し、相補鎖を伸長する。次に伸長反応に使用される新た
な上記のプライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部分にアニ
ーリングする。さらに、本発明に使用する鎖置換型ＤＮ
Ａポリメラーゼの有する鎖置換能により、先に合成され
た相補鎖を鋳型ＤＮＡから解離させながら新たにアニー
リングしたプライマーの３’末端からＤＮＡ鎖を再伸長
する。その結果として鋳型となる核酸配列に相補的な置
換鎖を生成する。

【００７２】本発明において、２種類のオリゴヌクレオ
チドプライマーを使う場合においてその１種類が上記置
換鎖に相補的な場合、上記置換鎖を鋳型として上記と同
様な鎖置換反応が並行して進行する。

【００７３】本発明の方法において、「再生されたプラ
イマー伸長鎖」とは、鎖置換により新たに鋳型にアニー
リングしたオリゴヌクレオチドプライマーから伸長した
鋳型となる核酸配列に相補的なＤＮＡ鎖のことを言う。
また、本発明の方法において、「再度利用され」とは、
鋳型となる核酸配列と再生されたプライマー伸長鎖で構
成された２本鎖ＤＮＡを再度鎖置換の工程に利用するこ
とを言う。

【００７４】本発明の方法は、２種のオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いても機能できるため、その場合１種
のオリゴヌクレオチドプライマーは鋳型となる核酸配列
の一方のＤＮＡ鎖に結合し、そして他方のオリゴヌクレ
オチドプライマーは上記の鋳型となる核酸配列に相補的
な核酸配列を有する鎖に結合する。この態様を使用する
と、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機
能できることは明らかである。このようにして、増幅産
物が非直線的に増加していく。さらに、本発明の方法に
おいてオリゴデオキシヌクレオチドが好適に使用できる
が、さらに未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボ
ヌクレオチドと未修飾デオキシヌクレオチド及び／又は
修飾デオキシヌクレオチドで構成されたキメラオリゴヌ
クレオチドプライマーにおいても好適に使用できる。

【００７５】核酸を変性する前または後に、４つのすべ
てのデオキシヌクレオチド３リン酸、ポリメラーゼおよ
びエンドヌクレアーゼからなる混合物を添加する。（高
温により核酸を変性し、高温耐性の酵素を使用しないの
ならば、変性後に酵素を添加することが好ましい。）

【００７６】目的とするＤＮＡ断片の生成および本発明
の方法のための反応成分からなる混合物は、場合により
ＮＭＰ（１−メチルー２―ピロロリジノン）、グリセロ
ール、ポリエチレングリコール、ポリアミン類、ジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／またはホルムアミ
ドを含んでもよい。そのような有機溶媒の含有はオリゴ
ヌクレオチドプライマーの非特異的なアニーリングを軽
減するか、あるいは２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの変
性を促進する助けとなると信じられている。さらに国際
公開パンフレット第９９／５４４５５号記載のような酸
性物質あるいは陽イオン錯体を含んでも良い。

【００７７】この方法に有用な鎖置換型ＤＮＡポリメラ
ーゼは、５’から３’方向に伸長を開始するものを含
む。該ＤＮＡポリメラーゼは新たにアニーリングしたプ
ライマーの下流からの伸長鎖生成に従い、置換もすべき
であり、そして重要なことはあらゆる５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を欠いているべきである。好適な鎖置
換型ＤＮＡポリメラーゼをスクリーニングし、使用する
ことあるいは該ＤＮＡポリメラーゼの効果を高める物質
をスクリーニングして使用することは、本発明の開示の
範囲で行うことができる。このような鎖置換型ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウ断片およびＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌク
レアーゼ欠損クレノウ断片、Ｂｓｔポリメラーゼ由来の
同様の断片（バイオラッド社、リッチモンド、ＣＡ）、
Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ
（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．０お
よびシークエネース２．０（米国バイオケミカル社）、
Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９ＤＮＡポリメ
ラーゼも使用することができる。通常エキソヌクレアー
ゼ活性を有する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼは、適切な
ブロッキング剤（阻害剤）の添加により当該活性がブロ
ックされる場合は、本発明の方法に使用できる。

【００７８】本発明の方法のさらなる特徴は、ＤＮＡ合
成において温度を上げ下げする必要がないこと、即ち等
温での核酸配列の合成方法を提供する点にある。即ち、
本発明の方法においては、変性後に単一の温度を使用す
ることができる。非特異的な結合を最少にするために反
応温度を十分に高く、しかし鋳型となる核酸配列にプラ
イマーが結合する時間を最少にするように反応温度を十
分に低く、ストリンジェンシーのレベルを設定すべきで
ある。さらに、適当な温度により酵素活性を十分に保護
すべきである。このため、該温度は、好ましくは、約２
０℃から約７０℃であり、さらに好ましくは、約３５℃
から約６５℃にするのがよい。

【００７９】本発明のＤＮＡ合成方法において、既に一
本鎖にされている鋳型ＤＮＡに対し、オリゴヌクレオチ
ドプライマーが特異的に結合し、そして鎖置換型ＤＮＡ
ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド３リン酸の存在下
においてオリゴヌクレオチドプライマーから鋳型となる
核酸配列の長さに従い、該プライマー配列を通って伸長
合成される。次に、新たに核酸伸長反応に用いられるオ
リゴヌクレオチドプライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部
分にアニーリングさせるような機能を有する５’→３’
エキソヌクレアーゼ活性を欠く鎖置換型ＤＮＡポリメラ
ーゼの存在下において、新たに伸長反応に使用されるプ
ライマーの３’末端から伸長合成され、鋳型に相補的な
核酸配列を伸長しながら１本鎖ＤＮＡを解離させてい
く。この結果、新しいプライマー伸長鎖が合成される。
２種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合
は、遊離した置換鎖も本発明の方法の鋳型になりうる。

【００８０】本発明の方法を用いて、２本鎖ＤＮＡを鋳
型とし、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（イ及び
ロとする）を使用した場合は、鋳型となる２本鎖ＤＮＡ
あるいは２種類の相補的な１本鎖ＤＮＡ（Ａ鎖及びＢ
鎖）に下記の各工程が連続して起こる。（ａ）上記のＡ鎖１本鎖ＤＮＡを鋳型となる核酸配列と
して少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー
（イ）により処理して、該核酸配列の鎖に相補的なプラ
イマーの伸長生成物を合成し、；（ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸に新たに伸長反応
に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー（イ）がア
ニーリングし、；（ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ａ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｂ）の工程に再度利用され、；（ｄ）上記工程で得られる遊離した置換鎖Ｃ鎖を鋳型と
して（ａ）で使用されたプライマーと異なるプライマー
（ロ）により処理して、Ｃ鎖に相補的なプライマーの伸
長生成物を合成し、；（ｅ）上記工程で得られる２本鎖核酸に新たに伸長反応
に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー（ロ）がア
ニーリングし、；（ｆ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ｃ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｅ）の工程に再度利用され、；（ｇ）上記の鋳型となるもう一方の１本鎖ＤＮＡのＢ鎖
については、Ｂ鎖１本鎖ＤＮＡを鋳型となる核酸配列と
して（ａ）で使用されたオリゴヌクレオチドと異なるプ
ライマー（ロ）により処理して、該核酸配列の鎖に相補
的なプライマーの伸長生成物を合成し、；（ｈ）上記工程で得られる２本鎖核酸に新たに伸長反応
に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー（ロ）がア
ニーリングし、；（ｉ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ｂ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｈ）の工程に再度利用され、；（ｊ）上記工程で得られる遊離した置換鎖Ｄ鎖を鋳型と
して（ｇ）で使用されたプライマーと異なるプライマー
（イ）により処理して、Ｄ鎖に相補的なプライマーの伸
長生成物を合成し、；（ｋ）上記工程で得られる２本鎖核酸に新たに伸長反応
に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー（イ）がア
ニーリングし；そして（ｌ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ｄ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｋ）の工程に再度利用される。

【００８１】本発明の方法を使用することにより、ＤＮ
Ａチップに固定するための１本鎖ＤＮＡ、塩基配列決定
のための一本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法の
ためのメガプライマーを容易にしかも短時間に作製する
ことができる。例えば、本発明の方法を使用することに
より、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみ
を選択して増幅させることが可能である。従って、セン
ス配列あるいはアンチセンス配列製造方法としても有用
である。上記目的のために本発明の方法においては、１
つのオリゴヌクレオチドプライマー、あるいは２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用する場合のいずれの
場合においても作製できるが、例えば、２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いる場合は、一方のオリゴヌ
クレオチドプライマー量を他方の量に対して過剰にして
増幅反応を行なう、いわゆるアシンメトリック（非対
称）−ＰＣＲ法において採用される方法と同様のプライ
マー比率によって行なうことができる。この結果、一方
の鎖を置換した産物の量が、他方の鎖を置換した産物の
量に比べて過剰になる。

【００８２】さらに本発明の方法を用いれば、大容量の
反応を行うことができるため、上記センス鎖またはアン
チセンス鎖のような１本鎖ＤＮＡ、あるいは２本鎖ＤＮ
Ａの工業的大量製造が可能である。

【００８３】そして本発明の方法により得られた増幅物
の存在は、多くのあらゆる方法により検出できる。一つ
の方法は、ゲル電気泳動による特定のサイズの反応産物
の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロ
マイド等の蛍光物質により検出できる。他の方法として
は、ビオチンのような物理的な標識を用いた標識ヌクレ
オチドの使用を含む。そして増幅産物中のビオチンは、
蛍光標識されたアビジンあるいは、ペルオキシダーゼの
ような酵素に結合したアビジンによる検出方法に用いる
ことができる。

【００８４】本発明はさらに、上述の方法により生じた
反応産物の分離法および／または検出法に関する。この
分離法は、磁気的な分離、膜による捕捉および固形支持
体上での捕捉を含む。各方法において、捕捉モイエティ
は磁気ビーズ、膜または固形支持体に結合される。そし
てビーズ、膜または固形支持体について、反応産物の存
在または不在をアッセイできる。捕捉モイエティの例
は、生成された反応産物に相補的な核酸配列およびプラ
イマーまたは反応産物に取り込まれるリセプターに対す
る抗体を含む。分離系は検出系と連動していてもしてい
なくてもよい。

【００８５】本発明の実施において有用である検出系
は、分離を要しない均一な系（ホモジニアスシステム）
および不均一な系（ヘテロジニアスシステム）等が挙げ
られる。各系において、ひとつまたは複数の検出マーカ
ーが使用され、好ましくは自動化された方法により、検
出系からの反応または放射が監視される。均一な系の例
は、蛍光偏光、酵素を介するイムノアッセイ、蛍光エネ
ルギー転移、ハイブリダイゼーション保護（例えばアク
リジニウムルミネッセンス）およびクローン化された酵
素のドナーイムノアッセイを含む。不均一な系の例は、
酵素標識（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼおよびベータ−ガラクトシダーゼ）、蛍光標識
（例えば酵素標識および直接の蛍光標識［例えばフルオ
レセインおよびローダミン］）、ケミルミネッセンスお
よびバイオルミネッセンスを含む。リポソームまたは他
の袋状粒子も染色剤または他の検出可能なマーカーによ
り満たされて、そのような検出系において使用されう
る。これらの系において、検出可能なマーカーは直接ま
たは間接に捕捉モイエティに結合でき、また反応産物
は、リガンドにより認識されうるレセプターの存在下に
おいて生成することができる。

【００８６】本発明の方法では、特定のサーマルサイク
ラーを必要とせず、オリゴヌクレオチドプライマーを１
種類もしくは２種類と従来法より使用数を少なくするこ
とができ、使用する塩基もＰＣＲ等で用いられるものを
流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低く
することができる。そのため、ルーチンワークを行なっ
ている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。

【００８７】本発明において増幅されたＤＮＡ断片は、
通常の塩基により構成されるためＤＮＡ増幅後、増幅断
片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブク
ローニングすることができる。さらにＲＦＬＰのような
制限酵素を用いた処理をすることも問題なくでき、遺伝
子検査の分野においても広く利用できる。また、本発明
において増幅されたＤＮＡ断片は、通常の塩基により構
成されるため、増幅断片中にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を組込んでおけば、増幅断片から直接ＲＮ
Ａを合成することができ、それは、ＲＮＡプローブとし
て使用可能である。

【００８８】さらに、本発明においては、通常の塩基の
代わりに蛍光標識された塩基を使用することができ、容
易に蛍光標識されたＤＮＡプローブを作製することがで
きる。

【００８９】本発明の方法により増幅された１本鎖ＤＮ
Ａは、ＤＮＡチップ上に固定するＤＮＡ断片として好適
に使用できる。即ち、本発明の方法は、ＤＮＡチップ作
製において固定化するＤＮＡ鎖を調製する方法として好
適に使用できる。

【００９０】

【実施例】本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例によって限定されるもので
はない。

【００９１】実施例１本発明の増幅方法について種々のプライマーを用いて検
討した。本実施例以降に用いられるプライマーは、配列
表の配列番号をもとにＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社）を用い
て合成した。また、鋳型としてｐＵＣ１９プラスミドＤ
ＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化したものを使用し
た。使用するプライマーの組み合わせを表１に示す。す
なわち、配列表の配列番号１及び２はｐＵＣ１９ｕｐｐ
ｅｒ１５０及びｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒプライマーの組み
合わせ、配列表の配列番号３及び４はｐＵＣ１９ｕｐｐ
ｅｒ１５０（Ｎ）及びｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒ（Ｎ）プラ
イマーの組み合わせ、配列表の配列番号５及び６はｐＵ
Ｃ１９ｕｐｐｅｒ１５０（Ｎ２）及びｐＵＣ１９ｌｏｗ
ｅｒ（Ｎ２）プライマーの組み合わせ、配列表の配列番
号７及び８はｐＵＣ１９ｕｐｐｅｒ１５０（Ｎ３）及び
ｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒ（Ｎ３）プライマーの組み合わせ
である。

【００９２】

【表１】

【００９３】さらに反応液組成を以下に示す。；２７ｍ
Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．３）、０．０
１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ＤＭＳＯ、
各１ｍＭｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、それぞれ６０ｐｍｏｌの上記のプライマー対及び１
ｎｇの鋳型ＤＮＡ、及び滅菌蒸留水で反応液容量を４８
μｌにした。

【００９４】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、２２ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、９０℃、２分間加熱し
て酵素を失活させた。各反応液５μｌを４％ヌシーブ
３：１アガロースゲル（宝酒造社製）にて電気泳動を
行なった。

【００９５】その結果、上記のいずれのプライマー対に
おいても、目的の約１５０ｂｐの増幅断片が得られるこ
とが確認できた。

【００９６】実施例２本発明の増幅方法について種々のプライマーを用いて検
討した。ｐＵＣ１９ベクターＤＮＡを鋳型とし、配列表
の配列番号１及び２に示される塩基配列を有し、その全
体がすべてデオキシリボヌクレオチドで構築されたプラ
イマーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、
ＰＣＲ）によって得られたフラグメントをｐＵＣ１９ベ
クターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングして得られ
た該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで消化したも
のを鋳型として使用した。使用するプライマーの組み合
わせを表２に示す。すなわち、配列表の配列番号９及び
１０はＭ１３−Ｍ４及びＭ１３−ＲＶプライマーの組み
合わせ、配列表の配列番号１１及び１２はＭ１３−Ｍ４
（Ｎ２）及びＭ１３−ＲＶ（Ｎ２）プライマーの組み合
わせ、配列表の配列番号１３及び１４はＭ１３−Ｍ４
（Ｎ３）及びＭ１３−ＲＶ（Ｎ３）プライマーの組み合
わせ、配列表の配列番号１５及び１６はＭ１３−２０
（Ｎ２）及びＲＶ―Ｐプライマー（Ｎ２）の組み合わ
せ、配列表の配列番号１７及び１８はＭ１３−２０（Ｎ
３）及びＲＶ―Ｐプライマー（Ｎ３）の組み合わせであ
る。

【００９７】

【表２】

【００９８】さらに反応液組成を以下に示す。；反応液
１として、それぞれ３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対
及び２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、及び滅菌蒸留水で反応液容
量を５μｌにした。反応液２として、２８ｍＭリン酸
カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、０．０１％ＢＳ
Ａ（牛血清アルブミン）、１％ＤＭＳＯ、各０．５ｍ
ＭｄＮＴＰ混合物、４ｍＭ酢酸マグネシウム、５．
５ＵのＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ、および滅
菌蒸留水で反応液容量を２０μｌにした。

【００９９】上記反応液１を９８℃、２分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、反応液２を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、４℃に冷却し、０．５
ＭＥＤＴＡを２．５μｌ加えて反応を停止した。各反応
液５μｌを４％ヌシーブ３：１アガロースゲルにて電
気泳動を行なった。

【０１００】その結果、プライマー対１、２及び３で
は、目的の約２７０ｂｐの増幅断片が、プライマー対４
及び５では、約２６０ｂｐの増幅断片が得られることが
確認できた。

【０１０１】実施例３本発明の増幅方法について種々の鋳型を用いて検討し
た。鋳型は、ｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡ（宝酒造社
製）をＨｉｎｃＩＩ（宝酒造社製）で制限酵素消化した
ものを使用した。；プライマーは、ｐＵＣ１９ｕｐｐｅ
ｒ１５０プライマー及びｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒプライマ
ーを使用した。

【０１０２】反応液組成を以下に示す。；３２．７ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．８）、１０
２ｍＭ酢酸カリウム、０．００２％プロピレンジアミ
ン、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アル
ブミン）、４．１ｍＭ酢酸マグネシウム、各５１０μ
ＭｄＮＴＰ混合物、各プライマー３０ｐｍｏｌ、鋳型
ＤＮＡ 1ｎｇ、及び滅菌蒸留水で反応液量を２４．５
μｌにした。同時に鋳型ＤＮＡを添加しない反応液も作
製した。

【０１０３】上記反応液を９８℃、２分間熱変性処理
後、氷上で冷却した。次に１１ＵのＢｃａＢＥＳＴＤ
ＮＡポリメラーゼを添加し、５５℃、６０分間保持し
た。その後４℃に冷却した。各反応液１μｌを３％ヌ
シーブ３：１アガロースゲルにて電気泳動を行なっ
た。その結果、上記いずれの鋳型においても、目的の１
５０ｂｐの増幅断片が得られる事を確認した。鋳型ＤＮ
Ａを添加しなかった反応液からは、１５０ｂｐの増幅産
物は確認されなかった。

【０１０４】実施例４本発明の増幅方法についてプライマーと鋳型を変えて検
討した。鋳型は、以下のようにして調製した。すなわ
ち、ｒａｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｈａ
−ｒａｓ／１２（宝酒造社製）及びｒａｓＭｕｔａｎ
ｔＳｅｔのｃ−Ｈａ−ｒａｓｃｏｄｏｎ１２Ｓｅ
ｒ変異体（宝酒造社製）の組み合わせ、ｒａｓＧｅｎ
ｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｈａ−ｒａｓ／６１
（宝酒造社製）及びｒａｓＭｕｔａｎｔＳｅｔのｃ
−Ｈａ−ｒａｓｃｏｄｏｎ６１野生型（宝酒造社製）
の組み合わせ、ｒａｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅ
ｔｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２（宝酒造社製）及びｒａｓ
ＭｕｔａｎｔＳｅｔのｃ−Ｋｉ−ｒａｓｃｏｄｏｎ
１２Ａｓｐ変異体（宝酒造社製）の組み合わせ、ｒａ
ｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｋｉ−ｒａ
ｓ／６１（宝酒造社製）及びｒａｓＭｕｔａｎｔＳ
ｅｔのｃ−Ｋｉ−ｒａｓｃｏｄｏｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡ
Ｃ）変異体（宝酒造社製）の組み合わせ、ｒａｓＧｅ
ｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔＮ−ｒａｓ／１２（宝酒
造社製）及びｒａｓＭｕｔａｎｔＳｅｔのＮ−ｒａ
ｓｃｏｄｏｎ１２野生型（宝酒造社製）の組み合わ
せ、ｒａｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔＮ−ｒ
ａｓ／６１（宝酒造社製）及びｒａｓＭｕｔａｎｔ
ＳｅｔのＮ−ｒａｓｃｏｄｏｎ６１Ｈｉｓ（ＣＡ
Ｃ）変異体（宝酒造社製）の組み合わせでＰＣＲを行
い、得られた増幅断片をＴａＫａＲａＢＫＬキット
（宝酒造社製）で平滑末端化、リン酸化処理した。処理
後の各ＰＣＲ増幅断片は、ｐＵＣ１１８ベクターのＨｉ
ｎｃＩＩサイトにクローニングし、得られた該プラスミ
ドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩ消化したものを本実施例の
鋳型として使用した。また、ｒａｓＧｅｎｅＰｒｉ
ｍｅｒＳｅｔｃ−Ｈａ−ｒａｓ／１２、ｒａｓＧ
ｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｈａ−ｒａｓ／６
１、ｒａｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｋ
ｉ−ｒａｓ／１２、ｒａｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒ
Ｓｅｔｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／６１、ｒａｓＧｅｎｅ
ＰｒｉｍｅｒＳｅｔＮ−ｒａｓ／１２、及び、ｒａ
ｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔＮ−ｒａｓ／６
１の各プライマー対をそれぞれの目的配列を含む鋳型に
対して使用した。

【０１０５】反応液組成を以下に示す。；反応液１とし
て、それぞれ３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対及び１
ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．０１％プロピレンジアミン及
び滅菌蒸留水で反応液容量を５μｌにした。反応液２と
して、４０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ
７．８）、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、
１％ＤＭＳＯ、各０．５ｍＭｄＮＴＰ混合物、５ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴＤＮＡ
ポリメラーゼ、および滅菌蒸留水で反応液容量を２０μ
ｌにした。

【０１０６】上記反応液１を９８℃、２分間熱変性処理
後、氷上にて冷却した。次に、反応液２を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、４℃に冷却した。反応
液１μｌを３％ヌシーブ３：１アガロースゲルにて
電気泳動を行なった。その結果、どのプライマー対を使
用した反応においても、目的サイズの増幅産物が得られ
る事を確認できた。

【０１０７】実施例５本発明の増幅方法について、鋳型にゲノムを用いた場合
について検討した。鋳型として、ＨＬ―６０細胞（大日
本製薬社製）由来のゲノムＤＮＡを用いた。プライマー
は、市販のｒａｓＧｅｎｅＰｒｉｍｅｒＳｅｔ
ｃ−Ｈａ−ｒａｓ／６１及び、ｒａｓＧｅｎｅＰｒ
ｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２のプライマ
ー対を使用した。

【０１０８】反応液組成を以下に示す。；反応液１とし
て、それぞれ３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対及び５
００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、０．０１％プロピレンジアミ
ン及び滅菌蒸留水で反応液容量を５μｌにした。反応液
２として、４０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー
（ｐＨ７．８）、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミ
ン）、１％ＤＭＳＯ、各０．５ｍＭｄＮＴＰ混合物、
５ｍＭ酢酸マグネシウム、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴＤ
ＮＡポリメラーゼ、および滅菌蒸留水で反応液容量を２
０μｌにした。

【０１０９】上記反応液１を９８℃、２分間熱変性処理
後、氷上にて冷却した。次に、反応液２を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、４℃に冷却した。反応
液１μｌを３％ヌシーブ３：１アガロースゲルにて
電気泳動を行なった。その結果、鋳型のゲノムＤＮＡに
対して、どちらのプライマー対を使用した反応において
も、目的サイズの増幅産物が得られる事を確認できた。

【０１１０】実施例６本発明の増幅方法について種々のプライマーを用いて検
討した。鋳型としてｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡをＳ
ｃａＩ（宝酒造社製）で制限酵素消化したものを使用し
た。プライマーは、実施例２に記載のＭ１３-Ｍ４及び
Ｍ１３−ＲＶプライマーの組み合わせをプライマー対
１、Ｍ１３−Ｍ４（Ｎ３）及びＭ１３−ＲＶ（Ｎ３）プ
ライマーの組み合わせをプライマー対２として使用し
た。

【０１１１】反応液組成を以下に示す。；反応液１とし
て、それぞれ３０ｐｍｏｌの上記プライマー対及び１ｎ
ｇの鋳型ＤＮＡ、０．０１％プロピレンジアミン、及
び滅菌蒸留水で反応液容量を５μｌにした。反応液２と
して、４０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ
７．８）、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、
１％ＤＭＳＯ、各０．５ｍＭｄＮＴＰ混合物、５ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴＤＮ
Ａポリメラーゼ、および滅菌蒸留水で反応液容量を２０
μｌにした。

【０１１２】上記反応液１を９８℃、２分間熱変性処理
後、氷上にて冷却した。次に、反応液２を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、４℃に冷却した。反応
液１μｌを３％ヌシーブ３：１アガロースゲルにて
電気泳動を行なった。その結果、どちらのプライマー対
を使用した反応においても、目的サイズ約１２０ｂｐの
増幅産物が得られる事を確認できた。

【０１１３】実施例７本発明の増幅方法について、種々のＤＮＡポリメラーゼ
を用いて検討した。鋳型としてｐＵＣ１１８プラスミド
ＤＮＡ（宝酒造社製）をＳｃａＩ（宝酒造社製）で制限
酵素消化したものを使用した。プライマーは、Ｍ１３
ＰｒｉｍｅｒＭ４（宝酒造社製）及びＭ１３Ｐｒｉｍ
ｅｒＲＶ（宝酒造社製）を使用した。また、ポリメラ
ーゼは、ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造
社製）１．２Ｕ／μｌ、ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリ
メラーゼ（宝酒造社製）１１Ｕ／μｌ、ＢｓｔＤＮ
Ａポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）８Ｕ／μｌ、ＰｙｒｏＢ
ＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．５Ｕ／
μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）２．
５Ｕ／μｌ、クレノウフラグメント（宝酒造社製）２Ｕ
／μｌを使用した。

【０１１４】反応液組成を以下に示す。；３３．３ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．８）、１０
４．２ｍＭ酢酸カリウム、０．００２％プロピレン
ジアミン、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ（牛血
清アルブミン）、４．１ｍＭ酢酸マグネシウム、各５
１０μＭｄＮＴＰ混合物、各３０ｐｍｏｌのＭ１３−
Ｍ４及びＭ１３−ＲＶプライマー、鋳型ＤＮＡ 1ｎ
ｇ、及び滅菌蒸留水で反応液量を２４μｌにした。

【０１１５】上記反応液を９８℃、２分間熱変性処理
後、氷上で冷却した。次に上記のＤＮＡポリメラーゼを
１μｌ添加し、クレノウフラグメントを使用した場合の
み、３７℃、６０分間保持した。それ以外のＤＮＡポリ
メラーゼを使用した場合は、５５℃、６０分間保持し
た。その後４℃に冷却し、各反応液１μｌを３％ヌシ
ーブ３：１アガロースゲル（宝酒造社製）にて電気泳
動を行なった。その結果、１．２ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、１１ＵのＢｃａＢ
ＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、８ＵのＢ
ｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を用いた場合
に、目的の１２３ｂｐの増幅断片が得られる事を確認し
た。

【０１１６】実施例８本発明の増幅方法について、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラプラ
イマーを用いて検討した。鋳型は、ｒａｓＧｅｎｅ
ＰｒｉｍｅｒＳｅｔｃ−Ｋｉ−ｒａｓ／１２（宝酒
造社製）及びｒａｓＭｕｔａｎｔＳｅｔのｃ−Ｋｉ
−ｒａｓｃｏｄｏｎ１２Ａｓｐ変異体（宝酒造社
製）の組み合わせでＰＣＲを行い、得られた増幅断片を
ＴａＫａＲａＢＫＬキット（宝酒造社製）で平滑末端
化、リン酸化処理した。処理後のＰＣＲ増幅断片はｐＵ
Ｃ１１８ベクターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニング
し、得られた該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩ消
化したものを本実施例の鋳型として使用した。また、プ
ライマーは配列表の配列番号１９〜２０に記載のｃ−Ｋ
ｉ−ｒａｓ／１２ｆｏｒｗａｒｄ（Ｎ３）及び、ｃ−
Ｋｉ−ｒａｓ／１２ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｎ３）を使用し
た。

【０１１７】反応液組成を以下に示す。；反応液１とし
て、それぞれ３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対、１ｎ
ｇの鋳型ＤＮＡ、０．０１％プロピレンジアミン及び滅
菌蒸留水で反応液容量を５μｌにした。反応液２とし
て、４０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ
７．８）、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、
１％ＤＭＳＯ、各０．５ｍＭｄＮＴＰ混合物、５ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴＤＮ
Ａポリメラーゼ、および滅菌蒸留水で反応液容量を２０
μｌにした。

【０１１８】上記反応液１を９８℃、２分間熱変性処理
後、氷上にて冷却した。次に、反応液２を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、４℃に冷却した。反応
液１μｌを３％ヌシーブ３：１アガロースゲルにて
電気泳動を行なった。

【０１１９】その結果、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラプライ
マーを用いた場合、目的サイズの増幅産物が得られる事
が確認できた。

【０１２０】実施例９本発明の増幅方法について種々の鋳型を用いて変性処理
なしの場合について検討した。また、鋳型としてｐＵＣ
１１８プラスミドＤＮＡをＨｉｎｃＩＩで制限酵素消化
したものを使用した。また、実施例１記載のｐＵＣ１９
ｕｐｐｅｒ１５０プライマー、ｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒプ
ライマーを使用した。反応液組成を以下に示す。；０．
００２％プロピレンジアミン、３２．７ｍＭＨｅｐ
ｅｓ−ＫＯＨバッファー（ｐＨ７．８）、１０２ｍＭ
酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ
（牛血清アルブミン）、４．１ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、各５１０μＭｄＮＴＰ混合物、各３０ｐｍｏｌの
上記ｕｐｐｅｒ１５０プライマー及びｌｏｗｅｒプライ
マー、鋳型ＤＮＡ 1ｎｇ、及び滅菌蒸留水で反応液量
を２４．５μＬにした。同時に鋳型ＤＮＡを添加しない
反応液も作製した。

【０１２１】上記反応液に１１ＵのＢｃａＢＥＳＴＤ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添加し、５５℃、６
０分間保持した。その後４℃に冷却した。各反応液１μ
ｌを３％ヌシーブ３：１アガロースゲル（宝酒造社
製）にて電気泳動を行なった。

【０１２２】その結果、上記いずれの鋳型においても、
目的の１５０ｂｐの増幅断片が得られる事を確認した。
鋳型ＤＮＡを添加しなかった反応液からは、目的の増幅
産物は確認されなかった。

【０１２３】

【発明の効果】以上のように、本発明の方法によりＤＮ
ＡもしくはＲＮＡを鋳型として、等温条件下で連続して
ＤＮＡを合成することができる。従って、該方法では、
特別なサーマルサイクラーを必要とせず、温度設定に要
する時間も必要ないため短時間で増幅産物を得られると
いう優れた効果を奏する。さらに、該方法で短時間に増
幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素消化することができる
ため、制限酵素長多型や変異検出等の遺伝子検査の領域
において有用である。また、該増幅ＤＮＡ断片は、ＲＮ
Ａプローブ調製のための鋳型として使用できる等の遺伝
子工学の領域においても有用である。

【０１２４】

【配列表フリーテキスト】 SEQ ID NO:1: Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 SEQ ID NO:2: Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 lower SEQ ID NO:3: Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC 19 upper 150(N) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotide 25 is ribonucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:4: Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC 19 lower(N) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotide 25 is r ibonucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:5: Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC 19 upper 150(N2) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 2 4 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:6: Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC 19 lower(N2) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 24 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:7: Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC 19 upper 150(N3) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 2 3 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:8: Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC 19 lower(N3) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:9: Designed oligonucleotide primer designated as M13-M4 SEQ ID NO:10: Designed oligonucleotide primer designated as M13-RV SEQ ID NO:11: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M1 3-M4(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 16 to 17 ar e ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:12: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M1 3-RV(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 16 to 17 ar e ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:13: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M1 3-M4(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 15 to 17 ar e ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:14: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M1 3-RV(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 15 to 17 ar e ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:15: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M1 3-20(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 24 ar e ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:16: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as RV -P(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 24 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:17: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M1 3-20(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 22 to 24 ar e ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" SEQ ID NO:18: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as RV -P(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 22 to 24 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonuclotides" SEQ ID NO:19: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c- Ki-ras/12 forward(N3) to amplify a portion of c-ki-ras oncogene. "nucleo tides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonuclot ides" SEQ ID NO:20: Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c- Ki-ras/12 reverse(N3) to amplify a portion of c-ki-ras oncogene. "nucleo tides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonuclot ides"

【０１２５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> A method for amplification of nucleic acids <130> T-1601 <160> 20 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 upper 150 <400> 1 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as pUC19 lower <400> 2 gataacactg cggccaactt acttc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC19 upper 150(N) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotide 25 is ribon ucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 3 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC19 lower (N) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotide 25 is ribonucle otide-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 4 gataacactg cggccaactt acttc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC19 upper 150(N2) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 24 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 5 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtaug 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC19 lower (N2) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 24 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 6 gataacactg cggccaactt actuc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC19 upper 150(N3) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 7 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtaug 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designsted as pUC19 lower (N3) to amplifyed a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 25 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 8 gataacactg cggccaactt acuuc 25 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13-M4 <400> 9 gttttcccag tcacgac 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as M13-RV <400> 10 caggaaacag ctatgac 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M13-M4(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 16 to 17 are ribonuc leotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 11 gttttcccag tcacgac 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M13-RV(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 16 to 17 are ribonuc leotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 12 caggaaacag ctatgac 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M13-M4(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 15 to 17 are ribonuc leotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 13 gttttcccag tcacgac 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M13-RV(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 15 to 17 are ribonuc leotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 14 caggaaacag ctatgac 17 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M13-20(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 24 are ribonuc leotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 15 cgacgttgta aaacgacggc cagu 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as RV-P(N2) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 23 to 24 are ribonucle otides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 16 ggaaacagct atgaccatga ttac 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as M13-20(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 22 to 24 are ribonuc leotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides" <400> 17 cgacgttgta aaacgacggc cagu 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as RV-P(N3) to amplify a portion of plasmid pUC19. "nucleotides 22 to 24 are ribonucle otides-other nucleotides are deoxyribonuclotides" <400> 18 ggaaacagct atgaccatga tuac 24 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras/12 forward(N3) to amplify a portion of c-ki-ras oncogene. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonuclotides" <400> 19 gactgaatataaacttgugg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> DNA-RNA chimera <223> Designed chimeric oligonucleotide primer designated as c-Ki-ras/12 reverse(N3) to amplify a portion of c-ki-ras oncogene. "nucleotides 18 to 20 are ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonuclotides" <400> 20 ctattgttggatcatatucg 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者向井博之滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者浅田起代蔵滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内 (72)発明者加藤郁之進滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号寳酒造株式会社中央研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 CA04 CA11 EA04 HA11 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR08 QR42 QR59 QR62 QS16 QS25 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を増幅するための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸の鎖を少なくとも１種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラー
ゼにより処理して、該核酸の鎖に相補的なプライマーの
伸長生成物を合成し、ここで前記プライマーは、鋳型と
なる核酸の塩基配列に実質的に相補的であって；（ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸に上記（ａ）で使
用されたプライマーと同じ塩基配列を有する、新たに伸
長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがア
ニーリングし；そして（ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸の鎖置換を行い、再生さ
れたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の工程
に再度利用される；ことを含んでなる核酸の増幅方法。
【請求項２】核酸を増幅するための方法であって、（ａ）鋳型となる核酸の鎖を２種類のオリゴヌクレオチ
ドプライマーのうちの１種のプライマー及び鎖置換型Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより処理して、該核酸の鎖に相補的
なプライマーの伸長生成物を合成し、ここで前記プライ
マーは、鋳型となる核酸に実質的に相補的であって；（ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸に上記（ａ）で使
用されたプライマーと同じ塩基配列を有する、新たに伸
長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがア
ニーリングし；（ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸の鎖置換を行い、再生さ
れたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の工程
に再度利用され；（ｄ）上記工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型として
（ａ）で使用されたプライマーと異なる種類のオリゴヌ
クレオチドプライマー及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ
により処理して、置換鎖に相補的なプライマーの伸長生
成物を合成し、ここで前記プライマーは、置換鎖に実質
的に相補的であって；（ｅ）上記工程で得られる２本鎖核酸に上記（ｄ）で使
用されたプライマーと同じ塩基配列を有する新たに伸長
反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーがアニ
ーリングし；そして（ｆ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸の鎖置換を行い、再生さ
れたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｅ）の工程
に再度利用される；ことを含んでなる核酸の増幅方法。
【請求項３】鋳型となる核酸がＤＮＡ配列である請求
項１又は請求項２記載の核酸の増幅方法。
【請求項４】２本鎖ＤＮＡを２種類の相補的な１本鎖
ＤＮＡに変性する前処理をしたものを鋳型として用いる
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の
核酸の増幅方法。
【請求項５】変性処理しない２本鎖ＤＮＡを鋳型とし
て用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項
に記載の核酸の増幅方法。
【請求項６】等温で行うことを特徴とする請求項１〜
５のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項７】さらに、工程（ａ）の前にＲＮＡを鋳型
として、逆転写酵素による逆転写反応により１本鎖のｃ
ＤＮＡを調製する工程を含み、該１本鎖のｃＤＮＡを鋳
型となる核酸とすることを特徴とする請求項１〜４ある
いは６のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項８】逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス
由来のＡＭＶＲＴａｓｅ，モロニーネズミ白血病ウイ
ルス由来のＭＭＬＶＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血
病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活性の
欠失した変異体であるSuperscript II^TM及びラウス関連
ウイルス２由来のＲＡＶ−２ＲＴａｓｅからなる群か
ら選択される逆転写酵素であることを特徴とする請求項
７記載の核酸の増幅方法。
【請求項９】逆転写酵素が、耐熱性を有する鎖置換型
ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項７記
載の核酸の増幅方法。
【請求項１０】逆転写酵素が、バチルスステアロサ
ーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５'→３'エキソヌクレアー
ゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、もしくは、バチル
スカルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏ
ｔｅｎａｘ）由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損Ｂ
ｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択されるＤ
ＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項９記載
の核酸の増幅方法。
【請求項１１】核酸を増幅するための方法であって、（ａ）デオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を有す
るＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも１種類のオリゴ
ヌクレオチドプライマーを鋳型となる核酸と混合する工
程、ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列
に実質的に相補的であり；及び（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物
を反応開始から反応終了まで実質的に等温でインキュベ
ートする工程、を包含し、鋳型となる核酸の相補鎖を２
コピー以上生成させることを特徴とする核酸の増幅方
法。
【請求項１２】プライマーからの伸長が、鎖置換能を
有するＤＮＡポリメラーゼにより行われることを特徴と
する請求項１１記載の核酸の増幅方法。
【請求項１３】ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来のＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノウ断片、バチルスステアロサーモフィラ
ス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮ
Ａポリメラーゼ、及びバチルスカルドテナックス由来
の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリ
メラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼ
であることを特徴とする請求項１２記載の核酸の増幅方
法。
【請求項１４】さらに、鋳型となる核酸の塩基配列に
実質的に相同なオリゴヌクレオチドプライマーを含有し
てなる請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の核酸の
増幅方法。
【請求項１５】鋳型となる核酸が、１本鎖ＤＮＡ、２
本鎖ＤＮＡ由来のそれぞれの１本鎖、またはＲＮＡから
逆転写反応によって得られるｃＤＮＡからなる群より選
択される核酸であることを特徴とする請求項１１〜１４
のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１６】変性処理しない２本鎖ＤＮＡを鋳型と
なる核酸として用いることを特徴とする請求項１１〜１
４のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。