JP2001136965A - 核酸配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】ＤＮＡの合成方法に関し、簡便で、効率の良い
核酸配列の増幅方法を提供する。 【解決手段】（ａ）鋳型となる核酸配列の鎖を少なくと
も１種類のオリゴヌクレオチドプライマーにより処理し
て、該核酸配列の鎖に相補的なプライマーの伸長生成物
を合成し、（ｂ）上記工程で得られるプライマー伸長鎖
の５′末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖にし、
そこに上記（ａ）のプライマーと同じ塩基配列を有する
新たに伸長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライ
マーがアニーリングし、（ｃ）上記工程のプライマーの
３′末端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行
い、再生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が
（ｂ）の工程に再利用される、ことを含んでなる核酸配
列の増幅方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学分野に
おいて有用なＤＮＡの合成方法に関し、鋳型となる核酸
配列の増幅方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの
合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレ
オチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほと
んどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により
実施されている。例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リ
アクション法（ＰＣＲ法）があるが、それは米国特許第
４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および
第４，８００，１５９号に詳細に記述されている。もう
一つの例としては、トレンズ イン バイオテクノロジ
ー（Trends in Biotechnology １０、ｐ１４６―ｐ１
５２、１９９２）に記載の当該方法と逆転写酵素反応を
組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙げら
れる。上記の方法の開発により、ＤＮＡから、若しくは
ＲＮＡから目的とする領域を増幅することが可能になっ
た。

【０００３】これらのＤＮＡ合成方法は、目的とするＤ
ＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡ
の一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプラ
イマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成
（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしく
は、“シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白
質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜
４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ
反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステッ
プを同一温度で行なう２ステップ反応により実施され
る。

【０００４】さらに別法としては、欧州特許出願公開第
３２０，３０８号に記述されているリガーゼ・チェイン
・リアクション（ＬＣＲ）法が挙げられる。上記３法
は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生す
るために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要が
ある。このように温度によって反応が制約されるため、
反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要があ
る。

【０００５】従って、上記の方法には広い温度範囲で、
かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高
価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。
また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうた
め設定温度にするために要する時間が必要であり、その
ロス時間はサイクル数に比例して増大していく。

【０００６】そこで、上記問題点を解決すべく等温状態
で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、日本国
特公平７―１１４７１８号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤ
Ａ；strand displacement amplification）法、自立複
製（３ＳＲ；self-sustainedsequence replication）
法、日本国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配
列増幅（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence based am
plification）法、ＴＭＡ(transcription-mediated amp
lification)法、日本国特許番号第２７１０１５９号に
記載のＱベータレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第
５８２４５１７号、国際公開パンフレット第９９／０９
２１１号あるいは国際公開パンフレット第９５／２５１
８０号に記載の種々の改良ＳＤＡ法等が挙げられる。こ
れらの等温核酸増幅法の反応においては、プライマーの
伸長や、一本鎖伸長生成物（又は元の標的配列）へのプ
ライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸
長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こ
る。

【０００７】これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤ
ＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリ
メラーゼと制限エンドヌクレアーゼが介する二本鎖の置
換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）
の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライ
マーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エン
ドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要が
ある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質とし
て、修飾されたデオキシヌクレオチド３リン酸、例えば
３リン酸の中α位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子
（Ｓ）に置換されたデオキシヌクレオチド３リン酸を大
量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう
遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻
な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたＤ
ＮＡ断片中に修飾ヌクレオチド、たとえばαＳ置換デオ
キシヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のＤ
ＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；restriction en
zyme fragment length polymorphism）解析に供しよう
とする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことが
ある。

【０００８】また、米国特許番号第５８２４５１７号記
載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、
３’末端側がＤＮＡであるキメラプライマーを必要とす
る。また、国際公開パンフレット第９９／０９２１１号
に記載の改良ＳＤＡ法は、 ５’突出末端を生じさせる
制限酵素が必要である。さらに、国際公開パンフレット
第９５／２５１８０号に記載の改良ＳＤＡ法は、少なく
とも２組のプライマー対を必要とする。

【０００９】上記のように従来の等温核酸増幅法は、ま
だまだ種々の問題をかかえており、低ランニングコスト
で、かつ結果的に得られたＤＮＡ断片をさらに遺伝子工
学的な処理に使用することが可能な核酸配列の増幅方法
が求められていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、オリ
ゴヌクレオチドプライマーの存在下に鎖置換型ＤＮＡ合
成反応を行なうことを特徴とする簡便で、効率の良い核
酸配列の増幅方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、鎖置換能を有する ＤＮＡ ポリメラーゼ存在
下、少なくとも１組のオリゴヌクレオチドプライマーに
より目的とする領域のＤＮＡを増幅する方法を見出し、
優れた遺伝子増幅反応系を構築し、本発明を完成するに
至った。

【００１２】即ち、本発明の要旨は、[１] 核酸配列を
増幅するための方法であって、 （ａ）鋳型となる核酸配列の鎖を少なくとも１種類のオ
リゴヌクレオチドプライマーにより処理して、該核酸配
列の鎖に相補的なプライマーの伸長生成物を合成し、こ
こで前記プライマーは、鋳型となる核酸配列に実質的に
相補的であって； （ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、そこに上記（ａ）で使用されたプライマーと同じ塩
基配列を有する新たに伸長反応に用いられるオリゴヌク
レオチドプライマーがアニーリングし； （ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、再
生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の
工程に再度利用される；ことを含んでなる核酸配列の増
幅方法、[２] 核酸配列を増幅するための方法であっ
て、 （ａ）鋳型となる核酸配列の鎖を２種類のオリゴヌクレ
オチドプライマーのうちの１つにより処理して、該核酸
配列の鎖に相補的なプライマーの伸長生成物を合成し、
ここで前記プライマーは、鋳型となる核酸配列に実質的
に相補的であって； （ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、そこに上記（ａ）で使用されたプライマーと同じ塩
基配列を有する新たに伸長反応に用いられるオリゴヌク
レオチドプライマーがアニーリングし； （ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、再
生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の
工程に再度利用され、； （ｄ）上記工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型として
（ａ）で使用されたプライマーと異なるオリゴヌクレオ
チドプライマーにより処理して、置換鎖に相補的なプラ
イマーの伸長生成物を合成し、ここで前記プライマー
は、置換鎖の一本鎖に実質的に相補的であって； （ｅ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、そこに上記（ｄ）で使用されたプライマーと同じ塩
基配列を有する新たに伸長反応に用いられるオリゴヌク
レオチドプライマーがアニーリングし；そして （ｆ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、再
生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｅ）の
工程に再度利用される；ことを含んでなる核酸配列の増
幅方法、[３] 鋳型となる核酸配列がＤＮＡ配列である
上記[１]又は[２]記載の核酸配列の増幅方法、[４] ２
本鎖ＤＮＡを２種類の相補的な１本鎖ＤＮＡに変性する
前処理をしたものを鋳型として用いることを特徴とする
上記[１]〜[３]いずれか記載の核酸配列の増幅方法、
[５] 等温で行うことを特徴とする上記[１]〜[４]いず
れか記載の核酸配列の増幅方法、[６] さらに、工程
（ａ）の前にＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素による逆
転写反応により１本鎖のｃＤＮＡを調製する工程を含
み、該１本鎖のｃＤＮＡを鋳型となる核酸配列とするこ
とを特徴とする上記[１]〜[５]いずれかに記載の核酸配
列の増幅方法、[７] 逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウ
イルス由来のＡＭＶ ＲＴａｓｅ，モロニーネズミ白血
病ウイルス由来のＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズ
ミ白血病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ
活性の欠失した変異体であるSuperscript II^TM及びラウ
ス関連ウイルス２由来のＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅからな
る群から選択される逆転写酵素であることを特徴とする
上記[６]記載の核酸配列の増幅方法、[８] 逆転写酵素
が、耐熱性を有するＤＮＡポリメラーゼであることを特
徴とする上記[６]記載の核酸配列の増幅方法、[９] 逆
転写酵素が、サーマス サーモフィラス由来のＤＮＡポ
リメラーゼであるＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、バチル
ス ステアロサーモフィラス由来の５'→３'エキソヌク
レアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、もしくは、バ
チルスカルドテナックス由来の5'→３'エキソヌクレア
ーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選
択されるＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする上
記[８]の核酸配列の増幅方法、[１０] 核酸配列を増幅
するための方法であって、（ａ）デオキシヌクレオチド
３リン酸、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼ、及び
少なくとも１種類の鋳型となる核酸配列の一本鎖に実質
的に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型とな
る核酸配列と混合し；そして（ｂ）反応産物を生成する
のに充分な時間、反応混合物を反応させる、ことを特徴
とする核酸配列の増幅方法、[１１] プライマーからの
伸長が、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼにより行
われることを特徴とする上記[１０]記載の核酸配列の増
幅方法、[１２] ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来の
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステ
アロサーモフィラス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ
欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス カルド
テナックス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃ
ａポリメラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメ
ラーゼであることを特徴とする上記[１１]記載の核酸配
列の増幅方法、[１３] ２種類のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを含有してなる上記[１０]〜[１２]いずれかに
記載の核酸配列の増幅方法、そして[１４] 鋳型となる
核酸配列が、一本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ由来のそれぞ
れの１本鎖、またはＲＮＡから逆転写反応によって得ら
れたｃＤＮＡからなる群より選択される核酸配列である
ことを特徴とする上記[１０]〜[１３]いずれかに記載の
核酸配列の増幅方法、に関する。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマー 本発明に使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、デ
オキシヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドにより
構成される。

【００１４】本明細書に記載のデオキシヌクレオチドと
は、デオキシリボヌクレオチド３リン酸（本明細書中で
は、ｄＮと称す）のことをいい、例えば、ｄＡＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰが挙げられる。さらに該デ
オキシヌクレオチドにはこれらの誘導体、特に限定する
ものではないが、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫
黄原子に置き換えたデオキシヌクレオチド（α―チオ
デオキシヌクレオチド、以下（α―Ｓ）ｄＮＴＰ、ある
いは（α―Ｓ）ｄＮと記載する。）等も含まれる。

【００１５】本明細書に記載のリボヌクレオチド（本明
細書中では、Ｎと称す）とは、リボヌクレオチド３リン
酸のことをいい、たとえばＡＴＰ，ＵＴＰ，ＣＴＰ，Ｇ
ＴＰが挙げられる。さらに該リボヌクレオチドにはこれ
らの誘導体、特に限定するものではないが、例えばα位
のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌク
レオチド（α―チオーリボヌクレオチド、以下（α―
Ｓ）ＮＴＰ、あるいは（α―Ｓ）Ｎと記載する。）等も
含まれる。

【００１６】本発明の方法において、使用されるオリゴ
ヌクレオチドプライマーには、未修飾デオキシヌクレオ
チド及び／又は修飾デオキシヌクレオチド及び未修飾リ
ボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチドを含有
するキメラオリゴヌクレオチドプライマー、未修飾デオ
キシヌクレオチド及び／又は修飾デオキシヌクレオチド
で構成されたオリゴヌクレオチドプライマー、及び未修
飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチドで
構成されたオリゴヌクレオチドプライマーも含まれる。

【００１７】本発明の方法において、使用されるオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡに実質的に相補
的な塩基配列を有し、その3'末端よりＤＮＡ鎖の伸長が
可能であれば良い。なお、ここで「実質的に相補的な塩
基配列」とは、使用される反応条件、例えばストリンジ
ェントな条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング
し、続くＤＮＡ伸長反応が可能な塩基配列を意味する。
このようなオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、当
業者に公知であり、例えば、ラボマニュアルＰＣＲ（宝
酒造、第１３頁〜第１６頁、１９９６年）を参考に設計
する事ができる。また、市販のプライマー構築ソフト、
例えば、OLIGO^TM Primer Analysis software（宝酒造社
製）を使用することができる。

【００１８】本発明を何ら限定するものではないが、例
えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチド
が本発明のＤＮＡ合成方法に使用することができる。 一般式：5'―（ｄＮ）_a―[(α―Ｓ)ｄＮ]_b―[(α―Ｓ)
Ｎ]_c―Ｎ_d―３' （a：１１以上の整数、b：０又は１以上の整数、ｃ：０
又は１以上の整数、ｄ：０又は１以上の整数、ｄＮ：デ
オキシリボヌクレオチド、(α―Ｓ)ｄＮ：α―チオ デ
オキシヌクレオチド、(α―Ｓ)Ｎ：α―チオ リボヌク
レオチド、Ｎ：リボヌクレオチド）

【００１９】上記オリゴヌクレオチドプライマーを構成
するヌクレオチドとしては、プライマーとして核酸増幅
反応に使用できるものであればいずれもが好適に使用で
きる。例えば、修飾されたリボヌクレオチド３リン酸と
しては、例えば、米国特許第５００３０９７号記載の硫
化反応試薬（グレンリサーチ社製）を用いた方法で調製
したα―Ｓ リボヌクレオチド３リン酸、あるいは２―
ＯＭｅ−ＲＮＡ―ＣＥホスホアミダイド試薬（グレンリ
サーチ社製）を用いる、リボースの２位の水酸基が−Ｏ
ＣＨ₃になっているリボヌクレオチド３リン酸等が挙げ
られる。また、修飾されたデオキシヌクレオチド３リン
酸としては、α―Ｓ デオキシヌクレオチド３リン酸等
が挙げられる。

【００２０】本発明のＤＮＡ合成反応中において、ＤＮ
Ａポリメラーゼで伸長したＤＮＡ鎖を鎖置換（ストラン
ドディスプレイスメント、strand displacement）でき
るように、例えば、本発明に使用されるオリゴヌクレオ
チドプライマーの5'末端側から新しいオリゴヌクレオチ
ドプライマーがもぐりこみやすい構造、例えば、 ５’
末端側に１塩基から数塩基のミスマッチするような構造
を有するものも本発明に使用されるオリゴヌクレオチド
プライマーに含まれる。すなわち、鋳型ＤＮＡにアニー
リングした、上記の一般式で表されるオリゴヌクレオチ
ドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖
ＤＮＡに鎖置換能を有するＤＮＡ ポリメラーゼを作用
させた場合には、上記オリゴヌクレオチドプライマーか
らの伸長鎖の ５’末端側の水素結合が緩やかになるた
め、新しいオリゴヌクレオチドプライマーが潜り込み、
該プライマーが相補的な部分にアニーリングすることが
できる。その結果、新しくアニーリングしたプライマー
の伸長に従って、鎖置換反応がすすむ。

【００２１】本発明の方法で使用するオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、増幅後のＤＮＡ断片を１本鎖もしくは
２本鎖のいずれの形態で得たいかによって１種類もしく
は２種類を使い分けることができる。

【００２２】本発明の方法において使用されるオリゴヌ
クレオチドプライマーは約１１ヌクレオチドから約１０
０ヌクレオチドの長さのプライマー好ましい。さらに好
ましくは、約２０ヌクレオチドから約４０オリゴヌクレ
オチドの長さのプライマーである。この配列は３’末端
側がストリンジェントな条件においてアニーリングする
ように、実質的に標的物の配列に相同であることが好ま
しい。

【００２３】本発明のオリゴヌクレオチドプライマー
は、任意の核酸配列を持つように、例えばＡＢＩ社（Ap
plied Biosystem Inc.）のＤＮＡシンセサイザー３９４
型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。別
法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、
チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成さ
れたものであっても良い。

【００２４】（２）本発明に使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼ 本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鎖を
置換（strand displacement）する活性を有するものを
使用することができる。また、実質的に5'→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用する
ことができる。特に限定するものではないが、例えば、
バチルス・カルドテナックス（Bacilluscaldotenax、以
下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス・ステアロサーモフィ
ルス（Bacillus stearothermophilus、以下Ｂ．ｓｔと
称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラー
ゼの5'→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体
や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来ＤＮＡポ
リメラーゼＩのラージ フラグメント（クレノウフラグ
メント）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤ
ＮＡポリメラーゼは、常温性、中温性、もしくは耐熱性
のいずれのものも好適に使用できる。該ＤＮＡポリメラ
ーゼは、上記作用を有するものであれば、天然体もしく
は変異体のいずれも好適に使用できる。さらに、本発明
の方法に使用するＤＮＡ ポリメラーゼは、鎖置換型増
幅反応を行う際に、２本鎖ＤＮＡの５’末端側の水素結
合を緩やかにし、新たに核酸伸長反応に用いられるオリ
ゴヌクレオチドプライマーを潜り込み易くして、該プラ
イマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部分にアニーリングする
ような作用を有しているものが好適に使用できる。特に
限定はないが例えば、Ｂｃａ ＤＮＡ ポリメラーゼが
好適に使用できる。また、本発明の方法において鎖置換
能を有するＤＮＡ ポリメラーゼと２本鎖ＤＮＡの
５’末端側の水素結合を緩やかにし、新たに核酸伸長反
応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを潜り込
み易くして、該プライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部分
にアニーリングするような作用を有する物質、例えばヘ
リカーゼ等の共存下に行われる核酸増幅反応も本発明の
方法に含まれる。

【００２５】（３）本発明に使用される組成物 本発明に使用される組成物には、特に限定はないが例え
ば、トリス塩酸バッファー、リン酸ナトリウムバッファ
ー、トライシンバッファーが好適に使用できる。さらに
リン酸カリウムバッファーが好適に使用できる。さらに
該組成物は、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシ
ウム、酢酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムを含
んでも良い。また、増幅反応の基質となるｄＮＴＰミッ
クス、少なくとも１種類のプライマーを含んでも良い。
さらに、組成物中には、ジメチルスルホキシド(dimethy
l sulfoxide)等の添加物、あるいは、国際公開パンフレ
ット第９９／５４４５５号に記載の酸性物質あるいは陽
イオン錯体を共存させても良い。酵素については、ＤＮ
Ａ ポリメラーゼは、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡ
ポリメラーゼを含んでも良い。さらに、２本鎖ＤＮＡの
５’末端側の水素結合を緩やかにし、新たに核酸伸長
反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを潜り
込み易くして、該プライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部
分にアニーリングするような作用を有する物質を含んで
も良い。前述の酵素については、種類によって好適に使
用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その
際は、増幅産物量が最大になるように該組成物の組成比
及び使用酵素ユニット数を調整すればよい。いずれの場
合においても、使用する酵素の種類にあわせて、組成物
の組成を至適化するのは、当然のことである。

【００２６】（４）本発明の核酸配列の増幅方法 本発明の方法は、上記（１）に示されたオリゴヌクレオ
チドプライマーを少なくとも１種類使用し、さらに上記
（２）に示されたＤＮＡポリメラーゼを組合わせて実施
することができる。当該方法では、ＤＮＡ合成に使う基
質ヌクレオチドは、ＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰが好
適に使用できる。また、当該方法では、オリゴヌクレオ
チドプライマーあるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌ
クレオチドプライマーを使用するが、このプライマー
は、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて、通常の合成方法
と同様に調製することができる。

【００２７】本発明の方法において鋳型となるＤＮＡ及
びＲＮＡは、鋳型となる核酸配列を含むと推定されてい
るどのような試料からも単離することができる。このよ
うな核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、細
胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排
水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられ
る。また、前記試料等を公知の方法で処理することによ
って得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物
としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる
試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例
えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用でき
る。さらに公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ
等の核酸等も好適に使用できる。

【００２８】本発明の方法に適用することができるＲＮ
Ａとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮ
Ａ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特
定のＲＮＡ分子群が挙げられ、逆転写反応に使用される
プライマーが作成可能な任意のＲＮＡが挙げられる。

【００２９】これら材料からの核酸の単離は、あらゆる
方法により行うことができる。そのような方法は、界面
活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用い
た振盪撹拌およびフレンチプレスの使用を含む。幾つか
の例において、単離された核酸を精製することが有利で
ある（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。
これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、ク
ロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密
度に依存した遠心分離により実施される。

【００３０】上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰ
ＣＲフラグメントのような２本鎖ＤＮＡ、及び全ＲＮＡ
若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡ
のような１本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明において鋳型
ＤＮＡとして好適に使用できる。上記２本鎖ＤＮＡの場
合は、１本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）に
よって得られる好適に使用できる。さらに、本発明のＤ
ＮＡの合成方法は、Ｂ．ｃａ由来のＤＮＡポリメラーゼ
を使うことにより、トータルＲＮＡ若しくはｍＲＮＡか
らの逆転写反応とｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡポリメラ
ーゼ反応を１種類のポリメラーゼで行なうことができ
る。

【００３１】上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中
に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少
なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列
の十分な結合を提供するようなものがよい。

【００３２】本発明の方法においてＲＮＡを鋳型として
逆転写反応と組み合わせて核酸増幅を行う事ができる。
該逆転写反応に用いられる酵素としては、ＲＮＡを鋳型
としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定
はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素
（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイル
ス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関
連ウイルス2逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）
等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、
逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用するこ
ともできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆
転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属
細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラー
ゼ等）、バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使
用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス
属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由
来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラー
ゼ）、更にＢ．ｃａ由来ＤＮＡポリメラーゼ（以下、Ｂ
ｃａ ＤＮＡポリメラーゼと記載する）が好ましい。例
えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、反応にマンガン
イオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの
二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが
出来る。

【００３３】Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である
好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ ＤＮＡポリ
メラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５'→
３'エキソヌクレアーゼ活性、３'→５'エキソヌクレア
ーゼ活性を持つことが知られている。

【００３４】これらの酵素はその本来の起源より精製し
て取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された
組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素
は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、
欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良
く、該改変された酵素として例えば５'→３'エキソヌク
レアーゼ活性を欠損させたＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ
であるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げら
れる。

【００３５】本発明の方法は、鋳型ＤＮＡが２本鎖ＤＮ
Ａの場合、それらを変性して一本鎖にすることにより鋳
型ＤＮＡ鎖へのプライマーの結合を可能にさせる。反応
温度を約９５℃に上昇させることは、好ましい核酸変性
法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、オリゴヌク
レオチドプライマーを標的物に結合させるためにｐＨを
低下させる必要がある。

【００３６】本発明の方法においては、２本鎖を１本鎖
ＤＮＡに変性する工程、もしくは、鋳型がＲＮＡの場
合、逆転写反応によりｃＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）を調製
する工程の後、下記の工程が並行して連続し、繰返し起
こることを特徴としている。

【００３７】［１］鋳型となるＤＮＡが１種もしくは２
種のオリゴヌクレオチドプライマーとアニーリングする
工程。 ［２］プライマーの３’末端からＤＮＡ伸長反応を行な
う工程。 ［３］プライマーの ５’末端側から２本鎖ＤＮＡが部
分的に１本鎖になり、新しいプライマーが鋳型ＤＮＡの
相補的な領域にアニーリングする工程。 ［４］［３］でプライマーの ５’末端側から部分的に
１本鎖になった部位よりＤＮＡ鎖を分解することなく除
去しながら、[３]でアニーリングしたオリゴヌクレオチ
ドの３’末端からＤＮＡ伸長反応を行なう工程。 ［５］［４］の工程で得られた二本鎖ポリヌクレオチド
を用いて［１］〜［４］の工程を繰り返す工程。

【００３８】上記反応系は、常温でも実施できるが、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＢｃａＢＥＳＴ ＤＮ
Ａポリメラーゼを使用して、高温で実施することにより
ＤＮＡ増幅時の特異性をあげることもできる。さらに該
方法においては、逆転写反応と核酸配列の増幅とを連続
して行なう態様も可能であり、上記酵素に耐熱性の逆転
写酵素や、逆転写活性を持つＤＮＡポリメラーゼを組合
わせて、ＲＮＡからＤＮＡを合成することができる。

【００３９】なお、本明細書においては、「連続的に」
とは、上記の各工程が、反応系内で並行して起こってい
ることを意味する。

【００４０】本発明の方法において「等温」とは、酵素
及び核酸鎖が実質的に上記各工程において機能するほぼ
一定の温度条件下のことを言う。

【００４１】本明細書において第１の発明は：一本鎖の
ＤＮＡを鋳型として、少なくとも１種類のオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行なう核酸配列の増幅方法で
ある。本明細書において第２の発明は：一本鎖のＤＮＡ
を鋳型として、２種類のオリゴヌクレオチドプライマー
を用いて行なう核酸配列の増幅方法である。本明細書に
おいて第３の発明は：二本鎖のＤＮＡを鋳型として、少
なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て行なう核酸配列の増幅方法である。本明細書において
第４の発明は：二本鎖のＤＮＡを鋳型として、２種類の
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行なう核酸配列
の増幅方法である。

【００４２】１本鎖鋳型ＤＮＡに対し、それに相補的な
オリゴヌクレオチドプライマーが結合する。ＤＮＡポリ
メラーゼの作用により、該プライマーの３’末端に鋳型
となるＤＮＡ鎖に相補的な核酸配列のデオキシヌクレオ
チドを付加し、相補鎖を伸長する。次に、こうして得ら
れた２本鎖ＤＮＡの ５’末端部分の２本鎖ＤＮＡを部
分的に１本鎖にして、次の伸長反応に使用される新たな
上記のプライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部分にアニー
リングする。さらに、上記のＤＮＡポリメラーゼの有す
る鎖置換能により、先に合成された相補鎖を鋳型ＤＮＡ
から解離させながら新たにアニーリングしたプライマー
の３’末端からＤＮＡ鎖を再伸長する。その結果として
鋳型となる核酸配列に相補的な置換鎖を生成する。

【００４３】本発明において、２種類のオリゴヌクレオ
チドプライマーを使う場合においてその１種類が上記置
換鎖に相補的な場合、上記置換鎖を鋳型として上記と同
様な鎖置換反応が並行して進行する。本発明の方法にお
いてオリゴヌクレオチドプライマーが好適に使用できる
が、さらに未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボ
ヌクレオチドと未修飾デオキシヌクレオチド及び／又は
修飾デオキシヌクレオチドで構成されたキメラオリゴヌ
クレオチドプライマーにおいても好適に使用できる。

【００４４】本発明の方法において、「鎖置換能」と
は、鋳型となる核酸配列に従って複製をする際、鎖を置
き換えながら進行し、特定の相補鎖を遊離させる、即ち
鎖置換（strand displacement）することができる能力
のことをいう。本発明の方法において、「置換鎖」と
は、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮ
Ａ鎖のことを言う。

【００４５】本発明の方法において、「再生されたプラ
イマー伸長鎖」とは、鎖置換により新たに鋳型にアニー
リングしたオリゴヌクレオチドプライマーから伸長した
鋳型となる核酸配列に相補的なＤＮＡ鎖のことを言う。
本発明の方法において、「再度利用され」とは、鋳型と
なる核酸配列と再生されたプライマー伸長鎖で構成され
た２本鎖ＤＮＡを再度鎖置換の工程に利用することを言
う。

【００４６】この方法は、２種のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いても機能できるため、その場合１種のオ
リゴヌクレオチドプライマーは鋳型となる核酸配列の一
方のＤＮＡ鎖に結合し、そして他方のオリゴヌクレオチ
ドプライマーは上記の鋳型となる核酸配列に相補的な核
酸配列を有する鎖に結合する。この態様を使用すると、
各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機能で
きることは明らかである。このようにして、増幅産物が
指数関数的に増加していく。さらに、本発明の方法にお
いてキメラオリゴヌクレオチドが好適に使用できるが、
さらに未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌク
レオチドと未修飾デオキシヌクレオチド及び／又は修飾
デオキシヌクレオチドで構成されたキメラオリゴヌクレ
オチドプライマーにおいても好適に使用できる。

【００４７】核酸を変性する前または後に、４つのすべ
てのデオキシヌクレオチド３リン酸、ポリメラーゼおよ
びエンドヌクレアーゼからなる混合物を添加する。（高
温により核酸を変性し、高温耐性の酵素を使用しないの
ならば、変性後に酵素を添加することが好ましい。）目
的とするＤＮＡ断片の生成および本発明の方法のための
反応成分からなる混合物は、場合によりＮＭＰ（１−メ
チルー２―ピロロリジノン）、グリセロール、ポリ（エ
チレングリコール）、ポリアミン類、ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）および／またはホルムアミドを含んで
もよい。そのような有機溶媒の含有はオリゴヌクレオチ
ドプライマーの非特異的なアニーリングを軽減するか、
あるいは２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの変性を促進す
る助けとなると信じられている。さらに国際公開パンフ
レット第９９／５４４５５号記載のような酸性物質ある
いは陽イオン錯体を含んでも良い。

【００４８】この方法に有用なＤＮＡポリメラーゼは、
５’から３’方向に伸長を開始するものを含む。該ＤＮ
Ａポリメラーゼは新たにアニーリングしたプライマーの
下流からの伸長鎖生成に従い、置換もすべきであり、そ
して重要なことはあらゆる５’→３’エキソヌクレアー
ゼ活性を欠いているべきである。さらに、２本鎖ＤＮＡ
の ５’末端側の水素結合を緩やかにし、新たに核酸伸
長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを潜
り込み易くして、該プライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な
部分にアニーリングさせるような機能を有するようなＤ
ＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。また、該機能を
有しないＤＮＡポリメラーゼを使用し、２本鎖ＤＮＡの
５’末端側の水素結合を緩やかにし、新たに核酸伸長
反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを潜り
込み易くして、該プライマーが鋳型ＤＮＡの相補的な部
分にアニーリングするような作用を有する物質を共存さ
せても良い。ＤＮＡ ポリメラーゼとしては、例えば、
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片およびＤＮＡポリ
メラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ断片、Ｂ
ｓｔポリメラーゼ由来の同様の断片（バイオラッド社、
リッチモンド、ＣＡ）、Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が有用である。シ
ークエネース１．０およびシークエネース２．０（米国
バイオケミカル社）、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ
２９ＤＮＡポリメラーゼも使用することができる。通常
エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、適切
なブロッキング剤の添加により当該活性がブロックされ
る場合は、本発明のＤＮＡ合成方法に使用できる。

【００４９】本発明のＤＮＡ合成方法のさらなる特徴
は、合成において温度を上げ下げする必要がないこと、
即ち等温での核酸配列の合成方法を提供する点にある。
即ち、本発明の方法においては、変性後に単一の温度を
使用することができる。非特異的な結合を最少にするた
めに反応温度を十分に高く、しかし鋳型となる核酸配列
にプライマーが結合する時間を最少にするように反応温
度を十分に低く、ストリンジェンシーのレベルを設定す
べきである。さらに、適当な温度により酵素活性を十分
に保護すべきである。このため、該温度は、好ましく
は、約２０℃から約７０℃であり、さらに好ましくは、
約３５℃から約６５℃にするのがよい。

【００５０】本発明のＤＮＡ合成方法において、既に一
本鎖にされている鋳型ＤＮＡに対し、オリゴヌクレオチ
ドプライマーが特異的に結合し、そしてＤＮＡポリメラ
ーゼ、デオキシヌクレオチド３リン酸の存在下において
オリゴヌクレオチドプライマーから鋳型となる核酸配列
の長さに従い、該プライマー配列を通って伸長合成され
る。次に、２本鎖ＤＮＡの ５’末端側の水素結合を緩
やかにし、新たに核酸伸長反応に用いられるオリゴヌク
レオチドプライマーを潜り込み易くして、該プライマー
が鋳型ＤＮＡの相補的な部分にアニーリングさせるよう
な機能を有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠
くＤＮＡポリメラーゼの存在下において、新たに伸長反
応に使用されるプライマーの３’末端から伸長合成さ
れ、２本鎖ＤＮＡの部分的に１本鎖になった部位から鋳
型に相補的な核酸配列を伸長しながら１本鎖ＤＮＡを解
離させていく。この結果、新しいプライマー伸長鎖が合
成される。２種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用
する場合は、遊離した置換鎖も本発明の方法の鋳型にな
りうる。

【００５１】本発明の方法を用いて、２本鎖ＤＮＡを鋳
型とし、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（イ及び
ロとする）を使用した場合は、鋳型となる２本鎖ＤＮＡ
を２種類の相補的な１本鎖ＤＮＡ（Ａ鎖及びＢ鎖）に変
性する前処理をした後に下記の各工程が連続して起こ
る。 （ａ）上記のＡ鎖１本鎖ＤＮＡを鋳型となる核酸配列と
して少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー
（イ）により処理して、該核酸配列の鎖に相補的なプラ
イマーの伸長生成物を合成し、； （ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、新たに伸長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプ
ライマー（イ）がアニーリングし、； （ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ａ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｂ）の工程に再度利用され、； （ｄ）上記工程で得られる遊離した置換鎖Ｃ鎖を鋳型と
して（ａ）で使用されたプライマーと異なるプライマー
（ロ）により処理して、Ｃ鎖に相補的なプライマーの伸
長生成物を合成し、； （ｅ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、新たに伸長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプ
ライマー（ロ）がアニーリングし、； （ｆ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ｃ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｅ）の工程に再度利用され、； （ｇ）上記の鋳型となるもう一方の１本鎖ＤＮＡのＢ鎖
については、Ｂ鎖１本鎖ＤＮＡを鋳型となる核酸配列と
して（ａ）で使用されたオリゴヌクレオチドと異なるプ
ライマー（ロ）により処理して、該核酸配列の鎖に相補
的なプライマーの伸長生成物を合成し、； （ｈ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、新たに伸長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプ
ライマー（ロ）がアニーリングし、； （ｉ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ｂ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｈ）の工程に再度利用され、； （ｊ）上記工程で得られる遊離した置換鎖Ｄ鎖を鋳型と
して（ｇ）で使用されたプライマーと異なるプライマー
（イ）により処理して、Ｄ鎖に相補的なプライマーの伸
長生成物を合成し、； （ｋ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
鎖の ５’末端から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
し、新たに伸長反応に用いられるオリゴヌクレオチドプ
ライマー（イ）がアニーリングし；そして （ｌ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
端側から、Ｄ鎖に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、新
たにアニーリングしたプライマーの伸長鎖を含む２本鎖
核酸が（ｋ）の工程に再度利用される。

【００５２】また、本発明の方法において、逆転写酵素
活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳ
Ｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用すると鋳型となるＲＮＡ
からｃＤＮＡを調製する工程を含む核酸配列の増幅方法
として好適に使用できる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを
調製する工程を独立させて行い、その生成物を本発明の
方法に使用することもできる。いずれの場合において
も、本発明の方法においては、鎖置換において置換合成
する反応を停止させるかまたは試薬のうちの一つが使い
尽くされるかのいずれかまで繰り返される。

【００５３】本発明の方法を使用することにより、ＤＮ
Ａチップに固定するための１本鎖ＤＮＡ、塩基配列決定
のための一本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法の
ためのメガプライマーを容易にしかも短時間に作製する
ことができる。例えば、本発明の方法を使用することに
より、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみ
を選択して増幅させることが可能である。従って、セン
ス配列あるいはアンチセンス配列製造方法としても有用
である。上記目的のために本発明の方法においては、１
つのオリゴヌクレオチドプライマー、あるいは２つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用する場合のいずれの
場合においても作製できるが、例えば、２つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いる場合は、一方のオリゴヌ
クレオチドプライマー量を他方の量に対して過剰にして
増幅反応を行なう、いわゆるアシンメトリック（非対
称）−ＰＣＲ法において採用される方法と同様のプライ
マー比率によって行なうことができる。この結果、一方
の鎖を置換した産物の量が、他方の鎖を置換した産物の
量に比べて過剰になる。

【００５４】さらに本発明の方法を用いれば、大容量の
反応を行うことができるため、上記センス鎖またはアン
チセンス鎖のような１本鎖ＤＮＡ、あるいは２本鎖ＤＮ
Ａの工業的大量製造が可能である。

【００５５】そして本発明の方法により得られた増幅物
の存在は、多くのあらゆる方法により検出できる。一つ
の方法は、ゲル電気泳動による特定のサイズの反応産物
の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロ
マイド等の蛍光物質により検出できる。他の方法として
は、ビオチンのような物理的な標識を用いた標識ヌクレ
オチドの使用を含む。そして増幅産物中のビオチンは、
蛍光標識されたアビジンあるいは、ペルオキシダーゼの
ような酵素に結合したアビジンによる検出方法に用いる
ことができる。

【００５６】本発明はさらに、上述の方法により生じた
反応産物の分離法および／または検出法に関する。この
分離法は、磁気的な分離、膜による捕捉および固形支持
体上での捕捉を含む。各方法において、捕捉モイエティ
は磁気ビーズ、膜または固形支持体に結合される。そし
てビーズ、膜または固形支持体について、反応産物の存
在または不在をアッセイできる。捕捉モイエティの例
は、生成された反応産物に相補的な核酸配列およびプラ
イマーまたは反応産物に取り込まれるリセプターに対す
る抗体を含む。分離系は検出系と連動していてもしてい
なくてもよい。

【００５７】本発明の実施において有用である検出系
は、分離を要しない均一な系（ホモジニアスシステム）
および不均一な系（ヘテロジニアスシステム）等が挙げ
られる。各系において、ひとつまたは複数の検出マーカ
ーが使用され、好ましくは自動化された方法により、検
出系からの反応または放射が監視される。均一な系の例
は、蛍光偏光、酵素を介するイムノアッセイ、蛍光エネ
ルギー転移、ハイブリダイゼーション保護（例えばアク
リジニウムルミネッセンス）およびクローン化された酵
素のドナーイムノアッセイを含む。不均一な系の例は、
酵素標識（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼおよびベータ−ガラクトシダーゼ）、蛍光標識
（例えば酵素標識および直接の蛍光標識［例えばフルオ
レセインおよびローダミン］）、ケミルミネッセンスお
よびバイオルミネッセンスを含む。リポソームまたは他
の袋状粒子も染色剤または他の検出可能なマーカーによ
り満たされて、そのような検出系において使用されう
る。これらの系において、検出可能なマーカーは直接ま
たは間接に捕捉モイエティに結合でき、また反応産物
は、リガンドにより認識されうるレセプターの存在下に
おいて生成することができる。

【００５８】本発明の方法では、特定のサーマルサイク
ラーを必要とせず、オリゴヌクレオチドプライマーを１
種類もしくは２種類と従来法より使用数を少なくするこ
とができ、使用する塩基もＰＣＲ等で用いられるものを
流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低く
することができる。そのため、ルーチンワークを行なっ
ている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。

【００５９】本発明において増幅されたＤＮＡ断片は、
通常の塩基により構成されるためＤＮＡ増幅後、増幅断
片内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブク
ローニングすることができる。さらにＲＦＬＰのような
制限酵素を用いた処理をすることも問題なくでき、遺伝
子検査の分野においても広く利用できる。また、本発明
において増幅されたＤＮＡ断片は、通常の塩基により構
成されるため、増幅断片中にＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を組込んでおけば、増幅断片から直接ＲＮ
Ａを合成することができ、それは、ＲＮＡプローブとし
て使用可能である。

【００６０】さらに、本発明においては、通常の塩基の
代わりに蛍光標識された塩基を使用することができ、容
易に蛍光標識されたＤＮＡプローブを作製することがで
きる。

【００６１】本発明の方法により増幅された１本鎖ＤＮ
Ａは、ＤＮＡチップ上に固定するＤＮＡ断片として好適
に使用できる。即ち、本発明の方法は、ＤＮＡチップ作
製において固定化するＤＮＡ鎖を調製する方法として好
適に使用できる。

【００６２】本発明の方法において、最終的に増幅され
る断片は、その両端に増幅に使用するプライマーに相補
的な塩基配列を有さないため、増幅産物の持ち込みによ
るコンタミネーションを軽減させることができる。従っ
て、ルーチンワークで同じ領域を増幅する遺伝子検査等
において有用である。

【００６３】

【実施例】本発明を実施例により更に具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例によって限定されるもので
はない。

【００６４】実施例１ 本発明の増幅方法について種々のプライマーを用いて検
討した。本実施例以降に用いられるプライマーは、配列
表の配列番号をもとにＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社）を用い
て合成した。また、鋳型としてｐＵＣ１９プラスミドＤ
ＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化したものを使用し
た。；配列表の配列番号１及び２記載のｐＵＣ１９ｕｐ
ｐｅｒ１５０プライマー、ｐＵＣ１９ｌｏｗｅｒ ＮＮ
プライマーを使用した。該プライマーの詳細な構造を以
下に示す。

【００６５】プライマー対１：配列表の配列番号１及び
２に示される塩基配列を有し、その全体がすべてデオキ
シリボヌクレオチドで構築されたプライマーの組み合わ
せ。 プライマー対２：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端の１塩基がリボヌクレオチドに置換され
たプライマーの組み合わせ。 プライマー対３：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端２塩基がリボヌクレオチドに置換された
プライマーの組み合わせ。 プライマー対４：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置換された
プライマーの組み合わせ。

【００６６】反応液組成を以下に示す。；２７ｍＭ リ
ン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．３）、０．０１％
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ ＤＭＳＯ、各１ｍ
Ｍ ｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ 酢酸マグネシウム、それぞ
れ６０ｐｍｏｌの上記のプライマー対及び１ｎｇの鋳型
ＤＮＡ、及び滅菌蒸留水で反応液容量を４８μｌにし
た。

【００６７】上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、２２ＵのＢｃａＢＥＳＴ
ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、９０℃、２分間加熱し
て酵素を失活させた。各反応液５μｌを４％ ヌシーブ
３：１ アガロースゲル（宝酒造社製）にて電気泳動を
行なった。

【００６８】その結果、上記のいずれのプライマー対に
おいても、目的の約１５０ｂｐの増幅断片が得られるこ
とが確認できた。

【００６９】実施例２ 本発明の増幅方法について種々のプライマーを用いて検
討した。ｐＵＣ１９ベクターＤＮＡを鋳型とし、配列表
の配列番号１及び２に示される塩基配列を有し、その全
体がすべてデオキシリボヌクレオチドで構築されたプラ
イマーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（Ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、
ＰＣＲ）によって得られたフラグメントをｐＵＣ１９ベ
クターのＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングして得られ
た該プラスミドＤＮＡを鋳型として使用した。；配列表
の配列番号３、４、５および６記載のＭ１３-Ｍ４プラ
イマー、Ｍ１３−ＲＶプライマー、Ｍ１３−２０プライ
マー、ＲＶ−Ｐプライマーを使用した。該プライマーの
詳細な構造を以下に示す。

【００７０】プライマー対１：配列表の配列番号３及び
４に示される塩基配列を有し、その全体がすべてデオキ
シリボヌクレオチドで構築されたプライマーの組み合わ
せ。 プライマー対２：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端の２塩基がリボヌクレオチドに置換され
たプライマーの組み合わせ。 プライマー対３：プライマー対１のプライマーの、それ
ぞれの３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置換された
プライマーの組み合わせ。 プライマー対４：配列表の配列番号５及び６に示される
塩基配列を有し、それぞれの３’末端の２塩基がリボヌ
クレオチドに置換されたプライマーの組み合わせ。 プライマー対５：プライマー対４のプライマーの、それ
ぞれの３’末端３塩基がリボヌクレオチドに置換された
プライマーの組み合わせ。

【００７１】反応液組成を以下に示す。；反応液１とし
て、それぞれ３０ｐｍｏｌの上記のプライマー対及び２
０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、及び滅菌蒸留水で反応液容量を５
μｌにした。反応液２として、２８ｍＭ リン酸カリウ
ムバッファー（ｐＨ７．５）、０．０１％ ＢＳＡ（牛
血清アルブミン）、１％ ＤＭＳＯ、各０．５ｍＭ ｄＮ
ＴＰ混合物、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５．５ＵのＢ
ｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、および滅菌蒸留水
で反応液容量を２０μｌにした。

【００７２】上記反応液１を９８℃、２分間熱変性処理
後、５５℃に冷却した。次に、反応液２を添加し、５５
℃、６０分間保持した。その後、４℃に冷却し、０．５
ＭＥＤＴＡを２．５μｌ加えて反応を停止した。各反応
液５μｌを４％ ヌシーブ ３：１ アガロースゲルにて
電気泳動を行なった。

【００７３】その結果、プライマー対１、２、３では、
目的の約２７０ｂｐの増幅断片が、プライマー対４、５
では、約２６０ｂｐの増幅断片が得られることが確認で
きた。

【００７４】

【発明の効果】以上のように、本発明の方法によりＤＮ
ＡもしくはＲＮＡを鋳型として、等温条件下で連続して
ＤＮＡを合成することができる。従って、該方法では、
特別なサーマルサイクラーを必要とせず、温度設定に要
する時間も必要ないため短時間で増幅産物を得られると
いう優れた効果を奏する。さらに、該方法で短時間に増
幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素消化することができる
ため、制限酵素長多型や変異検出等の遺伝子検査の領域
において有用である。また、該増幅ＤＮＡ断片は、ＲＮ
Ａプローブ調製のための鋳型として使用できる等の遺伝
子工学の領域においても有用である。

【００７５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> A method for amplification of nucleotide sequence <130> T-1448 <160> 6 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gataacactg cggccaactt acttc 25 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gttttcccag tcacgac 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 caggaaacag ctatgac 17 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cgacgttgta aaacgacggc cagt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggaaacagct atgaccatga ttac 24

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三宅 一恵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 上森 隆司 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 佐藤 好美 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 大川 麻里子 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 浅田 起代蔵 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA01 CA11 HA08 HA19 4B063 QA08 QA13 QA17 QA18 QQ03 QQ16 QQ18 QQ19 QQ42 QQ52 QR08 QR23 QR32 QR35 QR48 QR50 QR62 QS10 QS12 QS24 QS36

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸配列を増幅するための方法であっ
   て、 （ａ）鋳型となる核酸配列の鎖を少なくとも１種類のオ
   リゴヌクレオチドプライマーにより処理して、該核酸配
   列の鎖に相補的なプライマーの伸長生成物を合成し、こ
   こで前記プライマーは、鋳型となる核酸配列に実質的に
   相補的であって； （ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
   鎖の５’末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
   し、そこに上記（ａ）で使用されたプライマーと同じ塩
   基配列を有する新たに伸長反応に用いられるオリゴヌク
   レオチドプライマーがアニーリングし； （ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
   端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、再
   生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の
   工程に再度利用される；ことを含んでなる核酸配列の増
   幅方法。
2. 【請求項２】 核酸配列を増幅するための方法であっ
   て、 （ａ）鋳型となる核酸配列の鎖を２種類のオリゴヌクレ
   オチドプライマーのうちの１つにより処理して、該核酸
   配列の鎖に相補的なプライマーの伸長生成物を合成し、
   ここで前記プライマーは、鋳型となる核酸配列に実質的
   に相補的であって； （ｂ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
   鎖の ５’末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
   し、そこに上記（ａ）で使用されたプライマーと同じ塩
   基配列を有する新たに伸長反応に用いられるオリゴヌク
   レオチドプライマーがアニーリングし； （ｃ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
   端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、再
   生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｂ）の
   工程に再度利用され、； （ｄ）上記工程で得られる遊離した置換鎖を鋳型として
   （ａ）で使用されたプライマーと異なるオリゴヌクレオ
   チドプライマーにより処理して、置換鎖に相補的なプラ
   イマーの伸長生成物を合成し、ここで前記プライマー
   は、置換鎖の一本鎖に実質的に相補的であって； （ｅ）上記工程で得られる２本鎖核酸のプライマー伸長
   鎖の ５’末端側から２本鎖ＤＮＡを部分的に１本鎖に
   し、そこに上記（ｄ）で使用されたプライマーと同じ塩
   基配列を有する新たに伸長反応に用いられるオリゴヌク
   レオチドプライマーがアニーリングし；そして （ｆ）上記工程でアニーリングしたプライマーの３’末
   端側から、鋳型に相補的な核酸配列の鎖置換を行い、再
   生されたプライマー伸長鎖を含む２本鎖核酸が（ｅ）の
   工程に再度利用される；ことを含んでなる核酸配列の増
   幅方法。
3. 【請求項３】 鋳型となる核酸配列がＤＮＡ配列である
   請求項１又は請求項２記載の核酸配列の増幅方法。
4. 【請求項４】 ２本鎖ＤＮＡを２種類の相補的な１本鎖
   ＤＮＡに変性する前処理をしたものを鋳型として用いる
   ことを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の核酸配列
   の増幅方法。
5. 【請求項５】 等温で行うことを特徴とする請求項１〜
   ４いずれか記載の核酸配列の増幅方法。
6. 【請求項６】 さらに、工程（ａ）の前にＲＮＡを鋳型
   として、逆転写酵素による逆転写反応により１本鎖のｃ
   ＤＮＡを調製する工程を含み、該１本鎖のｃＤＮＡを鋳
   型となる核酸配列とすることを特徴とする請求項１〜５
   いずれかに記載の核酸配列の増幅方法。
7. 【請求項７】 逆転写酵素が、トリ骨髄芽球症ウイルス
   由来のＡＭＶ ＲＴａｓｅ，モロニーネズミ白血病ウイ
   ルス由来のＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ、モロニーネズミ白血
   病ウイルス由来逆転写酵素であってＲＮａｓｅＨ活性の
   欠失した変異体であるSuperscript II^TM及びラウス関連
   ウイルス２由来のＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅからなる群か
   ら選択される逆転写酵素であることを特徴とする請求項
   ６記載の核酸配列の増幅方法。
8. 【請求項８】 逆転写酵素が、耐熱性を有するＤＮＡポ
   リメラーゼであることを特徴とする請求項６記載の核酸
   配列の増幅方法。
9. 【請求項９】 逆転写酵素が、サーマス サーモフィラ
   ス由来のＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈ ＤＮＡポリ
   メラーゼ、バチルス ステアロサーモフィラス由来の
   ５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラ
   ーゼ、もしくは、バチルス カルドテナックス由来の5'
   →３'エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラー
   ゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメラーゼである
   ことを特徴とする請求項８記載の核酸配列の増幅方法。
10. 【請求項１０】 核酸配列を増幅するための方法であっ
    て、（ａ）デオキシヌクレオチド３リン酸、鎖置換能を
    有するＤＮＡポリメラーゼ、及び少なくとも１種類の鋳
    型となる核酸配列の一本鎖に実質的に相補的なオリゴヌ
    クレオチドプライマーを鋳型となる核酸配列と混合し；
    そして（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応
    混合物を反応させる、ことを特徴とする核酸配列の増幅
    方法。
11. 【請求項１１】 プライマーからの伸長が、鎖置換能を
    有するＤＮＡポリメラーゼにより行われることを特徴と
    する請求項１０記載の核酸配列の増幅方法。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌由来の
    ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステ
    アロサーモフィラス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ
    欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、及びバチルス カルド
    テナックス由来の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃ
    ａポリメラーゼからなる群より選択されるＤＮＡポリメ
    ラーゼであることを特徴とする請求項１１記載の核酸配
    列の増幅方法。
13. 【請求項１３】 ２種類のオリゴヌクレオチドプライマ
    ーを含有してなる請求項１０〜１２いずれかに記載の核
    酸配列の増幅方法。
14. 【請求項１４】 鋳型となる核酸配列が、一本鎖ＤＮ
    Ａ、２本鎖ＤＮＡ由来のそれぞれの１本鎖、またはＲＮ
    Ａから逆転写反応によって得られたｃＤＮＡからなる群
    より選択される核酸配列であることを特徴とする請求項
    １０〜１３いずれかに記載の核酸配列の増幅方法。