CN101591712A - 核酸的碱基序列的识别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种简便且迅速地利用核酸扩增方法来识别2种核酸的碱基序列的差异的方法。该识别核酸的碱基序列的差异的方法是利用在实质上等温下进行的核酸扩增法来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异的方法，其特征在于，使用(1)与第一核酸实质上互补的至少一种寡核苷酸(以下为引物)和(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸(以下为屏蔽寡核酸)，该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交。

Description

核酸的碱基序列的识别方法
技术领域
本发明涉及一种核酸的碱基序列的识别方法。更具体而言，本发明涉及一种利用核酸扩增法来进行在标本中的DNA中含有的特定的序列的检测、基因的多态性的检测及1碱基多态(SNPs)的分析等的方法。
背景技术
人们正在积极地利用从基因组(genome)分析研究获得的成果，将基因多态等基因组信息应用到医疗领域。
例如，1碱基多态(SNPs)被认为是在1000个碱基中存在1个，人们认为这些SNPs是产生各个体差、个人的特性或先天体质差异的原因之一。而且，目前逐渐明确了如下结论，即：主要因素基因作为危险因素参与本来被认为环境因素的作用的比例较高的疾病(糖尿病或高血压症等)，其中的大多数被确定为1碱基多态。而且，人们还认为SNPs分析会有助于按照个人的体质进行给药或治疗(TaylorMade医疗)，因而备受瞩目。
另一方面，HCV、流感病毒(influenza virus)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)等细菌或病毒的亚型(subtype)也被认为是一种多态，而各种药剂的治疗效果由于这些亚型的不同而不同。因而，对这种病毒等的多态的检测还会给治疗方法的选择提供重要的信息。
作为识别核酸的碱基序列的方法，已知使用设计成具有与应检测的序列互补的序列的引物，进行利用DNA聚合酶的核酸扩增反应的方法。
作为核酸的扩增方法，聚合酶链反应(PCR)已被广泛地认识。在PCR法中，为了使作为目的的目标核酸序列扩增，包括以下3个工序，即：将作为模板的两条链DNA变性成一条链DNA的工序(变性工序)；使引物在一条链DNA上退火的工序(退火工序)；以及，以引物为起点延长互补链的工序(延长工序)。在普通的PCR法中，使用基因扩增仪(thermalcycler)，在分别不同的温度下进行变性工序、退火工序、延长工序。但是，为了在3种不同的温度下进行核酸扩增反应而必需进行精密的温度控制，从而难以用小型的装置简便地进行检查。另外，还存在时间的浪费与循环数成比例地增大的问题。
因此，开发出了可以在等温状态下实施的核酸扩增反应。例如可以举出RCA(滚环扩增技术(Rolling Circle Amplification)：Proc.Nat.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995))、SDA法(链置换扩增(Strand DisplacementAmplification)；特开平5-130870号)、ICAN(等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids))、LAMP(环介导等温DNA扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA)；Bio Industry，第18卷、2号(2001))、NASBA(基于核酸序列的扩增技术(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)；Nature，350，91～(1991))、TMA(转录介导扩增技术(Transcription mediated amplification method)；J.Clin Microbiol.第31卷、3270～(1993))等。
但是，这些方法还存在如下问题，即：如果必需与聚合酶一起使用核酸外切酶、RNAseH或逆转录酶等或者必需特殊的引物，则增加了成本，同时引物设计也非常困难。
在特开2002-233379号公报中记载了在具有链置换能的DNA聚合酶的存在下，利用至少1组寡核苷酸引物，利用等温下的反应来扩增成为目的的区域的DNA的方法。但是，在特开2002-233379号公报中记载的方法中，存在必需较长的反应时间等问题。
进而，作为利用核酸扩增反应来识别核酸的碱基序列时的共同的问题，可以举出在引物与目标序列不完全互补的情况下，也常常发生扩增反应(非特异扩增)。例如，在为1碱基多态的识别的情况下，识别对象的核酸与非识别对象的核酸的差异只有1个碱基，所以该问题变得显著。由于非特异扩增的发生与否受到机器或周围的环境等微妙的条件左右，所以难以抑制非特异扩增。
非专利文献1：Proc.Natl.Acad.Sci.vol.92，4641～4645(1995)
非专利文献2：Bio Industry，第18卷、2号(2001)
非专利文献3：Nature，350，91～(1991)
非专利文献4：J.Clin Microbiol.第31卷、3270～(1993)
专利文献1：特开平5-130870号公报
专利文献2：特开2002-233379号公报
发明内容
本发明想要解决的课题是提供一种利用在等温状态下特异地扩增核酸序列的方法来精密度良好地识别核酸序列的方法。进而还想解决的课题是利用更简单的引物设计来实现该课题。
本发明人等发现通过使用与第一核酸实质上互补的至少一种寡核苷酸(以下为引物)和被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸(以下为屏蔽寡核酸)，进而该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交，可以利用等温扩增法，简便且迅速地、精密度良好地识别2种核酸的碱基序列的差异。
进而，本发明人等还发现通过在含有脱氧核苷酸3磷酸、具有链置换能的DNA聚合酶、2价的阳离子、表面活性剂、寡核苷酸引物及成为模板的核酸片断的反应溶液中进行扩增反应，则可以利用像在过去的等温扩增法中使用的没有复杂结构的寡核苷酸引物(不必具有采取例如像在ICAN法中使用的嵌合(chimera)结构或在LAMP法中使用的环(loop)结构之类的结构。)在等温状态下特异地扩增核酸序列，以至完成本发明。
即，如果利用本发明，则可以提供一种识别核酸的碱基序列的差异的方法，其是利用在实质上等温下进行的核酸扩增法来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异的方法，其特征在于，使用(1)与第一核酸实质上互补的至少一种寡核苷酸(以下为引物)和(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸(以下为屏蔽寡核酸)，该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交。
优选与引物和屏蔽寡核酸的二者杂交的第一核酸及第二核酸上的区域与引物的包括3’末端的区域杂交。
优选与引物和屏蔽寡核酸的二者杂交的第一核酸及第二核酸上的区域与屏蔽寡核酸的包括5’末端的区域杂交。
优选引物相对第一核酸比相对第二核酸更互补。
优选引物被设计成只在3’末端的连续的区域与第一核酸或第二核酸杂交。
优选第一核酸与第二核酸存在单碱基多态的关系。
优选使用至少两种引物，这至少两种引物被设计成彼此与DNA两条链的不同链互补，而且在与DNA链上的自身相同的序列的3’末端侧存在的区域，另一方寡核苷酸引物成为互补。
优选培养内含至少1种脱氧核苷酸3磷酸、具有至少1种链置换能的DNA聚合酶及成为模板的核酸片断的反应溶液，进行以上述引物的3’末端为起点的聚合酶反应，从而扩增该核酸片断，由此识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。
优选利用扩增速度的差来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。
优选反应溶液进一步含有至少0.01％以上的表面活性剂。
更优选反应溶液进一步含有至少0.05％以上的表面活性剂。
优选表面活性剂为非离子性表面活性剂。
优选非离子性表面活性剂的HLB值为12以上。
更优选非离子性表面活性剂的HLB值为14以上。
优选非离子性表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系或聚氧化乙烯烷基醚系的表面活性剂。
更优选非离子性表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐一脂肪酸酯。
进而优选非离子性表面活性剂由以下式表示。
Figure A20091020285200091
(式中，x+y+z+w＝20，R：表示碳原子数12～18的烷基。)
优选非离子性表面活性剂为聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯的任意1种。
优选反应溶液进一步含有2价的阳离子。
优选反应溶液进一步含有熔解温度调节剂。
优选具有至少1种链置换能的聚合酶为从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)来源的5’→3’核酸外切酶缺损Bst.DNA聚合酶、及卡都特纳芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)来源的5’→3’核酸外切酶缺损BcaDNA聚合酶、Thermococcus litoralis来源的5’→3’核酸外切酶缺损Vent.DNA聚合酶中选择的聚合酶。
优选在实质上等温下培养反应溶液。
优选在50℃以上100℃以下的实质上等温下培养反应溶液。
优选在等温下培养反应溶液的时间为60分钟以内。
如果利用本发明，则可以利用核酸扩增方法，简便且迅速地、精密度良好地识别2种核酸的碱基序列的差异。更具体而言，可以在屏蔽寡核酸的存在下抑制引物的非特异扩增，精密度更高地利用扩增反应确定核酸的碱基序列。
附图说明
图1表示在将3’末端磷酸化寡DNA用作屏蔽寡核酸时的β3AR190(T/C)的变异检测的结果。
图2表示在将RNA用作屏蔽寡核酸时的β3AR190(T/C)的变异检测的结果。
图3表示在不使用屏蔽寡核酸时的β3AR190(T/C)的变异检测的结果。
图4表示在实施例中使用的正向引物(forward primer)、反向引物(reverse primer)、屏蔽寡核酸的位置关系。
具体实施方式
以下更详细地说明本发明。
本发明的识别核酸的碱基序列的差异的方法是利用在实质上等温下进行的核酸扩增法来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异的方法，其特征在于，使用(1)与第一核酸实质上互补的至少一种寡核苷酸(以下为引物)和(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸(以下为屏蔽寡核酸)，该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交。
如果利用本发明的优选方式，则通过使用(1)与第一核酸实质上互补、与第二核酸不互补的至少一种寡核苷酸(以下为引物)和(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸(以下为屏蔽寡核酸)，设计成该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交，通过培养内含至少1种脱氧核苷酸3磷酸、具有至少1种链置换能的DNA聚合酶及成为模板的核酸片断的反应溶液来进行核酸扩增反应，由此可以识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。其中，第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异可以利用扩增速度的差来识别。
以下对在本发明中使用的成分进行说明。
(1)脱氧核苷酸3磷酸
作为延长反应的底物，使用脱氧核苷酸3磷酸。具体而言，优选使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物。作为脱氧核苷酸3磷酸，也可以包括dNTP的类似物(analog)(例如7-deaza-dGTP等)。
另外，脱氧核苷酸3磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP混合物)的最终浓度分别为0.1mM～3.0mM的范围，优选为0.75mM～3.0mM的范围，进而优选为1.0mM～2.0mM的范围，特别优选为1.0mM～1.5mM的范围。
(2)具有链置换能的聚合酶
在本发明中，使用具有链置换能的聚合酶。在本说明书中，“链置换能”是指在按照成为模板的核酸序列进行DNA复制时，与DNA链的置换同时进行，使退火的互补链从模板链上游离，即能够进行链置换(stranddisplacement)的活性。作为具有链置换能的聚合酶的具体例，可以举出嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的5’→3’核酸外切酶缺损Bst.DNA聚合酶、及卡都特纳芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)来源的5’→3’核酸外切酶缺损Bca DNA聚合酶、Thermococcus litoralis来源的5’→3’核酸外切酶缺损Vent.DNA聚合酶等，但不限定于这些。具有链置换能的聚合酶可以为天然来源的聚合酶，也可以为利用基因工程制造的重组蛋白质。
(3)2价的阳离子
在本发明中，可以对应使用的酶的金属要求性等，使用2价的阳离子。作为2价的阳离子，可以使用镁盐或其他金属盐，例如可以使用氯化镁、乙酸镁、硫酸镁等。2价的阳离子的浓度的最终浓度优选为1mM～20mM的范围，进而优选为2mM～10mM的范围。
(4)表面活性剂
在本发明中，在反应溶液中添加表面活性剂。通过使用表面活性剂，可以实现被称为防止非特异的核酸的扩增的本发明的有利效果。对可以在本发明中使用的表面活性剂的种类，没有特别限定，可以使用烷基苯磺酸盐、月桂基硫酸酯盐(SDS)、磺基琥珀酸辛酯盐、硬脂酸肥皂等阴离子(anion)性表面活性剂，山梨糖醇酐脂肪酸酯、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween等)、POE烷基醚(Brij等)、POE烷基苯基醚(Triton等)、壬基苯酚、月桂醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷·聚环氧丙烷嵌段聚合物、POE烷基胺、POE脂肪酸联苯基醚等非离子(nonion)性表面活性剂、氯化鲸蜡基吡啶、月桂基二甲基苄基氯化铵、硬脂酰基三甲基氯化铵之类的阳离子(cation)性表面活性剂，还有烷基二甲基氧化胺、烷基羧基甜菜碱之类的双性(两性)表面活性剂等。表面活性剂的使用量只要能够实现本发明的效果即可，没有特别限定，优选0.01％以上，更优选0.05％以上，更优选0.1％以上。对表面活性剂的使用量的上限没有特别限定，通常为10％以下，优选为5％以下，更优选为1％以下。
在表面活性剂中，特别优选使用非离子性表面活性剂。在非离子性表面活性剂中，优选亲水性更强的表面活性剂，如果用HLB值表示，则优选为12以上。更优选为14以上，上限可以优选使用至20。进而优选为17以下，更优选为14以上17以下。在结构上，优选从聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系、聚氧化乙烯烷基醚系中选择。进而，在聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯中，优选脂肪酸酯只有一种。例如可以由以下结构式表示。
Figure A20091020285200121
(式中，x+y+z+w＝20，R：表示碳原子数12～18的烷基。)
对烷基的位置没有特别限定，也可以优选使用如下所示的结构。
Figure A20091020285200122
x+y+z+w＝20
R：碳原子数12～18的烷基
Figure A20091020285200131
x+y+z+w＝20
R：碳原子数12～18的烷基
Figure A20091020285200132
x+y+z+w＝20
R：碳原子数12～18的烷基
作为这样的表面活性剂，物质名为聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非离子性表面活性剂可以举出聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯等。可以举出(商品名：Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)的表面活性剂。另外，对使用量也没有特别限定，优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上，更优选为0.1％以上。在本发明中，也可以在反应溶液中添加表面活性剂。通过使用表面活性剂，有时可以实现防止非特异的核酸的扩增之类的效果。对可在本发明中使用的表面活性剂的种类没有特别限定，可以使用烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、磺基琥珀酸辛酯盐、硬脂酸肥皂等阴离子(anion)性表面活性剂，蔗糖脂肪酸酯山梨糖醇酐脂肪酸酯、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、脂肪酸烷醇酰胺、POE烷基醚(Brij35、Brij58等)、POE烷基苯基醚(TritonX-100、TritonX-114、NonidetP40等)、壬基苯酚、月桂醇、聚乙二醇、聚环氧乙烷·聚环氧丙烷嵌段聚合物、POE烷基胺、POE脂肪酸联苯基醚等非离子(nonion)性表面活性剂，还有氯化鲸蜡基吡啶鎓、月桂基二甲基苄基氯化铵、硬脂酰基三甲基铵氯化物之类的阳离子(cation)性表面活性剂等。表面活性剂的使用量只要能够实现本发明的效果即可，没有特别限定，优选0.01％以上，更优选为0.05％以上，更优选为0.1％以上。对表面活性剂的使用量的上限没有特别限定，通常为10％以下，优选为5％以下，更优选为1％以下。
在表面活性剂中，优选使用非离子性表面活性剂。其中，特别优选使用POE山梨糖醇酐脂肪酸酯系、POE烷基酚醚系、POE烷基醚系的任意一种。如上所述，对非离子性表面活性剂的种类没有特别限定，对使用量也没有特别限定，优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上，更优选为0.1％以上。
(5)寡核苷酸
(a)寡核苷酸引物
在本发明中，寡核苷酸引物的定义如下：具有通过对成为模板的DNA退火而DNA链在DNA聚合酶的作用下从其3’末端延长的性质的寡核苷酸。作为在本发明中使用的寡核苷酸引物，可以使用由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的寡核苷酸引物，进而也可以为内含修饰核糖核苷酸或修饰脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸引物。
在本发明中，使用与第一核酸互补的至少1种寡核苷酸引物。更优选使用与第一核酸互补但不与第二核酸互补的至少1种寡核苷酸引物。进而优选使用包括与第一核酸互补但不与第二核酸互补的至少1种寡核苷酸引物的2种寡核苷酸引物(1组寡核苷酸引物对(set))。在此使用的1组寡核苷酸引物对是指被设计成彼此与DNA两条链的不同链互补，而且在与DNA链上的自身相同的序列的3’末端侧存在的区域，另一方寡核苷酸引物成为互补(被设计成在与自身互补的序列的5’末端侧的区域，存在与另一方寡核苷酸引物相同的序列)的至少2种寡核苷酸引物的组合。
进而，上述寡核苷酸引物不必需像在以往的等温扩增反应中使用的复杂的设计。可以使用在普通的PCR反应中使用的至少一组以上的引物进行等温扩增反应是本发明的一个较大的特征。具体而言，这些引物不具有像在LAMP法等中使用的5’末端与从3’末端延长的部分互补的环结构之类的结构。就是说，引物的3’末端的连续的区域与模板核酸互补。进而，还不具有像在SDA法或ICAN法中使用的引物在反应途中被切断从而被切断的3’末端成为新的合成起点之类的复杂的计划。
对寡核苷酸引物的长度没有特别限定，通常为10～100核苷酸左右的长度，优选为10～50核苷酸左右的长度，进而优选为10～40核苷酸左右的长度。
寡核苷酸引物可以通过使用市售的DNA合成机(例如美国应用生物系统公司(Applied Biosystem Inc.)的DNA synthesizer 394型等)，利用亚磷酰胺(phosphoramidite)法合成。
寡核苷酸引物的使用量在反应溶液中优选为0.1μM以上，进而优选为1μM以上，特别优选为1.5μM以上。
(b)屏蔽寡核酸
在本发明中，进而使用至少一条寡核酸(以下也称为屏蔽寡核酸)，该寡核酸被设计成相对第一核酸和第二核酸的应识别碱基序列部位杂交，而且，相对第二核酸比第一核酸更互补，进而，不成为核酸扩增的起点。
作为不成为核算扩增的起点的手段，可以举出修饰(例如磷酸化、氨基化、生物素(biotin)化、利用各种荧光色素的标记(label)等)寡核酸的3’末端的方法，另外还有使用RNA、PNA(肽(peptide)核酸)或LNA(锁(locked)核酸)作为寡核酸的方法等。
进而，在本发明中使用的屏蔽寡核酸被设计成与第一核酸或第二核酸杂交的区域的一部分或全部与引物杂交的区域的一部分或全部为同一部分。
优选在本发明中使用的屏蔽寡核酸被设计成与引物的至少3’末端的碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
更优选在本发明中使用的屏蔽寡核酸被设计成与引物的3’末端侧的至少2个碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
进而优选在本发明中使用的屏蔽寡核酸被设计成与引物的3’末端侧的至少5个碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
进而更优选在本发明中使用的屏蔽寡核酸被设计成与引物的3’末端侧的至少8个碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
另外，对与引物和第一核酸或第二核酸杂交的区域杂交的屏蔽寡核酸上的区域没有特别限定，通常位于屏蔽寡核酸的5’末端侧的区域。
优选屏蔽寡核酸的至少5’末端的碱基与引物的至少3’末端的碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
更优选屏蔽寡核酸的5’末端侧的至少2个碱基与引物的3’末端侧的至少2个碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
进而优选屏蔽寡核酸的5’末端侧的至少5个碱基与引物的3’末端侧的至少5个碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
进而更优选屏蔽寡核酸的5’末端侧的至少8个碱基与引物的3’末端侧的至少8个碱基杂交的第一核酸或第二核酸上的区域杂交。
对在本发明中使用的屏蔽寡核酸的Tm没有特别限定，通常被设计成引物的Tm的±20℃以内。更优选被设计成高于比引物的Tm低10℃的温度，低于比引物的Tm高20℃的温度。其中，Tm可以使用最邻近法，例如作为Na+的浓度，可以使用50mM。
对在本发明中使用的屏蔽寡核酸的长度没有特别限定，通常为5～100核苷酸左右的长度，优选为10～50核苷酸左右的长度，进而优选为10～40核苷酸左右的长度。
在本发明中使用的屏蔽寡核酸可以通过使用市售的DNA合成机(例如美国应用生物系统公司(Applied Biosystem Inc.)的DNA synthesizer 394型等)，利用亚磷酰胺法合成。
在本发明中使用的屏蔽寡核酸的使用量在反应溶液中优选为0.1μM以上，进而优选为1μM以上，特别优选为1.5μM以上。
引物的一部分和屏蔽寡核酸的一部分与应识别的第一核酸和第二核酸的同一区域杂交，该同一区域可以为1个碱基，但进而优选为3个碱基以上，特别优选为6个碱基以上。
屏蔽寡核酸与引物的量比优选屏蔽寡核酸存在引物量的10％以上，进而优选存在50％以上，特别优选存在100％以上。
(6)成为模板的核酸片断
在本发明中，成为模板的核酸(DNA或RNA)可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA、mRNA、全RNA的任意一种。可以使用从具有内含成为模板的核酸的可能性的样品中配制的核酸。也可以直接使用具有内含成为模板的核酸的可能性的样品。对内含成为模板的核酸的样品的种类没有特别限定，例如可以举出体液(例如全血、血清、尿、脑脊髓液、精液、唾液等)、组织(例如癌组织等)、细胞培养物之类的生物体来源样品，病毒、细菌、霉、酵母、植物及动物之类的核酸含有样品，具有混入微生物的可能性的样品(例如食品等)，或者土壤、废水之类的环境中的样品。在从如上所述的样品中配制核酸的情况下，对其配制方法没有特别限定，例如可以使用利用表面活性剂的处理、超声波处理、使用玻璃珠的纯化等从业者公知的方法。核酸的从样品的纯化可以通过苯酚抽提、色谱、凝胶电泳或密度梯度离心分离等进行。
在想要扩增具有RNA来源的序列的核酸的情况下，可以利用将该RNA作为模板的逆转录反应合成cDNA，将该cDNA作为模板，实施本发明的方法。在逆转录反应中使用的引物可以为具有与特定的模板RNA互补的碱基序列的引物，也可以为寡聚dT引物或具有随机(random)的序列的引物。逆转录用引物的长度优选为6～100核苷酸左右，更优选为9～50核苷酸左右。作为在逆转录反应中使用的酶，只要是具有以RNA为模板的cDNA合成活性的酶，则没有特别限定，例如可以使用禽类成髓细胞瘤病毒来源逆转录酶(AMV RTase)、莫洛尼鼠类白血病病毒来源逆转录酶(MMLV RTase)、rous相关病毒2逆转录酶(RAV-2RTase)等。另外，还可以使用同时具有逆转录活性的链置换型DNA聚合酶。
在本发明中，可以使用基因组DNA或核酸扩增片断之类的两条链DNA及利用逆转录反应从RNA配制的cDNA之类的一条链DNA作为模板DNA。上述两条链DNA可以在变性成一条链DNA之后在本发明的方法中使用，也可以不进行这样的变性而在本发明的方法中使用。
(7)熔解温度调节剂
可以在本发明中的反应溶液中添加熔解温度调节剂。作为熔解温度调节剂的具体例，可以举出二甲亚砜(DMSO)、甜菜碱、甲酰胺或甘油、四烷基季铵盐、或它们的2种以上的混合物。对熔解温度调节剂的使用量没有特别限定，而在为DMSO或甲酰胺、甘油的情况下，通常可以在反应溶液中含有10％以下的量。甜菜碱或四烷基铵盐可以添加0.2～3.0M，优选添加0.5～1.5M左右。
(8)缓冲成分
可以在本发明中的反应溶液中含有缓冲成分。作为缓冲成分，没有特别限定，例如可以使用巢菜碱、麦黄酮、HEPES、Tris、磷酸盐(磷酸钠、磷酸钾等)等。缓冲成分的最终浓度为5mM～100mM的范围，特别优选为10mM～50mM的范围，另外，pH根据在扩增反应中使用的酶的最适pH不同而不同，但通常可以使用6.0～9.0的pH，特别优选使用pH7.0～9.0。
(9)本发明中的核酸的碱基序列的识别方法
接着，对本发明中的核酸的碱基序列的识别方法进行说明。在本发明中，培养内含如下所述的成分的反应溶液，即：(1)包括与第一核酸互补但不与第二核酸互补的至少1种引物的至少2种引物；(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补，进而不成为核酸扩增的起点的至少一条寡核酸；(3)至少1种脱氧核苷酸3磷酸；(4)具有至少1种链置换能的DNA聚合酶；以及(5)成为模板的核酸片断。这样，可以进行以上述引物的3’末端为起点的聚合酶反应，从而扩增该核酸片断。在此，可以根据相对第一核酸迅速地发生核酸扩增、相对第二核酸不发生核酸扩增或者缓慢发生，来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。在本发明中，优选可以在实质上等温下进行扩增核酸的工序。培养反应溶液时的温度优选为50℃以上，更优选为55℃以上，例如，可以在60℃左右培养。优选的温度范围例如约50℃～约70℃，进而优选为约55℃～约65℃。这种情况下，引物的非特异性的退火受到抑制，DNA扩增的特异性提高，另外，模板DNA的二级结构被消除，由此DNA聚合酶的延长性也提高。本发明中的核酸的扩增方法可以在实质上等温下实施。在本发明中，等温是指没有极大地改变各工序的反应温度，各工序在实质上一定的温度下进行。
在本发明中，在实质上等温下培养反应溶液的时间只要能够扩增目标核酸片断即可，没有特别限定。培养的时间例如可以为5分钟以上12小时以内。培养的时间优选为5分钟以上2小时以内，更优选为5分钟以上60分钟以内，进而优选为5分钟以上30分钟以内，还可以为5分钟以上15分钟以内。
本发明中的核酸的碱基序列的识别方法的特征之一在于，在核酸的合成方法中，不必需使温度上升或降低。在以往的PCR法中，必需使温度上下变化，例如必需基因扩增仪之类的反应装置，而在本发明的方法中，可以只用能够保持一定温度的装置实施。
(10)本发明中的核酸的碱基序列的识别方法的利用
可以为了识别核酸的碱基序列而使用本发明中的方法，例如可以为了检测单碱基多态而使用，进而，可以为了识别正常型纯合子(homo)、变异型纯合子或杂合子(hetero)的任意一种基因型而使用。
利用本发明的核酸的扩增方法得到的扩增物可以利用从业者公知的方法检测。例如如果利用凝胶电泳，则可以通过用溴化乙锭对凝胶进行染色来检测特定尺寸的反应产物。用于检测扩增产物的检测系可以使用荧光偏振光、免疫分析法、荧光能量转移、酶标记(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记(例如荧光黄、若丹明等)、化学发光或生物发光等。还可以通过使用用生物素等标记的标记核苷酸检测扩增物。这种情况下，扩增产物中的生物素可以使用荧光标记亲和素(avidin)或酶标记亲和素等检测。
用实施例更具体地说明本发明，但本发明不被这些实施例所限定。
【实施例】
<实施例1>β3AR190(T/C)的变异检测中的3’末端修饰核酸的效果
(1)内含靶(target)核酸片断的核酸样品液的配制
与7.5ng前处理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起，在98℃下加热作为β3AR190(T)的模板(template)(以下为野生型)及作为β3AR190(C)的模板(以下为变异型)、作为β3AR190(T/C)的模板(以下为杂合子型)，在成为1条链之后，以以下条件进行β3AR基因中的序列的扩增。
<引物>
以β3AR基因为目标设计引物。以下示出各引物的序列。
引物(1)(正向)：
5’-ATCGTGGCCATCGCCT-3’(序列编号1)
引物(2)(反向)：
5’-CCAGCGAAGTCACGAAC-3’(序列编号2)
其中，该引物对相对β3AR190(T)为互补，而相对β3AR190(C)为非互补。
(屏蔽寡核酸)
作为屏蔽寡核酸，加入具有以下序列的修饰核酸。其中，Phos表示已被磷酸化。此外，将在实施例中使用的正向引物、反向引物、屏蔽寡核酸的位置关系示于图4。
屏蔽寡核酸(3)
5’-CGTGGCCATCGCCCGGA-Phos-3’(序列编号3)
(2)核酸扩增反应
利用以下示出的反应液的组成，使其在60℃下反应60分钟，实施扩增反应。其中，将pH调节至8.8。
<反应液的组成>
Tris-HCl      20mM
KCl           10mM
(NH4)2SO4     10mM
MgSO4         8mM
Tween20       0.10％
DMSO          5.0％
dNTP          各1.4mM
SYBR Green    稀释50000倍
引物(1)       3.6μM
引物(2)       3.6μM
屏蔽寡核酸(3’末端磷酸化寡聚DNA)3.6μM
Bst.Polymerase(NEB公司制)8.0U
模板DNA       7.5ng
(3)扩增产物的检测
使用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制)，对上述(2)中的扩增反应进行荧光检测。将结果示于图1。
可知从核酸样品来源的样本发生了核酸的扩增。在此，使用Mx3000p的分析软件，算出在上述的曲线图中荧光量达到250时的时间(定义为Ct值)，结果野生型(β3AR190(T))为Ct＝36.2±0.7分钟，变异型(β3AR190(C))为Ct＝62.2±3.6分钟，杂合子型(β3AR190(T/C))为Ct＝37.5±0.8分钟。
<实施例2>β3AR190(T/C)的变异检测中的RNA的效果
(1)内含靶核酸片断的核酸样品液的配制
与7.5ng前处理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起，在98℃下加热作为β3AR190(T)的模板(以下为野生型)及作为β3AR190(C)的模板(以下为变异型)、作为β3AR190(T/C)的模板(以下为杂合子型)，在成为1条链之后，以以下条件进行β3AR基因中的序列的扩增。
<引物>
以β3AR基因为目标设计引物。以下示出各引物的序列。
引物(1)(正向)：
5’-ATCGTGGCCATCGCCT-3’(序列编号1)
引物(2)(反向)：
5’-CCAGCGAAGTCACGAAC-3’(序列编号2)
其中，该引物对相对β3AR190(T)为互补，而相对β3AR190(C)为非互补。
(屏蔽寡核酸)
作为屏蔽寡核酸，加入具有以下序列的RNA。此外，将在实施例中使用的正向引物、反向引物、屏蔽寡核酸的位置关系示于图4。
屏蔽寡核酸(3)
5’-CGUGGCCAUCGCCCGGA-3’(序列编号4)
(2)核酸扩增反应
利用以下示出的反应液的组成，使其在60℃下反应60分钟，实施扩增反应。其中，将pH调节至8.8。
<反应液的组成>
Tris-HCl        20mM
KCl             10mM
(NH4)2SO4       10mM
MgSO4           8mM
Tween20         0.10％
DMSO            5.0％
dNTP            各1.4mM
SYBR Green      稀释50000倍
引物(1)         3.6μM
引物(2)         3.6μM
屏蔽寡核酸RNA   3.6μM
Bst.Polymerase(NEB公司制)8.0U
模板DNA         7.5ng
(3)扩增产物的检测
使用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制)，对上述(2)中的扩增反应进行荧光检测。将结果示于图1。
可知从核酸样品来源的样本发生了核酸的扩增。在此，使用Mx3000p的分析软件，算出在上述的曲线图中荧光量达到250时的时间(定义为Ct值)，结果野生型(β3AR190(T))为Ct＝34.9±0.4分钟，变异型(β3AR190(C))为Ct＝50.8±3.2分钟，杂合子型(β3AR190(T/C))为Ct＝37.8±1.0分钟。
<比较例1>不使用屏蔽寡核酸时的β3AR190(T/C)的变异检测
(1)内含靶核酸片断的核酸样品液的配制
与7.5ng前处理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起，在98℃下加热作为β3AR190(T)的模板(以下为野生型)及作为β3AR190(C)的模板(以下为变异型)、作为β3AR190(T/C)的模板(以下为杂合子型)，在成为1条链之后，以以下条件进行β3AR基因中的序列的扩增。
<引物>
以β3AR基因为目标设计引物。以下示出各引物的序列。
引物(1)(正向)：
5’-ATCGTGGCCATCGCCT-3’(序列编号1)
引物(2)(反向)：
5’-CCAGCGAAGTCACGAAC-3’(序列编号2)
其中，该引物对相对β3AR190(T)为互补，而相对β3AR190(C)为非互补。
(2)核酸扩增反应
利用以下示出的反应液的组成，使其在60℃下反应60分钟，实施扩增反应。其中，将pH调节至8.8。
<反应液的组成>
Tris-HCl      20mM
KCl           10mM
(NH4)2SO4     10mM
MgSO4         8mM
Tween20       0.10％
DMSO          5.0％
dNTP          各1.4mM
SYBR Green    稀释50000倍
引物(1)       3.6μM
引物(2)       3.6μM
Bst.Polymerase(NEB公司制)8.0U
模板DNA       7.5ng
(3)扩增产物的检测
使用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制)，对上述(2)中的扩增反应进行荧光检测。将结果示于图3。
可知从核酸样品来源的样本发生了核酸的扩增。在此，使用Mx3000p的分析软件，算出在上述的曲线图中荧光量达到250时的时间(定义为Ct值)，结果野生型(β3AR190(T))为Ct＝31.5±0.3分钟，变异型(β3AR190(C))为Ct＝41.6±3.0分钟，杂合子型(β3AR190(T/C))为Ct＝32.4±1.2分钟。
【序列表】
<110>F富士胶片公司
<120>一种核酸扩增方法
<130>A81014A
<160>4
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>人工合成序列注解：合成DNA
<400>1
atcgtggcca tcgcct                                               16
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>人工合成序列注解：合成DNA
<400>2
ccagcgaagt cacgaac                                              17
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>人工合成序列注解：合成DNA
<400>3
cgtggccatc gcccgga                                              17
<210>4
<211>17
<212>RNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>人工合成序列注解：合成DNA
<400>4
cguggccauc gcccgga                                        17

Claims (24)

1.识别核酸的碱基序列的差异的方法，其是利用在实质上等温下进行的核酸扩增法来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异的方法，其特征在于，
使用(1)与第一核酸实质上互补的至少一种寡核苷酸，和(2)被设计成相对该第一核酸和第二核酸的应识别的碱基序列部位杂交、而且相对第二核酸比相对第一核酸更互补、进而不成为利用聚合酶的延长反应的起点的至少一种寡核酸，将(1)中的寡核苷酸称为引物，将(2)中的寡核酸称为屏蔽寡核酸，该引物的一部分和该屏蔽寡核酸的一部分与该第一核酸及该第二核酸的同一区域杂交。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
与引物和屏蔽寡核酸的二者杂交的第一核酸及第二核酸上的区域与引物的包括3’末端的区域杂交。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
与引物和屏蔽寡核酸的二者杂交的第一核酸及第二核酸上的区域与屏蔽寡核酸的包括5’末端的区域杂交。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，
引物相对第一核酸比相对第二核酸更互补。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，
引物被设计成只在3’末端的连续的区域与第一核酸或第二核酸杂交。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，
第一核酸与第二核酸存在单碱基多态的关系。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，
使用至少两种引物，该至少两种引物被设计成彼此与DNA两条链的不同链互补，而且在与DNA链上的自身相同的序列的3’末端侧存在的区域，另一方寡核苷酸引物成为互补。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
培养含有至少1种脱氧核苷酸3磷酸、具有至少1种链置换能的DNA聚合酶及成为模板的核酸片断的反应溶液，进行以上述引物的3’末端为起点的聚合酶反应，从而扩增该核酸片断，由此识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，
利用扩增速度的差来识别第一核酸与第二核酸的碱基序列的差异。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
反应溶液进一步含有至少0.01％以上的表面活性剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，
反应溶液进一步含有至少0.05％以上的表面活性剂。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，
表面活性剂为非离子性表面活性剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，
非离子性表面活性剂的HLB值为12以上。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，
非离子性表面活性剂的HLB值为14以上。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其特征在于，
非离子性表面活性剂选自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系、聚氧化乙烯烷基醚系。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非离子性表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐一脂肪酸酯。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，
由以下化学式表示：
Figure A2009102028520003C1
式中，x+y+z+w＝20，R：表示碳原子数12～18的烷基。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非离子性表面活性剂选自聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯的至少1种。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，
反应溶液还含有2价的阳离子。
20.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，
反应溶液还含有熔解温度调节剂。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的方法，其中，
具有至少1种链置换能的聚合酶选自嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstearothermophilus来源的5’→3’核酸外切酶缺损Bst.DNA聚合酶、及卡都特纳芽孢杆菌Bacillus caldotenax来源的5’→3’核酸外切酶缺损BcaDNA聚合酶、立投拉里斯嗜热球菌Thermococcus litoralis来源的5’→3’核酸外切酶缺损Vent.DNA聚合酶。
22.根据权利要求1～21中任一项所述的方法，其中，
在实质上等温下培养反应溶液。
23.根据权利要求1～22中任一项所述的方法，其中，
在50℃以上100℃以下的实质上等温下培养反应溶液。
24.根据权利要求1～23中任一项所述的方法，其中，
在等温下培养反应溶液的时间为60分钟以内。
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