CN101353683B - 核酸的扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用寡核苷酸引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，可以在基本上恒温的条件下进行核酸扩增的方法。本发明提供一种核酸的扩增方法，该方法包括：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少0.01％以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增。

Description

核酸的扩增方法
技术领域
本发明涉及一种核酸的扩增方法。更具体地说，本发明涉及一种核酸的扩增方法，其特征是，采用具有链置换能力的DNA聚合酶，通过在基本上恒温的条件下孵育反应溶液，进行聚合酶反应。
背景技术
在分子生物学的研究中，一般来说，核酸的扩增是通过利用DNA聚合酶采用酶学方法来进行的。作为核酸的扩增方法，聚合酶链反应(PCR)是一种公知的方法。为了对作为目标的靶核酸序列进行扩增，PCR法由以下3个工序构成：将作为模板的双链DNA变性为单链DNA的工序(变性工序)；将引物退火到单链DNA上的工序(退火工序)；以及，以引物作为起点使互补链延伸的工序(延伸工序)。在通常的PCR法中，在使用扩增仪(Thermal Cycler)时，变性工序、退火工序、延伸工序分别在不同的温度下进行。但是，在3种不同的温度下进行核酸扩增反应时，温度控制麻烦，并且还会造成这样的问题：消耗的时间会随着循环次数的增加而成比例地增加。
因此，人们开发了可以在恒温状态下实施的核酸扩增方法。例如可以列举，SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification，参见日本特开平5-130870号公报)、RCA(滚环扩增，Rolling CircleAmplification，参见Proc.Natl.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995))、ICAN(恒温和嵌合引物引发的核酸扩增，Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids)、LAMP(环介导的DNA恒温扩增，Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA，参见Bio Industry，第18卷、第2期(2001))、NASBA(基于核酸序列的扩增方法，Nucleic acid Sequence-based Amplification method，参见Nature，350，91～(1991))、TMA(转录介导的扩增方法，Transcriptionmediated amplification method，参见J.Clin Microbiol.第31卷、3270～(1993))等。
SDA法(日本特开平5-130870号公报)是采用外切核酸酶的循环分析法，其为利用聚合酶延伸反应使目标核酸片段的目的部位扩增的一种方法。该方法是这样一种方法：以特异性地杂合到目标核酸片段的目的部位上的引物作为起点进行聚合酶延伸反应，同时使5’→3’外切核酸酶发生作用，从而将引物从相反方向降解。新的引物代替降解的引物进行杂合，并再次通过DNA聚合酶进行延伸反应。该通过DNA聚合酶进行的延伸反应与通过外切核酸酶(该外切核酸酶将之前已延伸的链除去)进行的降解反应依次地、周期性地反复进行。这里，通过聚合酶进行的延伸反应与通过外切核酸酶进行的降解反应可以在恒温条件下进行。但是，该方法中除了聚合酶外，还必须使用外切核酸酶，这样的话消耗成本，同时还必须花费精力来设计引物。
LAMP法是近年开发的对于目标核酸片段的目的部位进行扩增的方法。该方法中，通过使用至少4种引物(该至少4种引物互补地识别目标核酸片段的至少6个特定部位)和链置换型的Bst DNA聚合酶(该聚合酶为在5’→3’方向上没有核酸酶活性、而且边使模板上的双链DNA解离为单链DNA边催化延伸反应的聚合酶)，在恒温条件下，将目标核酸片段的目的部位扩增为这样的特别结构：引物的5’末端与从3’末端延伸出来的部分互补。不过，这种方法需要使用至少4种引物以识别6个特定部位，而引物的设计非常困难。
ICAN法也是近年开发的对于目标核酸片段的目的部位进行扩增的方法。该方法为这样一种方法：采用RNA-DNA嵌合引物、具有链置换活性和模板交换活性的DNA聚合酶和RNaseH，进行恒温的基因扩增。嵌合引物与模板结合后，通过DNA聚合酶可以合成互补链。之后，RNaseH将来源于嵌合引物的RNA部分切断，从切断的部分开始进行延伸反应，同时伴随有链置换反应和模板交换反应，这样的反应反复进行，基因由此得以扩增。不过，该方法也必须用到称作嵌合引物的特殊引物，而引物的设计非常困难。
在日本特表平11-509406号公报中，记载了在具有链置换能力的DNA聚合酶存在下，采用至少1组寡核苷酸引物，将目的区域中的DNA在恒温条件下反应，由此扩增的方法。不过，日本特表平11-509406号公报中记载的方法存在着需要比较长的反应时间这样的问题。总之，人们希望开发一种像PCR法那样通过简单的引物设计，就能够在恒温条件下简便实施的核酸扩增方法。
[非专利文献1]Proc.Natl.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995)
[非专利文献2]Bio Industry，第18卷，第2期(2001)
[非专利文献3]Nature，350，91～(1991)
[非专利文献4]J.Clin Microbiol.第31卷，3270～(1993)
[专利文献1]日本特开平5-130870号公报
[专利文献2]日本特表平11-509406号公报
发明内容
发明要解决的问题
为了解决上述问题，本发明提供一种采用寡核苷酸引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在基本上恒温的条件下可以实施的核酸扩增方法。为了解决上述问题，本发明还提供一种能够在短时间内扩增目标核酸序列、并能够特异性地扩增目标核酸序列的核酸扩增方法。为了解决上述问题，本发明进一步提供一种采用比较简单的引物设计进行核酸扩增的方法。
为解决上述问题，本发明人进行了深入的研究。结果发现将含有脱氧核苷三磷酸、具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、表面活性剂、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而能够有效地在短时间内将该核酸片段扩增。基于以上发现完成本发明。而且，本发明中所用的寡核苷酸引物的最大特征在于，其不具有以往的恒温扩增法中所采用的那样的复杂结构。例如，不必具有在ICAN法中所采用的那样的嵌合结构或在LAMP法中所采用的那样的环结构。
即，本发明提供一种核酸的扩增方法，其包括：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少0.01％以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育，由此以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增。
优选的是，所述反应溶液中含有至少0.05％以上的表面活性剂。
优选的是，所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
优选的是，所述非离子型表面活性剂的HLB值在12以上。
优选的是，所述非离子型表面活性剂的HLB值在14以上。
优选的是，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。
优选的是，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯。
优选的是，所述聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯如以下化学式所表示。
[式1]
Figure S2008101332850D00041
(式中，x+y+z+w＝20，R表示碳原子数为12～18的烷基。)
优选的是，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯中的至少一种。
优选的是，所述反应溶液中还含有解链温度调节剂。
优选的是，所述解链温度调节剂为二甲基亚砜、甜菜碱、甲酰胺或甘油，或者它们两种以上的混合物。
优选的是，所述反应溶液中含有的至少一种脱氧核苷三磷酸的浓度均为大于或等于0.1mM而小于或等于3.0mM。
优选的是，所述反应溶液中含有大于或等于1μM而小于或等于50μM的寡核苷酸引物。
优选的是，所述寡核苷酸引物与上述模板核酸片段的一部分基本上互补。
优选的是，所述寡核苷酸引物只有其3’末端区域与上述模板核酸片段基本上互补。
优选的是，所述寡核苷酸引物只与上述模板核酸片段的连续核苷酸的一处基本上互补。
优选的是，模板上的分别退火有所述至少两种寡核苷酸引物的区域位于所述模板上的1000bp以内的区域中。
优选的是，所述至少一种具有链置换能力的聚合酶为选自来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的5’→3’外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的5’→3’外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、及来源于Tli(Thermococcus litoralis)的5’→3’外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶中的聚合酶。
优选的是，所述反应溶液在50℃以上、100℃以下的基本上恒温的条件下进行孵育。
优选的是，在基本上恒温的条件下对反应溶液进行孵育的时间为60分钟以内。
优选的是，除了所述至少两种寡核苷酸引物之外，还向该反应溶液中加入一种以上的追加的寡核苷酸引物进行反应。
优选的是，模板上的分别退火有所述至少两种寡核苷酸引物及所述一种以上的追加的寡核苷酸引物的区域分别位于模板上的1000bp以内的区域中。
本发明还提供一种检测靶核酸序列中有无发生变异的方法，该方法包括进行上述本发明的核酸扩增的方法。
所述检测靶核酸序列中有无发生变异的方法优选包括以下的工序：
(1)将反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的工序，其中所述反应溶液含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少一种非离子型表面活性剂、至少两种含有变异部位的寡核苷酸引物、以及作为模板的含有靶核酸序列的核酸片段；以及，
(2)根据是否发生核酸扩增反应来判断有无发生变异的工序，其中所述核酸扩增反应是以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应而进行的。
优选的是，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。
优选的是，所述非离子型表面活性剂的HLB值在12以上。
优选的是，所述非离子型表面活性剂的HLB值在14以上。
优选的是，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。
发明效果
通过本发明，可以在基本上恒温的条件下扩增靶核酸序列。此外，通过本发明，可以在短时间内特异性地扩增靶核酸序列。
附图说明
图1显示的是实施例1中水平1(引物(1)及引物(2)、有表面活性剂)的扩增产物的检测结果。
图2显示的是实施例1中水平2(引物(1)及引物(2)、无表面活性剂)的扩增产物的检测结果。
图3显示的是实施例1中水平3(引物(3)及引物(4)、有表面活性剂)的扩增产物的检测结果。
图4显示的是实施例1中水平4(引物(3)及引物(4)、无表面活性剂)的扩增产物的检测结果。
图5显示的是实施例1中水平1(引物(1)及引物(2)、有表面活性剂)的扩增产物进行电泳的结果。
其中，泳道1：50bp ladder(Invitrogen公司制造)
泳道2：实施例1中水平1的扩增产物(有核酸试样)
泳道3：实施例1中水平1的扩增产物(有核酸试样)
泳道4：实施例1中水平1的扩增产物(有核酸试样)
泳道5：实施例1中水平1的扩增产物(有核酸试样)
泳道6：实施例1中水平1的扩增产物(无核酸试样)
泳道7：实施例1中水平1的扩增产物(无核酸试样)
泳道8：实施例1中水平1的扩增产物(无核酸试样)
泳道9：实施例1中水平1的扩增产物(无核酸试样)
图6显示的是实施例1中水平2(引物(1)及引物(2)、无表面活性剂)的扩增产物进行电泳的结果。
其中，泳道1：实施例1中水平2的扩增产物(有核酸试样)
泳道2：实施例1中水平2的扩增产物(有核酸试样)
泳道3：实施例1中水平2的扩增产物(有核酸试样)
泳道4：实施例1中水平2的扩增产物(有核酸试样)
泳道5：实施例1中水平2的扩增产物(无核酸试样)
泳道6：实施例1中水平2的扩增产物(无核酸试样)
泳道7：实施例1中水平2的扩增产物(无核酸试样)
泳道8：实施例1中水平2的扩增产物(无核酸试样)
泳道9：50bp ladder(Invitrogen公司制造)
图7显示的是实施例2中水平1(吐温20、0.01％)的扩增产物的检测结果。
图8显示的是实施例2中水平2(吐温20、0.05％)的扩增产物的检测结果。
图9显示的是实施例2中水平3(吐温20、0.1％)的扩增产物的检测结果。
图10显示的是实施例2中水平4(吐温20、0.5％)的扩增产物的检测结果。
图11显示的是实施例3中水平1(吐温40)的扩增产物的检测结果。
图12显示的是实施例3中水平2(吐温60)的扩增产物的检测结果。
图13显示的是实施例3中水平3(吐温80)的扩增产物的检测结果。
图14显示的是实施例3中水平4(Brij-35)的扩增产物的检测结果。
图15显示的是实施例3中水平5(Brij-56)的扩增产物的检测结果。
图16显示的是实施例3中水平6(Brij-700)的扩增产物的检测结果。
图17显示的是实施例3中水平7(TritonX-100)的扩增产物的检测结果。
图18显示的是实施例3中水平8(吐温85)的扩增产物的检测结果。
图19显示的是实施例3中水平9(Span20)的扩增产物的检测结果。
图20显示的是实施例4中水平1(吐温40)的扩增产物的检测结果。
图21显示的是实施例4中水平2(吐温60)的扩增产物的检测结果。
图22显示的是实施例4中水平3(吐温80)的扩增产物的检测结果。
图23显示的是实施例4中水平4(Brij-35)的扩增产物的检测结果。
图24显示的是实施例4中水平5(Brij-56)的扩增产物的检测结果。
图25显示的是实施例4中水平6(Brij-700)的扩增产物的检测结果。
图26显示的是实施例4中水平7(TritonX-100)的扩增产物的检测结果。
图27显示的是实施例4中水平8(吐温85)的扩增产物的检测结果。
图28显示的是实施例4中水平9(Span20)的扩增产物的检测结果。
图29显示的是实施例5中水平1(无表面活性剂)的扩增产物的检测结果。
图30显示的是实施例5中水平2(有表面活性剂)的扩增产物的检测结果。
图31显示的是实施例6中的扩增产物的检测结果。
图32显示的是实施例7中的扩增产物的检测结果。
图33显示的是实施例8中的扩增产物的检测结果。
图34显示的是实施例9中的扩增产物的检测结果。
图35显示的是根据本发明进行的核酸扩增方法的概括。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
在本发明的核酸扩增方法中，将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少一种0.01％以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育，以所述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增。
本发明的第一种实施方案包含以下的工序：(a)将存在的至少两种引物中的其中一种退火到作为模板的核酸链上，通过上述的链置换型DNA聚合酶的作用，从该引物的3’末端开始进行合成反应，从而合成得到延伸产物；(b)在通过上述工序得到的双链核酸上，在施加比工序(a)中更高的温度而不使上述双链产生变性的情况下，将与工序(a)中所使用的引物为不同种类的寡核苷酸引物侵染双链，通过上述链置换型DNA聚合酶的作用，从该引物的3’末端开始进行合成反应，从而合成得到延伸产物；(c)再次将与工序(a)中所使用的引物相同的引物退火到在上述(b)工序中解离的核酸上，通过至少1种链置换型DNA聚合酶的作用，从该引物的3’末端开始进行合成反应，从而合成得到延伸产物；(d)将上述工序(b)所得到的双链核酸再次用于(b)工序中。
本发明的第二种实施方案包含以下的工序：(a)将存在的至少两种引物中的其中一种退火到作为模板的核酸链上，通过上述的链置换型DNA聚合酶的作用，从该引物的3’末端开始进行合成反应，从而合成得到延伸产物；(b)在通过上述工序得到的双链核酸上，在施加比工序(a)中更高的温度而不使上述双链产生变性的情况下，将与工序(a)中所使用的引物相同的寡核苷酸引物侵染双链，通过上述链置换型DNA聚合酶的作用，从该引物的3’末端开始进行合成反应，从而合成得到延伸产物；(c)将与工序(a)中所使用的引物不同的引物退火到在上述(b)工序中解离的核酸上，通过至少1种链置换型DNA聚合酶的作用，从该引物的3’末端开始进行合成反应，从而合成得到延伸产物；(d)将通过上述工序(b)得到的双链核酸再次用于(b)工序中。
本发明的扩增反应的特征在于采用如PCR法中所使用的那样的简单结构的引物就可以进行反应。在本扩增法中，如上述(b)工序所示，将引物退火到模板上的操作是在恒温条件下进行的。利用双链和单链的平衡状态，在不稳定的条件下使双链状态适度地进行反应是很重要的。所述反应温度优选50℃以上，更优选55℃以上，例如，可以在60℃左右进行孵育。优选的温度范围，例如从约50℃到约100℃，更优选从约50℃到约70℃，进一步优选从约55℃到约65℃。而且，有效地将引物侵染到不稳定的双链上也是很重要的。可以通过调节引物的长度及浓度来达到所述效率。即，对于寡核苷酸引物的长度没有特别的限定，但是一般来说，为10～100个左右核苷酸的长度，优选为15～50个左右核苷酸的长度，更优选为15～40个左右核苷酸的长度。例如，可以使用具有25个左右核苷酸的寡核苷酸引物。寡核苷酸引物的用量，在反应溶液中，优选为大于或等于0.1μM而小于或等于100μM，更优选为大于或等于1μM而小于或等于50μM，特别优选为大于或等于1.5μM而小于或等于10μM。通常来说，添加高浓度的引物可以促进引物二聚体等非特异扩增产物的形成，但是在本发明中，通过添加表面活性剂可以有效地抑制引物二聚体等非特异扩增产物的形成。通过添加可以辅助引物的侵染之类的物质，也可以提高用于扩增的引物的侵染速度。例如，可以在所述引物的附近设计有其他的寡核苷酸引物，或者可以采用单链结合蛋白质或RecA等DNA结合性蛋白质。
此外，本发明的另一特征在于，尽管可以采用PCR法中所使用的那样的引物，但是扩增产物并不是如PCR法那样只在引物对(primer pair)所夹的区域中合成，而是与其他的恒温扩增法相同，可以得到长链的产物。据认为，这是由于通过下述的机理来进行核酸的合成。
本发明中核酸的扩增方法的概括如图35所示。将存在的至少两种引物中的其中一种退火到作为模板的核酸片段上，以该寡核苷酸引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应。此时，作为模板的核酸序列，如果在其退火有寡核苷酸的部位的5’末端侧和3’末端侧的适当位置上含有几个以上的碱基基本上一致的序列X和X’，那么以该寡核苷酸引物作为起点的扩增产物在3’末端含有与该序列X’互补的序列X’c(将其作为核酸片段A)。还有，序列X和X’既可以是完全一致的序列，也可以是不完全一致而是基本上一致的序列，只要可以相互退火即可。通常，作为模板的核酸序列，在其退火有寡核苷酸的部位的5’末端侧和3’末端侧的适当区域中，含有几个以上的碱基基本上一致的序列X和X’的可能性很高。
同样，采用与上述方法中所使用的寡核苷酸引物不同的引物作为起点的扩增产物在3’末端含有序列X(作为核酸片段B)。接下来，上述得到的扩增核酸片段A与扩增核酸片段B通过序列X和X’c形成杂合，并开始延伸。由此，可以合成得到高分子的扩增核酸片段。或者，上述得到的扩增核酸片段A与作为模板的核酸片段通过序列X(序列Xc’)形成杂合，并开始延伸，从而也可以合成得到高分子的扩增核酸片段。或者，上述得到的扩增核酸片段B与作为模板的核酸片段通过序列X’(序列Xc)形成杂合，并开始延伸，从而也可以合成得到高分子的扩增核酸片段。
优选的是，5’末端和3’末端中存在的序列X和序列X’尽可能地连续并且是一致的，但是在一些情况下，即使不完全一致也可能形成杂合。即，从退火有上述引物的区域的附近位置所存在的序列中选择尽可能一致的区域。但是，优选的是有4个以上的碱基一致，更优选的是有7个以上的碱基一致。对于一致的碱基的数量的上限没有特别的限定，但是一般来说为15个以下的碱基，更一般来说为10个以下的碱基。序列X和序列Xc’的匹配率优选为50％以上，更优选为70％以上，进一步优选为90％以上。
以下对本发明中所采用的成分进行说明。
(1)脱氧核苷三磷酸
采用脱氧核苷三磷酸作为延伸反应的底物。具体地说，优选使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物。作为脱氧核苷三磷酸，也可以含有dNTP的类似物(例如，7-脱氮-dGTP等)。
此外，脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物)的最终浓度均在0.1mM～3.0mM的范围内，优选在0.75mM～3.0mM的范围内，更优选在1.0mM～2.0mM的范围内，特别优选在1.0mM～1.5mM的范围内。
(2)具有链置换能力的聚合酶
在本发明中，采用具有链置换能力的聚合酶。在本说明书中，所谓“链置换能力”是指具有这样的活性：在根据作为模板的核酸序列进行DNA复制时，通过置换DNA链来进行链置换，以使退火到模板链上的互补链解离，即，具有能够进行链置换(strand displacement)的活性。作为具有链置换能力的聚合酶的具体例子，可以列举来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的5’→3’外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的5’→3’外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、及来源于Tli(Thermococcus litoralis)的5’→3’外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶等，但并不局限于此。具有链置换能力的聚合酶，既可以是来源于天然的，也可以是通过基因工程制造的重组蛋白质。
(3)2价阳离子
在本发明中，根据所使用的酶的金属需求性等，使用2价阳离子。作为所述2价阳离子，可以使用镁盐和其他的金属盐，例如，可以使用氯化镁、醋酸镁、硫酸镁等。所述2价阳离子的最终浓度优选在1mM～20mM的范围内，更优选在2mM～10mM的范围内。
(4)表面活性剂
在本发明中，向反应溶液中添加表面活性剂。通过使用表面活性剂，可以达到防止发生非特异性的核酸扩增这样的有利效果。对于本发明中可以使用的表面活性剂的种类没有特别的限定，例如可以使用烷基苯磺酸盐、十二烷基硫酸酯盐(SDS)、磺基琥珀酸辛酯盐、硬脂酸皂类等阴离子(anion)型表面活性剂；失水山梨醇脂肪酸酯、POE失水山梨醇脂肪酸酯(Tween等)、POE烷基醚(Brij等)、POE烷基苯基醚(Triton等)、壬基酚、月桂醇、聚乙二醇、聚氧乙烯·聚氧丙烯嵌段共聚物、POE烷基胺、POE脂肪酸双苯基醚等非离子(nonion)型表面活性剂；氯化十六烷基吡啶鎓、十二烷基二甲基苄基氯化铵、硬脂基三甲基氯化铵等阳离子(cation)型表面活性剂，而且，还可以使用烷基二甲基氧化胺、烷基羧基甜菜碱之类的双性(两性)表面活性剂等。对于表面活性剂的用量没有特别的限定，只要能够达到本发明的效果即可，但是优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上，进一步优选为0.1％以上。对表面活性剂的用量的上限没有特别的限定，通常在10％以下，优选在5％以下，更优选在1％以下。
在表面活性剂中，特别优选使用非离子型表面活性剂。在非离子型表面活性剂中，优选亲水性较强的表面活性剂，用HLB值表示的话，优选HLB值在12以上。更优选HLB值在14以上，优选HLB值的上限直到20。另外，优选HLB值在17以下，更优选HLB值为大于或等于14而小于或等于17。从结构上来说，所述表面活性剂优选选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。还有，在聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯中，优选只有一个脂肪酸酯的化合物。例如，可以用以下的结构式来表示。
[式2]
Figure S2008101332850D00141
(式中，x+y+z+w＝20。并且，R表示碳原子数为12～18的烷基。)
对于烷基的位置没有特别的限定，但是可以优选使用以下的结构式所表示的化合物。
[式3]
Figure S2008101332850D00142
x+y+z+w＝20
R表示碳原子数为12～18的烷基
作为此类表面活性剂，就物质名称而言，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类非离子型表面活性剂可以列举聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯等。可以列举商品名分别为Tween20、Tween40、Tween60和Tween80等的表面活性剂。此外，对于表面活性剂的用量也没有特别的限定，但是优选为0.01％以上，更优选为0.05％以上，进一步优选为0.1％以上。
(5)寡核苷酸引物
(a)至少两种的寡核苷酸引物组合
在本发明中使用的至少两种的寡核苷酸引物具有与模板DNA基本上互补的碱基序列，并且从该引物的3′末端可以进行DNA链的延伸。由于寡核苷酸引物具有与模板DNA基本上互补的碱基序列，所以可以将其退火到作为模板的DNA上。作为本发明使用的寡核苷酸引物，可以使用由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸构成的物质，也可以是含有修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸的物质。
此外，上述寡核苷酸引物无需具有以往的恒温扩增反应中所用的那样的复杂设计。本发明的最大特征在于，采用通常的PCR反应中所使用的至少一组以上的引物就可以进行恒温扩增反应。具体地说，这些引物不必具有在LAMP法等中所采用的那样的在5’末端与从3’末端延伸出来的部分互补而形成环状结构那样的结构。即，引物的3’末端的连续区域与模板核酸是互补的。还有，本发明的寡核苷酸引物也不具有在SDA法和ICAN法中所采用的那样复杂结构，该复杂结构为在反应过程中引物被切断，被切断后的3’末端成为新的合成起点。
对于寡核苷酸引物的长度没有特别的限定，但是一般来说，为10～100个左右核苷酸的长度，优选为15～50个左右核苷酸的长度，更优选为15～40个左右核苷酸的长度。
可以使用市售的DNA合成机(例如，美国应用生物系统公司(Applied Biosystem Inc.)制造的DNA合成仪-394型等)，根据亚磷酰胺法来合成所述寡核苷酸引物。
在反应溶液中，寡核苷酸引物的用量优选为大于或等于0.1μM而小于或等于100μM，更优选为大于或等于1μM而小于或等于50μM，特别优选为大于或等于1.5μM而小于或等于10μM。
上述至少两种引物的组合中，优选其中至少1种为上游引物(Forward Primer)，并且至少1种为下游引物(Reverse Primer)。
(b)追加的寡核苷酸引物
在本发明中，除了上述的至少两种寡核苷酸引物之外，还可以向反应溶液中再加入一种以上的追加的寡核苷酸引物(在本说明书中，也称为“增效引物(boost primer)”)，以进行反应。如果使用该追加的寡核苷酸引物，那么随着引物的追加，扩增速度随之提高，所以更优选使用3种以上的引物。此时，该追加的引物可以是上游引物也可以是下游引物。
优选的是，对所述一种以上的追加寡核苷酸引物可以这样进行选择：模板上的分别退火有上述至少两种寡核苷酸引物组合和一种以上的追加寡核苷酸引物的区域分别位于模板上的1000bp以内的区域中。
对于本发明中所用的追加的寡核苷酸引物的长度没有特别的限定，但是一般来说，为10～100个左右核苷酸的长度，优选为15～50个左右核苷酸的长度，更优选为15～40个左右核苷酸的长度。
可以使用市售的DNA合成机(例如，美国应用生物系统公司(Applied Biosystem Inc.)生产的DNA合成仪-394型等)，根据亚磷酰胺法来合成本发明中所用的追加的寡核苷酸引物。
在反应溶液中，本发明中所用的追加的寡核苷酸引物的用量优选为大于或等于0.1μM而小于或等于100μM，更优选为大于或等于1μM而小于或等于50μM，特别优选为大于或等于1.5μM而小于或等于10μM。
(6)作为模板的核酸片段
在本发明中，作为模板的核酸(DNA或RNA)可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA、mRNA、总RNA中的任意一种。既可以使用从有可能含有作为模板的核酸的试样中所制备的核酸，也可以直接使用有可能含有作为模板的核酸的试样。对于含有作为模板的核酸的试样的种类没有特别的限定，可以列举例如体液(例如，全血、血清、尿、脑脊髓液、精液、唾液等)，组织(例如，癌组织等)，来源于细胞培养物之类的生物体的试样，诸如病毒、细菌、真菌、酵母菌、植物和动物之类的含有核酸的试样，有可能混入有微生物的试样(例如，食品等)，或诸如土壤、废水之类的环境中的试样。在从上述试样中制备核酸时，对于制备方法没有特别的限定，例如，可以采用表面活性剂处理、超音波处理、用玻璃珠进行精制等本领域的技术人员公知的方法。对于从试样中精制核酸，可以采用苯酚法提取法、色谱法、凝胶电泳法或密度梯度离心分离等方法进行。
当对具有来源于RNA的序列的核酸进行扩增时，以该RNA作为模板进行逆转录反应合成得到cDNA，以该cDNA作为模板来实施本发明的方法。在逆转录反应中使用的引物，可以是具有与特定的模板RNA互补的碱基序列的引物，也可以是寡聚dT引物或具有随机序列的引物。用于逆转录的引物的长度优选是6～100个左右核苷酸的长度，更优选是9～50个左右核苷酸的长度。对于逆转录反应中使用的酶没有特别的限定，只要其具有以RNA作为模板来合成cDNA的活性即可，例如可以使用源自禽类骨髓细胞瘤病病毒的逆转录酶(AMV RTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RTase)及Rous相关病毒2的逆转录酶(RAV-2RTase)等。此外，也可使用同时具有逆转录活性的链置换型DNA聚合酶。
在本发明中，基因组DNA或核酸扩增片段之类的双链DNA、以及利用逆转录反应由RNA制备得到的cDNA之类的单链DNA可用作模板DNA。上述的双链DNA，既可以在变性为单链DNA后用于本发明的方法中，也可以不进行这样的变性而用于本发明的方法中。
(7)解链温度调节剂
在本发明的反应溶液中，可以添加解链温度调节剂。作为解链温度调节剂的具体例子，可以列举二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱、甲酰胺或甘油、四烷基铵盐或它们2种以上的混合物。对于解链温度调节剂的用量没有特别的限定，然而，在DMSO或甲酰胺、甘油的情况中，通常在反应溶液中的含量为10％以下。
甜菜碱或四烷基铵盐的添加量为0.2M～3.0M，优选为0.5M～1.5M左右。
(8)缓冲成分
在本发明的反应溶液中，可以含有缓冲成分。对于缓冲成分没有特别的限定，可以使用例如N，N-二(羟乙基)甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷和磷酸盐(磷酸钠、磷酸钾等)等。缓冲成分的最终浓度在5mM～100mM的范围内，特别优选在10mM～50mM的范围内，此外，pH是对于扩增反应中使用的酶的最佳pH，一般来说为6.0～9.0，特别优选使用pH 7.0～9.0的缓冲成分。
(9)本发明的核酸扩增方法
以下对本发明的核酸扩增方法进行说明。在本发明中，将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少一种非离子型表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育。由此，以上述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将该核酸片段扩增。孵育反应溶液时的温度优选50℃以上，更优选55℃以上，例如，可以在60℃左右进行孵育。优选的温度范围例如为从大约50℃到大约70℃，更优选为从大约55℃到大约65℃。这种情况下，引物的非特异性退火被抑制，DNA扩增的特异性提高，而且，由于模板DNA的二级结构被解除，所以DNA聚合酶的延伸性也得以提高。本发明的核酸扩增方法可以在基本上恒温的条件下实施。在本发明中，所谓“恒温”是指各工序的反应温度没有很大的变化，各工序在基本上一定的温度下进行。
在本发明中，对于将反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的时间没有特别的限定，只要能够将目标核酸片段进行扩增即可。孵育时间例如可以为5分钟以上12小时以内。孵育时间优选为5分钟以上2小时以内，更优选为5分钟以上60分钟以内，进一步优选为5分钟以上30分钟以内，也可以为5分钟以上15分钟以内。
本发明的核酸扩增方法的特征在于，在核酸的合成方法中不必使温度升高或降低。在传统的PCR法中需要使温度升高或降低，并且例如需要使用扩增仪(Thermal Cycler)之类的反应装置，在本发明的方法中，仅仅使用可使温度保持一定的装置就可以实施扩增。
(10)本发明的核酸扩增方法的应用
本发明的核酸扩增方法能够用于核酸的检测、标记、碱基序列的确定、碱基变异的检测(包括单碱基多型态的检测等)等。在本发明的核酸扩增方法中，不必使用能够进行温度调节的反应装置，所以可以使用大量的反应液来进行扩增反应。
由本发明的核酸扩增方法所得到的扩增产物，可以采用本领域的技术人员公知的方法来进行检测。例如，采用凝胶电泳法，通过用溴化乙锭进行凝胶染色，可以检测特定尺寸的反应产物。用于检测扩增产物的检测体系，可以使用荧光偏振法、免疫检测法、荧光能量移转法、酶标记法(例如，过氧化酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记法(例如，荧光素、罗丹明等)、化学发光法或生物发光法等。通过使用用生物素标记的标记核苷酸也可以检测扩增物。在这种情况中，可以采用荧光标记亲合素或酶标记亲合素等来检测扩增产物中的生物素。
通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例
<实施例1>人类基因中的目标核酸序列的扩增
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将7.5ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
<引物>
作为引物，设计了如下的4种引物，均从オペロン公司购入。各引物的序列如下所示。并且，引物(1)和(2)与β-肌动蛋白基因中的序列互补，引物(3)和(4)与β2AR基因中的序列互补。
引物(1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
引物(3)：
5’-CTTGCTGGCACCCAATA-3’(序列编号3)
引物(4)：
5’-CCGGCGCATGGCTT-3’(序列编号4)
<表面活性剂>
表面活性剂使用Tween20(和光純薬株式会社制造)。Tween20为聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂。更具体地说，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸单酯。其HLB值为16.7，结构式如[式4]所示。
[式4]
Figure S2008101332850D00201
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示的组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB公司的Bst.Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)               2.5μL
100mM MgSO4                             1.5μL
10％(v/v)Tween20或精制水                0.25μL
100％DMSO                               1.25μL
25mM dNTP，每种                         1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                 0.5μL
50μM上游引物                           1.6μL
50μM下游引物                           1.6μL
Bst.Polymerase                          1.0μL
上述(1)中得到的核酸试样溶液或精制水     1.0μL
精制水                      12.4μL
                            25.0μL
在水平1及水平2中，上游引物和下游引物采用如下的组合。
水平1及水平2
上游引物：引物(1)
下游引物：引物(2)
在水平3及水平4中，上游引物和下游引物采用如下的组合
水平3及水平4
上游引物：引物(3)
下游引物：引物(4)
水平1及水平3中添加Tween20作为表面活性剂。
水平2及水平4中添加精制水以代替表面活性剂。
在各水平中，各配制4个添加有核酸试样的样品，以及4个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)来进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，由此来检测扩增。结果如图1～4所示。此外，图右侧显示的是在上述的各图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值，单位：分钟)。
在水平1及水平3(即，添加有表面活性剂的水平)中，只从存在有核酸试样的样品中检测到扩增。换言之，利用本发明扩增法可以检测核酸试样。
在水平2及水平4(即，没有添加表面活性剂的水平)中，从不存在核酸试样的样品(阴性对照)中也能够检测到扩增。换言之，利用本发明扩增法不能检测核酸试样。
采用不同的引物可以得到同样结果，由此可以确认，表面活性剂的效果具有普遍性，不依赖于引物。
图5显示的是水平1中的扩增产物进行电泳的结果。另外，电泳使用的是2％琼脂糖凝胶，缓冲液使用的是TAE缓冲液。电泳时间为40分钟。
可以确认，只有添加有核酸试样的样品才能够得到扩增产物。而且，可以确认，可以得到具有各种链长的高分子量扩增产物。4个样品显示出了大致相同的电泳图谱。
图6显示的是水平2中的扩增产物进行电泳的结果。另外，电泳使用的是2％琼脂糖凝胶，缓冲液使用的是TAE缓冲液。电泳时间为40分钟。
可以确认，不存在核酸试样的样品(阴性对照)也能够得到扩增产物。而且，扩增产物没有表现出特定的电泳图谱。
将水平1中的链长最短的扩增产物从琼脂糖凝胶中切下来，用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen公司生产)进行克隆之后，通过进行测序，确定扩增产物的序列。
可以发现，在水平1中可以得到具有下述序列编号5所示序列的扩增产物。
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATTCCTATGTGGGCGACGAGG-3’(序列编号5)
该序列是在与水平1中所使用的引物(1)互补的区域、与引物(2)互补的区域以及夹在这两者之间的区域中的序列。
由上可以确认，扩增产物是引物对靶核酸进行序列特异性的识别而产生的结果。
<实施例2>表面活性剂的浓度的影响
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将7.5ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
<引物>
作为引物，使用实施例1中所使用的引物(1)及引物(2)。
引物(1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
<表面活性剂>
使用Tween20(式1)作为表面活性剂。
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB社的Bst.Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)                2.5μL
100mM MgSO4                              1.5μL
0％(v/v)-10％(v/v)Tween20                1.25μL
100％DMSO                                1.25μL
25mM dNTP，每种                          1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                  0.5μL
50μM引物(1)                             1.6μL
50μM引物(2)                             1.6μL
Bst.Polymerase                           1.0μL
上述(1)所得到的核酸试样溶液或精制水      1.0μL
精制水                                   11.4μL
                                         25.0μL
设计4个水平进行实验，其中Tween20的最终浓度如下所示。
水平1：Tween20的最终浓度为0.01％
水平2：Tween20的最终浓度为0.05％
水平3：Tween20的最终浓度为0.1％
水平4：Tween20的最终浓度为0.5％
在各水平中，各配制3个添加有核酸试样的样品，以及3个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，从而检测扩增。结果如图7～图10所示。此外，图右侧显示的是在上述的各图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值，单位：分钟)。
在Tween20的最终浓度为0.01％的情况下(水平1)，在阴性对照的3个样品中的1个试样中检测到了扩增。但是，由于其Ct值与存在有核酸试样时的Ct值相差很大，所以采用本发明的扩增法可以检测到核酸试样的存在。
在Tween20的最终浓度为0.05％以上的情况下(水平2～4)，只有存在有核酸试样的样品可以检测出扩增。换言之，采用本发明的扩增法可以检测到核酸试样的存在。
<实施例3>表面活性剂的种类的影响
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将7.5ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
<引物>
作为引物，使用实施例1和2中所使用的引物(1)及引物(2)。
引物(1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
<表面活性剂>
使用以下的9种物质作为表面活性剂进行实验。
水平1：Tween40
Tween40为聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂。更具体地说，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸单酯。其HLB值为15.6，结构式如[式5]所示。此外，Tween40从和光純薬株式会社购入。
[式5]
Figure S2008101332850D00251
水平2：Tween60
Tween60为聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂。更具体地说，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸单酯。其HLB值为15.0，结构式如[式6]所示。此外，Tween60从和光純薬株式会社购入。
[式6]
水平3：Tween80
Tween80为聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂。更具体地说，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸单酯。其HLB值为14.9，结构式如[式7]所示。此外，Tween80从和光純薬株式会社购入。
[式7]
Figure S2008101332850D00253
水平4：Brij-35
Brij-35为聚氧乙烯(23)十二烷基醚，是聚氧乙烯烷基醚类的非离子型表面活性剂。其HLB值为16.9，结构式如[式8]所示。此外，Brij-35从Sigma公司购入。
[式8]
Figure S2008101332850D00261
水平5：Brij-56
Brij-56为聚氧乙烯(10)十六烷基醚，是聚氧乙烯烷基醚类的非离子型表面活性剂。其HLB值为12.9，结构式如[式9]所示。此外，Brij-56从Sigma公司购入。
[式9]
Figure S2008101332850D00262
水平6：Brij-700
Brij-700为聚氧乙烯(100)十八烷基醚，是聚氧乙烯烷基醚类的非离子型表面活性剂。其HLB值为18.8，结构式如[式10]所示。此外，Brij-700从Sigma公司购入。
[式10]
Figure S2008101332850D00263
水平7：TritonX-100
TritonX-100为聚氧乙烯辛基酚醚，是聚氧乙烯烷基酚醚类的非离子型表面活性剂。其HLB值为13.5，结构式如[式11]所示。此外，TritonX-100从和光純薬株式会社购入。
[式11]
Figure S2008101332850D00264
n＝1～15(平均值＝9.5)
水平8：Tween85
Tween85为聚氧乙烯(20)失水山梨醇三油酸酯，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂。更具体地说，是聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸三酯。其HLB值为11.0，结构式如[式12]所示。此外，Tween85从和光純薬株式会社购入。
[式12]
Figure S2008101332850D00271
水平9：Span20
Span20为失水山梨醇单月桂酸酯，是失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂。其HLB值为8.6，结构式如[式13]所示。此外，Span20从和光純薬株式会社购入。
[式13]
Figure S2008101332850D00272
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB社的Bst.Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)                  2.5μL
100mM MgSO4                                1.5μL
10％(v/v)表面活性剂                        0.25μL
100％DMSO                                  1.25μL
25mM dNTP，每种                            1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                    0.5μL
50μM引物(1)                               1.6μL
50μM引物(2)                               1.6μL
Bst.Polymerase                         1.0μL
上述(1)所得到的核酸试样溶液或精制水    1.0μL
精制水                                 12.4μL
                                       25.0μL
在各水平中，各配制3个添加有核酸试样的样品，以及3个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，从而检测扩增。结果如图11～图19所示。此外，图右侧显示的是在上述的各图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值，单位：分钟)。
在水平1～水平7中，使用HLB值为12以上的表面活性剂，只有存在有核酸试样的样品可以检测到扩增。换言之，采用本发明的扩增法可以检测到核酸试样的存在。
在水平8及水平9中，使用HLB值不足12的表面活性剂，从不存在核酸试样的样品(阴性对照)中也可以检测到扩增。但是，如果比较Ct值的话，可以发现，存在有核酸试样的样品与不存在核酸试样的样品之间Ct值存在差异。
由上述结果可以得知，在本发明扩增法中表面活性剂显示了效果，并且可以使用各种物质作为表面活性剂，特别是HLB值为12以上的表面活性剂显示出高性能。
使用引物(1)及引物(2)进行扩增反应时，表面活性剂的效果如表1所示。
此外，从对于存在有核酸试样的样品来说可以检测到扩增所需要的时间的平均值起20分钟以内，如果在不存在核酸试样的样品(阴性对照)中未检测到扩增的话，则认为核酸试样的检测没有问题。满足该条件时，将该表面活性剂的效果评价为“○”。
虽然从对于存在有核酸试样的样品来说可以检测到扩增所需要的时间的平均值起20分钟以内，在不存在核酸试样的样品(阴性对照)中可以检测到扩增，但是如果在5分钟以内扩增速度不加快的话，则认为核酸试样的检测勉强可以进行。满足该条件时，将表面活性剂的效果评价为“△”。
从对于存在有核酸试样的样品来说可以检测到扩增所需要的时间的平均值起5分钟以内，如果在不存在核酸试样的样品(阴性对照)中检测到扩增的话，则认为核酸试样的检测难以进行。满足该条件时，将表面活性剂的效果评价为“×”。
[表1]
  表面活性剂的种类   HLB   效果
  Brij-700   18.8   ○
  Brij-35   16.9   ○
  Tween20   16.7   ○
  Tween40   15.6   ○
  Tween60   15.0   ○
  Tween80   14.9   ○
  TritonX-100   13.5   ○
  Brij-56   12.9   ○
  Tween85   11.0   △
  Span20   8.6   △
  无表面活性剂   -   ×
○：可以检测
△：可以检测，但是与阴性对照的差别不大
×：不能检测
<实施例4>表面活性剂的种类的影响2(改变引物)
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将7.5ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
<引物>
作为引物，使用实施例1中所使用的引物(3)和引物(4)。
引物(3)：
5’-CTTGCTGGCACCCAATA-3’(序列编号3)
引物(4)：
5’-CCGGCGCATGGCTT-3’(序列编号4)
<表面活性剂>
作为表面活性剂，使用实施例3中所使用的9种物质([式5]～[式13])进行实验。
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB社的Bst.Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)                2.5μL
100mM MgSO4                              1.5μL
10％(v/v)表面活性剂                      0.25μL
100％DMSO                                1.25μL
25mM dNTP，每种                          1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                  0.5μL
50μM引物(3)                             1.6μL
50μM引物(4)                             1.6μL
Bst.Polymerase                           1.0μL
上述(1)所得到的核酸试样溶液或精制水      1.0μL
精制水                                   12.4μL
                                         25.0μL
在各水平中，各配制3个添加有核酸试样的样品，以及3个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，从而检测扩增。结果如图20～图28所示。此外，图右侧显示的是在上述的各图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值，单位：分钟)。
在水平1～水平7中，使用HLB值为12以上的表面活性剂，只有存在有核酸试样的样品可以检测到扩增，或者不存在核酸试样的样品(阴性对照)的扩增速度明显很慢。换言之，采用本发明扩增法可以检测到核酸试样的存在。
在水平8及水平9中，使用HLB值不足12的表面活性剂，从不存在核酸试样的样品(阴性对照)中也可以检测出扩增。但是，如果比较Ct值的话，可以发现，存在有核酸试样的样品与不存在核酸试样的样品之间Ct值存在差异。
即，在本发明的扩增法中，可以使用各种表面活性剂，尤其是HLB值为12以上的表面活性剂显示出高性能。
使用引物(3)及引物(4)进行扩增反应时，表面活性剂的效果如表2所示。
此外，从对于存在有核酸试样的样品来说可以检测到扩增所需要的时间的平均值起20分钟以内，如果在不存在核酸试样的样品(阴性对照)中未检测到扩增的话，则认为核酸试样的检测没有问题。满足该条件时，将该表面活性剂的效果评价为“○”。
虽然从对于存在有核酸试样的样品来说可以检测到扩增所需要的时间的平均值起20分钟以内，在不存在核酸试样的样品(阴性对照)中可以检测到扩增，但是如果在5分钟以内扩增速度不加快的话，则认为核酸试样的检测勉强可以进行。满足该条件时，将表面活性剂的效果评价为“△”。
从对于存在有核酸试样的样品来说可以检测到扩增所需要的时间的平均值起5分钟以内，如果在不存在核酸试样的样品(阴性对照)中检测到扩增的话，则认为核酸试样的检测难以进行。满足该条件时，将表面活性剂的效果评价为“×”。
[表2]
Figure S2008101332850D00311
Figure S2008101332850D00321
○：可以检测
△：可以检测，但是与阴性对照的差别不大
×：不能检测
得到了与实施例3一样的结果，由此可以看出，表面活性剂的效果具有普遍性，不依赖于引物。
<实施例5>使用Bca Best Polymerase时的核酸扩增
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将7.5ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
<引物>
作为引物，使用实施例1中所使用的引物(1)及引物(2)。
引物(1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
<表面活性剂>
使用Tween20(式4)作为表面活性剂。
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是TaKaRa公司的Bca Best DNA Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)          2.5μL
100mM MgSO4                        1.5μL
10％(v/v)Tween20                   0.25μL
100％DMSO                          1.25μL
25mM dNTP，每种                         1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                 0.5μL
50μM引物(1)                            1.6μL
50μM引物(2)                            1.6μL
Bca Best DNA Polymerase                 1.0μL
上述(1)所得到的核酸试样溶液或精制水     1.0μL
精制水                                  12.4μL
                                        25.0μL
在各水平中，各配制2个添加有核酸试样的样品，以及2个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
实验中使用的表面活性剂如下设定。
水平1：不含表面活性剂
水平2：含表面活性剂(Tween20)
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，从而检测扩增。结果如图29、图30所示。此外，图右侧显示的是在上述的各图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值，单位：分钟)。
在水平1(不添加表面活性剂的水平)中，从不存在核酸试样的样品(阴性对照)中也可以检测出扩增。换言之，不能够采用本发明扩增法检测到核酸试样的存在。
另一方面，在水平2(添加有表面活性剂的水平)中，只从源自核酸试样的样品中检测到扩增。换言之，采用本发明扩增法能够检测到核酸试样的存在。
本实施例的结果与上述采用Bst.Polymerase作为聚合酶的情况下的结果相同。即，可以确认，表面活性剂的效果具有普遍性，不依赖于链置换型聚合酶的种类。
<实施例6>单碱基变异的检测
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将基因型为β2AR46(A)的人类基因组及基因型为β2AR46(G)的人类基因组7.5ng在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
基因型为β2AR46(G)的人类基因组是基因型为β2AR46(A)的人类基因组中产生了单碱基变异而得到的。
<引物>
作为引物，使用实施例1、4中所使用的引物(3)及引物(4)。
引物(3)：
5’-CTTGCTGGCACCCAATA-3’(序列编号3)
引物(4)：
5’-CCGGCGCATGGCTT-3’(序列编号4)
该引物组合与基因型为β2AR46(A)的人类基因组完全互补。
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB社的Bst.Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)              2.5μL
100mM MgSO4                            1.5μL
10％(v/v)Tween20                       0.25μL
100％DMSO                              1.25μL
25mM dNTP，每种                        1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                0.5μL
50μM引物(3)                           1.6μL
50μM引物(4)                           1.6μL
Bst.Polymerase                         1.0μL
上述(1)所得到的核酸试样溶液或精制水    1.0μL
精制水                                 12.4μL
                                       25.0μL
在各水平中，各配制2个添加有核酸试样的样品，以及2个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，从而检测扩增。结果如图31所示。
与添加有基因型为β2AR46(G)的人类基因组的样品相比，添加有基因型为β2AR46(A)的人类基因组的样品的扩增速度快。因此，通过观察扩增速度的差异，可以利用本发明扩增法来确定人类基因组中是否发生单碱基变异。此外，对于不含核酸试样的样品(阴性对照)而言，未检测到扩增。
采用Mx3000p分析软件，计算在上述图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值)，结果如表3所示。
[表3]
Figure S2008101332850D00351
No Ct表示未发生扩增。
可以看出，基因型为β2AR46(A)的样品的扩增速度确实比基因型为β2AR46(G)的样品的扩增速度快。
<实施例7>检测的加速
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将37.5ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)在98℃下加热3分钟，采用以下的条件对靶核酸中的特定序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将精制水加热制备成样品。
<引物>
作为引物，使用实施例1中所使用的引物(1)及引物(2)。
引物(1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
<表面活性剂>
使用Tween20(式4)作为表面活性剂。
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是TaKaRa社的Bca Best DNA Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)               2.5μL
100mM MgSO4                             1.5μL
10％(v/v)Tween20                        0.25μL
100％DMSO                               1.25μL
25mM dNTP，每种                         1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                 0.5μL
50μM引物(1)                            1.6μL
50μM引物(2)                            1.6μL
Bca Best DNA Polymerase                 1.0μL
上述(1)所得到的核酸试样溶液或精制水     1.0μL
精制水                                  12.4μL
                                        25.0μL
在各水平中，各配制2个添加有核酸试样的样品，以及2个添加有精制水(代替了核酸试样)的样品(阴性对照)。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应，间隔一定的时间测定荧光强度，从而检测扩增。结果如图32所示。此外，图右侧显示的是在上述的图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值，单位：分钟)。
采用本实施例中所示的条件进行扩增反应，在10分钟内成功地检测到靶基因。
<实施例8>采用3种引物进行的核酸扩增反应
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将3.0ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)与预处理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起在98℃下加热3分钟，使之成为单链后，采用以下的条件对β-肌动蛋白基因中的序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将水加热制备成样品。
<引物>
使用β-肌动蛋白基因作为靶进行引物的设计。各引物的序列如下所示。
引物(1)(上游引物1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)(下游引物1)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
引物(3)(下游引物2)：
5’-GATGGGGTACTTCAGGGT-3’(序列编号6)
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB社的Bst.DNA Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)               2.5μL
100mM MgSO4                             1.5μL
10％(v/v)Tween20                        0.25μL
100％DMSO                               1.25μL
25mM dNTP，每种                         1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                 0.5μL
50μM引物(1)                            1.8μL
50μM引物(2)                            1.8μL
50μM引物(3)                            1.8μL
Bst.Polymerase                          1.0μL
上述(1)所得到的核酸片段试样溶液(3.0ng)  1.0μL
精制水                      10.2μL
                            25.0μL
作为阴性对照，添加水以替换核酸片段试样溶液。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应。结果如图33所示。
可以看出，只有来源于核酸试样的样品发生了扩增。换言之，以水代替核酸试样溶液而得到的样品未发生非特异性扩增。这里，采用Mx3000p分析软件，计算在上述的图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值)，结果如表4所示。
[表4]
Figure S2008101332850D00381
No Ct表示未发生扩增。
<实施例9>采用4个增效引物进行的核酸扩增方法
(1)含有靶核酸片段的核酸试样溶液的配制
将3.0ng的Human Genomic DNA(Clontech公司制造)与预处理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起在98℃下加热3分钟，使其成为单链后，采用以下的条件对β-肌动蛋白基因中的序列进行扩增。此外，作为阴性对照，在与上述一样的条件下将水加热制备成样品。
<引物>
使用β-肌动蛋白基因作为靶进行引物的设计。各引物的序列如下所示。
引物(1)(上游引物1)：
5’-GGGCATGGGTCAGAAGGATT-3’(序列编号1)
引物(2)(下游引物1)：
5’-CCTCGTCGCCCACATAG-3’(序列编号2)
引物(3)(下游引物2)：
5’-GATGGGGTACTTCAGGGT-3’(序列编号6)
引物(4)(上游引物2)：
5’-TGTCCTTTCCTTCCCAG-3’(序列编号7)
(2)核酸扩增反应
采用具有如下所示组成的反应液，在60℃下反应60分钟，以实施扩增反应。酶使用的是NEB社的Bst.DNA Polymerase。
<反应液的组成>
10×Bst缓冲液(不含洗涤剂)               2.5μL
100mM MgSO4                             1.5μL
10％(v/v)Tween20                        0.25μL
100％DMSO                               1.25μL
25mM dNTP，每种                         1.4μL
SYBR GreenI(稀释2000倍)                 0.5μL
50μM引物(1)                            1.8μL
50μM引物(2)                            1.8μL
50μM引物(3)                            1.8μL
50μM引物(4)                            1.8μL
Bst.Polymerase                          1.0μL
上述(1)所得到的核酸片段试样溶液(3.0ng)  1.0μL
精制水                                  8.4μL
                                        25.0μL
作为阴性对照，添加水以替换核酸片段试样溶液。
(3)扩增产物的检测
采用实时荧光检测装置(Mx3000p，Stratagene公司制造)进行上述(2)中的扩增反应。结果如图34所示。
可以看出，只有来源于核酸试样的样品发生了扩增。换言之，由水代替核酸试样溶液而得到的样品未发生非特异性扩增。这里，采用Mx3000p的分析软件，计算在上述的图中荧光量达到250时所需要的时间(Ct值)，结果如表5所示。
[表5]
Figure S2008101332850D00401
No Ct表示未发生扩增。
相对于实施例1，实施例8及9为追加了引物的实施例，可以确认，扩增速度确实得到了提高。
序列表
<110>富士胶片株式会社
<120>核酸的扩增方法
<130>FI-081038-59：56
<150>JP No.2007-194273
<151>2007-07-26
<150>JP No.2008-117510
<151>2008-04-28
<160>7
<170>Patentln version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>1
gggcatgggt cagaaggatt                 20
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>2
cctcgtcgcc cacatag                     17
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>3
cttgctggca cccaata                    20
<210>4
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>4
ccggcgcatg gctt                              14
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>5
gggcatgggt cagaaggatt cctatgtggg cgacgagg    38
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>6
gatggggtac ttcagggt                          18
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成DNA
<400>7
tgtcctttcc ttcccag                           17

Claims (19)

1.一种核酸的扩增方法，其包括：将含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少0.01％以上的表面活性剂、至少两种寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液，在基本上恒温的条件下进行孵育，以所述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应，从而将所述核酸片段扩增，其中所述反应溶液不含具有在5’末端与从3’末端延伸出来的部分互补而形成环状结构那样的结构的寡核苷酸引物，并且所述寡核苷酸引物也不具有其中在反应过程中该引物被切断，被切断后的3’末端成为新的合成起点的结构，
其中所述的至少两种寡核苷酸引物具有与模板DNA互补的碱基序列，并且从所述的寡核苷酸引物的3′末端可以进行DNA链的延伸，并且
其中，将所述反应溶液在大于或等于50℃而小于或等于100℃的基本上恒温条件下进行孵育，
其中，所述表面活性剂为HLB值在14以上的非离子型表面活性剂，并且
其中，所述反应溶液中含有大于或等于1μM而小于或等于50μM的所述寡核苷酸引物。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述反应溶液中含有至少0.05％以上的表面活性剂。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂为聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯失水山梨醇单脂肪酸酯以下述化学式表示，
Figure FSB0000115679620000021
式中，x+y+z+w=20，R表示碳原子数为12～18的烷基。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类的非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯中的至少一种。
7.权利要求1所述的方法，其中，所述反应溶液中还含有解链温度调节剂。
8.权利要求7所述的方法，其中，所述解链温度调节剂为二甲基亚砜、甜菜碱、甲酰胺或甘油、或者它们两种以上的混合物。
9.权利要求1所述的方法，其中，所述反应溶液中含有的至少一种脱氧核苷三磷酸的浓度均为大于或等于0.1mM而小于或等于3.0mM。
10.权利要求1所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物只有3’末端区域与所述模板核酸片段基本上互补。
11.权利要求10所述的方法，其中，所述寡核苷酸引物只与所述模板核酸片段的连续核苷酸的一处基本上互补。
12.权利要求1所述的方法，其特征在于，模板上的分别退火有至少两种的寡核苷酸引物的区域位于模板上的1000bp以内的区域中。
13.权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种的具有链置换能力的聚合酶为选自来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的5’→3’外切核酸酶缺失的Bst.DNA聚合酶、来源于热坚芽孢杆菌的5’→3’外切核酸酶缺失的Bca DNA聚合酶、及来源于Thermococcus litoralis的5’→3’外切核酸酶缺失的Vent.DNA聚合酶中的聚合酶。
14.权利要求1所述的方法，其中，将所述反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的时间为60分钟以内。
15.权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，除了所述至少两种的寡核苷酸引物之外，还向反应溶液中加入一种以上的追加的寡核苷酸引物，进行反应。
16.权利要求15所述的核酸扩增方法，其特征在于，模板上的分别退火有所述至少两种的寡核苷酸引物及所述一种以上的追加的寡核苷酸引物的区域分别位于模板上的1000bp以内的区域中。
17.一种检测目标核酸序列中有无发生变异的方法，该方法包括进行权利要求1～16中任意一项所述的核酸扩增方法，其中所述方法用于非诊断目的。
18.权利要求17所述的方法，其包括以下的工序：
(1)将反应溶液在基本上恒温的条件下进行孵育的工序，其中所述反应溶液中含有至少一种脱氧核苷三磷酸、至少一种具有链置换能力的DNA聚合酶、二价阳离子、至少一种非离子型表面活性剂、至少两种含有变异部位的寡核苷酸引物、以及作为模板的含有目标核酸序列的核酸片段，但是，所述反应溶液不含具有在5’末端与从3’末端延伸出来的部分互补而形成环状结构那样的结构的寡核苷酸引物；以及，
(2)根据是否发生核酸扩增反应来判断有无发生变异的工序，其中所述核酸扩增反应是以所述引物的3’末端作为起点进行聚合酶反应而进行的。
19.权利要求18所述的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基醚类。
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