JP6762083B2 - 刺激応答性磁性ナノ粒子を用いた遺伝子検査方法 - Google Patents
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Description
従って、近年、クリプトスポリジウムの研究にも遺伝子学的手法が用いられるようになり、種の同定や型別を比較的容易に行うことができるようになってきている。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。
(1)刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
(2)刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
(3)凝集した結合体を磁石で回収する工程
(4)回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程
2.前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体である前記1に記載の遺伝子検査方法。
3.前記ポリオキシエチレン誘導体が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート及びポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも1である前記2に記載の遺伝子検査方法。
4.前記核酸増幅を行う工程における、前記非イオン性界面活性剤の濃度が、0.1〜5質量%である、前記1〜3のいずれか1に記載の遺伝子検査方法。
5.前記核酸増幅を行う工程で使用する核酸増幅酵素が、Taqポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、又はAacポリメラーゼのいずれかであることを特徴とする、前記1〜4のいずれか1に記載の遺伝子検査方法。
本発明は、被検試料中の核酸を回収し、核酸増幅を行う遺伝子検査方法であって、以下の工程(1)〜(4)を含む遺伝子検査方法である。
(1)刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
(2)刺激応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
(3)凝集した結合体を磁石で回収する工程
(4)回収した結合体を、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行う工程
(1)刺激応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
被検試料としては特に限定されず、例えば、動物(ヒトを含む)、植物、微生物(原虫、原生動物等も含む)等の生物を対象とすることが可能である。また、被検試料としては、例えば、クリプトスポリジウムのようなオーシストを形成した原虫等であっても、本発明の被検試料として適用することができる。被検試料としては他にも、ウイルス、細菌、真菌等が挙げられる。
本発明における、「核酸」とは、DNA、RNA及びこれらの誘導体を含む概念として用いられているものである。
例えば、動物由来の被検試料からの核酸としては、血清、血漿等の血液成分からの血中遊離DNA、ウイルスDNA等のDNA、血中遊離メッセンジャーRNA、ウイルスRNA等のRNA、原虫・細菌由来のDNA、リボソームRNA、メッセンジャーRNA等が挙げられる。
本発明において吸着材は、核酸を回収するために用いることができる。吸着材は、刺激応答性磁性ナノ粒子及び核酸に対する親和性物質を有し、両者が結合してなるものである。
本発明においては、被検試料を含む水溶液中の核酸の回収に刺激応答性磁性ナノ粒子を使用する。刺激応答性磁性ナノ粒子を使用することによって、後述する核酸増幅の際に、核酸と刺激応答性磁性ナノ粒子とを分離することによる核酸の精製を行う必要がなく、簡易に検出対象の検出を行うことができる。
このようなpH応答性ポリマーとしては、例えば、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが挙げられる。より具体的には、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、ビニルスルホン酸、ビニルベンゼンスルホン酸、ホスホリルエチル(メタ)アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル(メタ)アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル(メタ)アクリルアミドまたはこれらの塩を共重合成分として含むポリマーが挙げられる。
本発明で用いられる親和性物質としては、核酸に対して結合するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、核酸、アプタマー、カチオン性官能基を有する物質(例えば、1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基、4級アンモニウム基またはグアニジノ基を有する物質)、アニオン性官能基を有する物質、標的物質と相互作用する蛋白質(例えば、酵素、レセプター)、キレート剤などが挙げられる。
刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質との結合方法は、特に限定されないが、例えば、刺激応答性磁性ナノ粒子側(例えば刺激応答性ポリマー部分)及び親和性物質側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、ビオチン及びストレプトアビジンまたはアビジン)を結合させ、これら物質を介して刺激応答性磁性ナノ粒子と親和性物質を結合させる。
上述した吸着材と核酸との結合体は、水溶液中で吸着材と核酸を任意の方法で混合させることによって、吸着材中の親和性物質と核酸が結合し、吸着材と核酸の結合体が生成する。親和性物質と核酸との結合は、特異的な結合ないし吸着を意味し、必ずしも共有結合である必要はなく、イオン的、生化学的親和性(アフィニティー)を利用した結合であってもよい。混合操作は、適当なバッファー中で、吸着材と核酸が接触し得るならば制限はない。例えば、核酸を含む被検試料及び吸着材が供されたチューブを軽く転倒撹拌または振とうさせる程度で十分であり、例えば市販のボルテックスミキサー等を用いて混合する操作等が挙げられる。
本工程は核酸回収の第2段階として、工程(1)において核酸と吸着材の結合体が得られた後、刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、結合体を凝集させる工程である。
本工程は検出対象回収の最終段階として、工程(2)で凝集した結合体を磁石で分離し、検出対象を回収する工程である。磁性粒子を含有する結合体に磁力を付加することで、凝集した結合体を混合液中から分離し、回収する。これにより、結合体が非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離され、検出対象の回収が可能となる。
本工程は、上記工程で回収された結合体中の核酸を試料として核酸増幅を行う工程である。上述したように、吸着材中の刺激応答性磁性ナノ粒子は、反応液中の刺激応答性磁性ナノ粒子の濃度が高いと、逆転写反応や核酸増幅を阻害しうる。そのためこれまでは逆転写反応や核酸増幅試験の前に核酸と磁性微粒子とを分離することにより核酸の精製を行う必要があった。しかしながら本発明では、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応及び核酸増幅の阻害を軽減することができる。
本工程では、非イオン性界面活性剤の存在下で核酸増幅を行うことによって、刺激応答性磁性ナノ粒子による逆転写反応や核酸増幅の阻害を軽減することができる。
但し、「%」は「質量%」を示す。
(1)オーシスト回収用磁性ナノ粒子(TM−AC)の作製
アビジンが結合している熱応答性磁性ナノ粒子(Therma−Max LA Avidin,4g/l,JNC株式会社)1mlとC.parvumオーシストに特異的なビオチン化モノクローナル抗体(Crypt−a−Glo biotin reagentキット(20倍濃縮),Waterborne社)20μlを混合・結合させて、オーシスト回収用磁性ナノ粒子(Therma−Max−Anti−Cryptosporidium:TM−AC)を作製した。
TM−ACの終濃度を0.1%に調製し、DNA試料とともに、リアルタイムPCRを行った。
<DNA試料>
クリプトスポリジウムのDNA試料として、人工合成DNA(C.parvum 18S rDNA gene,192bp)(ttta tggaagggtt gtatttatta gataaagaac caatataatt ggtgactcat aataacttta cggatcacat taaatgtgac atatcattca agtttctgac ctatcagctt tagacggtag ggtattggcc taccgtggca atgacgggta acggggaatt agggttcgat tccggagagg gagcctga:配列番号1)が挿入されたDNAプラスミド溶液(ユーロフィンジェノミクス社)を用いた。
PCRはクリプトスポリジウム18S rDNA遺伝子に特異的なプライマーセット
forward:5’− GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAGAACC−3’(配列番号2)、reverse:5’− CTCCCTCTCCGGAATCGAA−3(配列番号3)(各5μM)0.8μlとTaqManプローブ:TCTGACCZATCAGCTT(配列番号4)(1μM)2.0μl、PCR試薬Premix EX Taq(タカラバイオ株式会社)10μl、Tween20(Tween20(登録商標)、Molecular Biology Grade、Promega製)、リアルタイムPCR(LightCycler Nano,ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用いて行った。Tween20は終濃度が5%となるよう調整した。陽生対照(5×106copies/ml)の添加量は2μl、PCRの反応液量は20μlで行った。
PCR条件は「Hold;1cycle(95℃、30s),2Step PCR;45cycles(60℃、30s,95℃、10s)」で行った。Ct値(Threshold Cycle)はLightCycler Nano ソフトウェアで解析した。
比較例1は、PCR時にTween20を添加しなかったこと以外は、実施例1と同様に試験を行った。
[実施例2、比較例2]
実施例2は、TM−ACの終濃度を0.5%に調製したこと以外は、実施例1と同様に試験を行った。比較例2は、TM−ACの終濃度を0.5%に調製し、PCR時にTween20を添加しなかったこと以外は、実施例1と同様に試験を行った。
[対照例1、2]
対照例1は、TM−ACの終濃度を0%としたこと以外は、実施例1と同様に試験を行った。対照例2は、TM−ACの終濃度を0%とし、PCR時にTween20を添加しなかったこと以外は、実施例1と同様に試験を行った。
2 磁性物質
3 刺激応答性ポリマー
4 ストレプトアビジン
5 ビオチン
6 親和性物質
7 検出対象
Claims (3)
- 被検試料中の核酸を回収し、核酸増幅を行う遺伝子検査方法であって、以下の工程(1)〜(4)を含む遺伝子検査方法。
(1)熱応答性磁性ナノ粒子及び標的の核酸に対する親和性物質を有する吸着材と前記核酸との結合体を、被検試料を含む水溶液中で生成させる工程
(2)熱応答性磁性ナノ粒子が凝集する条件下におき、前記結合体を凝集させる工程
(3)凝集した結合体を磁石で回収する工程
(4)回収した結合体を、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート(Tween20)の存在下で核酸増幅を行う工程
(ただし、前記(4)核酸増幅を行う工程における、前記熱応答性磁性ナノ粒子の濃度は、0.1〜0.5質量%である。) - 前記核酸増幅を行う工程における、前記ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート(Tween20)の濃度が、0.1〜5質量%である、請求項1に記載の遺伝子検査方法。
- 前記核酸増幅を行う工程で使用する核酸増幅酵素が、Taqポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、又はAacポリメラーゼのいずれかであることを特徴とする、請求項1または2に記載の遺伝子検査方法。
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