JP4161167B2 - ウイルス濃縮方法、ウイルス検出方法およびウイルス濃縮用試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のウイルスを濃縮するためのウイルス濃縮方法、ウイルス検査方法およびウイルス濃縮用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスはヒトや動植物のさまざまな病気の原因の一つであり、その検査・診断のためには原因ウイルスの確認が非常に重要である。従来のウイルス検査・診断法としては、ウイルス抗原あるいは抗ウイルス抗体の免疫学的測定が一般的である。しかしながら、ウイルス感染から数週間〜数ヶ月は、ウイルス量あるいは抗ウイルス抗体量が少ないため、これらの免疫学的測定法では検出できない場合がある。この検出不可能な期間はウインドウ・ピリオド（空白期間）と呼ばれており、このような患者が献血を行った場合、その献血液は十分な感染性を持つことが多く、不特定多数の輸血患者・血液製剤利用患者に危険をおよぼす可能性がある。したがって、ウインドウ・ピリオドをできる限り短縮するため、免疫学的測定限界下のウイルスを高感度に検出できる技術の開発が急務とされている。
また、種々の抗ウイルス剤が臨床応用され始めたことによりその治療効果の確認のため極低濃度のウイルスを検出する技術も必要とされている。また、細胞培養等によって生産されるバイオ医薬品の安全性確保のため、ウイルスを高感度に検出することが重要となってきている。
【０００３】
近年、ポリメラーゼチェインリアクション法（以下ＰＣＲ法）に代表される、核酸増幅技術により、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてきた。しかしながら、ＰＣＲ法などによっても極微量のウイルス検出は特殊な施設と高度な技術が必要とされ、一般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難である。そこで、これらの問題解決のため、検体中のウイルスを濃縮する手法が用いられている。
【０００４】
従来のウイルス濃縮法の代表例としては超遠心法が挙げられるが、高価な機器と長時間を要し、かつ同時に多数の検体を処理することは困難であり簡便な方法とは言い難い。また、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）がヘパリンと結合する性質から、ヘパリンセファロース担体によるクロマトグラフィー法も報告されているが、これも同時に多数の検体を処理することは困難である。その他、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコール、ポリアニオンと２価イオンの組み合わせ、例えば酸性基を有する粒状物質（特公平６−２２６２７号公報）や粒子と２価金属を用いる方法（特開平６−２１７７６７号公報）、カチオン性基を有する水溶性高分子物質を加えウィルス除去する方法（特開平４−３４２５３６号公報）等によりウイルスを沈殿させる方法があるが、混合する試薬や分離されるウィルスに混入する多量の蛋白などにＰＣＲ阻害がある等の問題からウイルスの沈殿分離後の試料精製が必要であるという難点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のウイルス濃縮法の問題点を解決し、簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、自動化への対応も容易で、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさないウイルス濃縮方法、ウイルス濃縮用試薬およびウイルス検出方法を提供することにある。
【０００６】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは研究の結果、上記課題を解決する手段として、次の濃縮方法および濃縮用試薬を開発するに到った。
すなわち本発明は、（Ａ）標的ウイルスの表面抗原に対する抗体（以下、「特定抗ウイルス抗体」と称することがある）の存在下、ウイルスを含有する可能性のある試料と粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含む）を有する粒子（以下、「ウィルス濃縮用粒子」と称することがある）とを接触させ、ウィルスを前記粒子に付着させる工程、
（Ｂ）ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程
を含むことを特徴とするウイルス濃縮方法、
、（Ａ）標的ウイルスの表面抗原に対する抗体（以下、「特定抗ウイルス抗体」と称することがある）の存在下、ウイルスを含有する可能性のある試料と粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含む）を有する粒子（以下、「ウィルス濃縮用粒子」と称することがある）とを接触させ、ウィルスを前記粒子に付着させる工程、
（Ｂ）ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程
（Ｃ）濃縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する工程
を含むことを特徴とするウイルス検出方法
ならびに粒子表面にカチオン性基を有する粒子と標的ウイルスの表面抗原に対する抗体からなることを特徴とするウイルス濃縮用試薬を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
〈ウイルス濃縮用粒子〉
本発明において、ウイルス濃縮用粒子とは、血液や体液等の検体中のウイルスを吸着した後、分離または濃縮する粒子であり、当該粒子により分離または濃縮されたウイルスは核酸抽出・検査・診断、特に核酸増幅を伴う検査・診断に用いられる。本発明で用いるウイルス濃縮用粒子は粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含む）を有し、粒径が０．５〜300μｍである。
【０００８】
本発明のウイルス濃縮用粒子は、水不溶性の材料であれば特に限定されず、そのような材料からなる粒子と該粒子の表面に存在するカチオン性基とから構成されている。
本発明のウイルス濃縮用粒子におけるカチオン性基は、アミノ基、アンモニウム基、イミノ基、アミジノ基、イミジノ基、ヒドラジノ基；さらにピリジル基等の窒素原子を含む環状基等を挙げることができる。カチオン性基は、アミノ基等のプロトンと結合してカチオンを形成し得る基および該基が酸と反応して塩を生成し、塩のカチオン部を形成している基を包含する。
カチオン性基は、水や緩衝液、血液、体液中に溶出するとＰＣＲ法などの核酸増幅法を阻害することがあるため、粒子に化学的に結合されている必要がある。その存在量は、粒子１ｇ当り平均で１×１０-10当量以上であり、代表的には１×１０-10〜１×１０-2当量であり、好ましくは１×１０-9〜１×１０-3当量であり、より好ましくは１×１０-8〜１×１０-3当量である。カチオン性基の存在量が粒子１ｇ当り１×１０-10当量より少ないとウイルス濃縮能力が不十分である。限定するものではないが、通常、粒径１ｇ当り１×１０-2当量より多くのカチオン性基を導入することは困難なことが多い。
【０００９】
このようなカチオン性基を有する粒子は、例えば（１）カチオン性モノマーを含むモノマー成分を重合する方法、（２）カチオン性基を有する重合開始剤を使用してモノマーを重合する方法、（３）カチオン性基を有する化合物を粒子に結合させる方法などにより製造することができる。
（１）カチオン性モノマーを含むモノマー成分を重合する方法
この方法において、使用することのできるカチオン性モノマーとしては、
２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート等のアミノアルキル基含有（メタ）アクリル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩；
２−（ジメチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（ジエチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、３−（ジメチルアミノエトキシ）プロピル（メタ）アクリレート等のアミノアルコキシアルキル基含有（メタ）アクリル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩；
Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミド等のＮ−アミノアルキル基含有（メタ）アクリルアミド類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩等が挙げられる。なかでも、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、及びこれらの塩化メチレンによる４級塩が好ましい。
これらは、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１０】
カチオン性モノマーと共重合するモノマーとしては、下記に示すような架橋性モノマーならびに非架橋かつ非イオン性モノマーを挙げることができる。
架橋性モノマーとしては、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１,４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１,６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、２，２'−ビス〔４−（メタ）アクリロイルオキシプロピオキシフェニル〕プロパン、２，２'−ビス〔４−（メタ）アクリロイルオキシジエトキジフェニル〕プロパン、グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールブロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等のジビニル系モノマー、トリビニル系モノマー及びテトラビニル系モノマーが挙げられる。なかでも、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレートおよびトリメチロールプロパントリメタクリレートが好ましい。
これらは１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１１】
共重合可能な非架橋性かつ非イオン性モノマーは、カチオン性モノマーあるいは架橋性モノマーのいずれかと共重合可能であって、非架橋性かつ非イオン性のモノマーである。
このようなモノマーとして、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の芳香族ビニル単量体；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステル；ブタジエン、イソプレン等のジオレフィン；酢酸ビニル等のカルボン酸ビニルエステル；塩化ビニル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン等を挙げることができる。なかでも、スチレン、α−メチルスチレン、アクリロニトリル、メチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートが好ましい。
これらのモノマーは、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１２】
上記カチオン性モノマーを含む重合成分は水系分散媒中で重合開始剤の存在下、乳化重合、懸濁重合などにより重合される。
重合開始剤としては、過硫酸塩類、あるいは過酸化水素−塩化第一鉄、クメンヒドロペルオキシド−アスコルビン酸ナトリウム等のレドックス系の水溶性重合開始剤、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、アゾビスイソブチロニトリルなどの油溶性重合開始剤が例示される。
また、必要に応じて界面活性剤、分散安定剤などを使用することもできる。
【００１３】
（２）カチオン性基を有するラジカル重合開始剤を使用する方法
このラジカル重合開始剤は、これを用いたラジカル重合により得られたポリマーがその末端に該ラジカル重合開始剤に由来するカチオン性基を有するようになるものである。
好ましいカチオン性基を有するラジカル重合開始剤としては、アミジノ基、イミジノ基あるいはピリジウム基を有するアゾビス型の開始剤が挙げられる。また、１０時間半減期温度が４０〜９５℃の範囲にあるものが温和な条件下で重合を行うことができるので好ましい。
カチオン性基を有するラジカル重合開始剤の好ましい具体例として、下記のものを挙げることができる。
【００１４】
２,２'−アゾビス（２−メチル−Ｎ−フェニルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５４５として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（４−クロロフェニル）−２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５４６として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５４８として販売）
２,２'−アゾビス〔２−メチル−Ｎ−（フェニルメチル）−プロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５５２として販売）
２,２'−アゾビス〔２−メチル−Ｎ−（２−プロペニル）プロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５５３として販売）
２,２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名Ｖ−５０として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５５８として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ハイドレート（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５７として販売）
【００１５】
２,２'−アゾビス〔２−メチル−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０４１として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０４４として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアゼピン−２−イル）プロパン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５４として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）プロパン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５８として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（５−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）プロパン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５９として販売）
２,２'−アゾビス{２−〔１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン−２−イル〕プロパン}ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０６０として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０６１として販売）
なかでも、２,２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（Ｖ−５０）、２,２'−アゾビス〔Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ハイドレート（ＶＡ−０５７）、２,２'−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（ＶＡ−０４４）の使用が好ましい。
カチオン性基を有するラジカル重合開始剤の使用量は、重合に使用するモノマー総合計量１００重量部当たり、０．１〜１０重量部用いることが好ましく、より好ましくは０．５〜５重量部である。使用量が０．１重量部未満と過少では、得られる粒子のカチオン性が低下し、１０重量部を越えて過剰では重合が不安定となり、好ましくない。
【００１６】
（３）カチオン性基を有する化合物を粒子に結合させる方法
粒子表面にカルボキシル基、ハイドロキシル基、エポキシ基、アミノ基、アミド基などの官能基を有するモノマーを共重合やシード重合し、それらの官能基を結合部として反応させることにより、カチオン性基を有する化合物を粒子表面に導入することができる。
ここで、官能基を有するモノマーをアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを挙げることができる。
カチオン性基を有する化合物としては、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリアミン化合物、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンなどのポリアミノ酸類、前述のカチオン性基を有するモノマーを共重合したポリマーなどを挙げることができる。
【００１７】
本発明で使用できるウィルス濃縮用粒子は、その粒子の内部または表面に磁性体を含有することもできる。
この磁性体は該粒子の内部のみに含有され、表面に露出していないことが好ましい。本発明においては、ウイルス濃縮用粒子に磁性体を含有させることにより、該粒子の磁気を作用させて収集することが可能となり、遠心分離等による操作が不要で検査時間を短縮させることが可能となるほか、検査・診断の自動化への対応も容易となる。このような磁性体は、例えば四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属またはこれら金属の合金などを用いることができる。
【００１８】
磁性体の含有量は、ウイルス濃縮用粒子全体に対し10重量％以上、特に20〜100重量％であることが好ましい。この量が少なすぎると、該ウイルス濃縮用粒子に、良好な磁気分離性が得られず、その結果、後述するウイルスの分離・濃縮方法において、血液または体液等の検体からウイルス濃縮用粒子を分離するために相当に長い時間を要するので、高い時間的効率が得られないことがあり、好ましくない。
【００１９】
磁性体をウィルス濃縮用粒子に含有させるには、
（ａ）カチオン性モノマーを含む重合成分に磁性体を分散して重合を行う。重合方法としては、通常の乳化重合、懸濁重合、分散重合などの方法が挙げられる。
（ｂ）カチオン性モノマーを含む重合成分を重合して重合体粒子を合成後、該粒子表面に、磁性体層を形成する。
（ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）で得られた粒子表面に、さらにカチオン性モノマーを含む重合成分とする重合体層を形成する
などの方法をとることができる。
このようにして得られるウィルス濃縮粒子は、その分散媒に乳化剤、分散剤、未反応モノマー、水溶性ポリマー、重合開始剤の分解物などを含んでいる場合がある。
これらの物質は、核酸増幅検査段階において反応阻害物となる可能性が高いため、例えばAdv.Colloid Interface Sci.,81,77〜165(1999)などに示される方法によりウィルス濃縮用粒子の分散媒から除去することが好ましい。
後述するカチオン性基の定量に滴定を採用する場合には、最終的に混床型イオン交換樹脂などを用いてウィルス濃縮用粒子を精製することが好ましい。
また、本発明のウイルス濃縮用粒子は血漿や血清等の検体中のウイルスを高い効率で濃縮するため、通常、カラムクロマト法ではなくバッチ法にて使用される。したがって、粒子の粒径は通常0.08μm〜300μm、好ましくは0.1μm〜100μmである。粒径がこの範囲内であれば粒径が均一でなくても本発明の目的のために使用することが可能である。粒径が0.08μm未満の場合は、血液または体液からウイルス濃縮用粒子を分離する際の遠心分離の回転数や回転時間の増加を招き、装置が大型になったり、高い時間的効率が得られず好ましくない。また、粒径が300μmを越える場合は、ウイルスを捕獲する効率が低下し、ウイルス濃縮が十分に行えないことがあるため好ましくない。また、本発明のウイルス濃縮用粒子の粒子形状は球状である必要はなく、異形粒子であってもかまわない。なお球状でない粒子の粒径としては、それぞれの粒子の最長径と最短径との平均値をとるものとする。
【００２０】
（特定抗ウイルス抗体）
本発明に用いられる特定抗ウイルス抗体は、標的ウィルスの表面タンパクや糖脂質などウイルス表面抗原に対する抗体であり、さらには変異ウイルス株全てに存在する共通抗原に対する抗体であることが好ましいが、各変異ウイルス株特異的な抗原に対する抗体の混合物を用いることも可能である。また、複数のウイルスを同時に濃縮する場合は、各ウイルスに対する抗ウイルス抗体を混合して用いることができる。
標的ウィルスとしては、例えばヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、Ｃ型肝炎ウイルス等を挙げることができる。
【００２１】
（ウィルス濃縮用試薬）
本発明において、ウィルス濃縮用試薬とは、前記ウィルス濃縮用粒子と特定抗ウイルス抗体からなる。ウイルス濃縮用粒子は単独で用いても、ウイルス濃縮作用を持つが、特定抗ウイルス抗体と併用することにより、タンパク質濃度や脂質濃度が極端に高い場合などのウイルス濃縮が不安定な条件下でも、安定したウイルス濃縮作用を保つことができる。
さらに、デキストラン、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子を併用すると、ウイルス濃縮用粒子へのウイルス吸着効率を向上することができる。これらの水溶性高分子としては、デキストラン、グリコーゲン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの中性水溶性高分子が好ましく用いることができる。これらの水溶性高分子の分子量としては、500〜10,000,000のものが好ましく、2,000〜5,000,000が特に好ましい。
ウイルス濃縮用粒子、特定抗ウイルス抗体および/または水溶性高分子は、それぞれ別々に試料液に添加されても、あらかじめ混合液とした上で試料液に添加してもかまわない。あらかじめ混合液とした場合、その状態で保存することも可能である。
【００２２】
〈ウイルス濃縮方法〉
次に、本発明のウイルス濃縮用試薬によるウイルス濃縮方法について具体的に説明する。
本発明のウイルス濃縮用試薬は各種ウイルスに対して特定抗ウイルス抗体を使用することにより優れた濃縮作用を発揮する、例えばヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルスの濃縮が可能である。
【００２３】
本発明のウイルス濃縮用試薬によるウイルス濃縮の対象となる検体としては、血漿、血清、細胞破砕液、尿、唾液等の各種体液、培養細胞上清液等を挙げることができる。このような検体はそのまま試料として使用されてもよいし、何らかの目的で希釈された状態で試料として使用されてもよい。
【００２４】
本発明のウイルス濃縮用粒子は、試料１ｍｌあたりの通常0.1〜100 mg、好ましくは0.5〜50 mgとなる割合で使用される。また、特定抗ウイルス抗体は試料１ｍｌあたり通常0.1〜100μg、好ましくは0.2〜80μgの割合で使用される。
ウイルス濃縮用粒子および特定抗ウイルス抗体の添加量が少なすぎると、ウイルス濃縮用粒子に付着できるウイルスの数が限られるため濃縮効率が悪化する。また、添加量が多すぎると、付着したウイルスを後段階で脱離させるのに多量の脱離液が必要となり濃縮効率が低下する。
ウイルス濃縮効率を向上させる目的で水溶性高分子を添加する場合、水溶性高分子の添加量は試料１ｍあたり通常、0.1〜100mg、好ましくは0.5〜50mgである。
【００２５】
試料中のウイルスを吸着したウイルス濃縮用粒子は、遠心分離あるいは自然沈降により、またウィルス濃縮用粒子が磁性体を含有する場合には磁気分離により試料から分離される。本発明で使用されるウイルス濃縮用粒子は通常、0.08〜300μmの粒径範囲を持つので、遠心機でも十分遠心分離が可能である。
分離されたウイルス濃縮用粒子は必要に応じて、低濃度の緩衝液で洗浄した後、ウイルスの粒子からの分離、核酸の抽出工程に移る。なお、核酸抽出は、ウイルスが粒子に付着したままでも行うことができる。例えば、分離されたウイルス濃縮用粒子に少量の緩衝液を加え、加熱することで直接、ウイルスの核酸を抽出することも可能であるし、市販されている核酸抽出試薬を直接添加してウイルスの核酸を抽出することも可能である。
【００２６】
ウイルスを粒子から分離する方法としては、塩溶液を作用させてウイルス濃縮用粒子とウイルスとを解離させる方法がある。塩溶液としては高濃度の臭化カリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、1mMリンタングステン酸等を用いることができる。
【００２７】
〈ウイルス検出方法〉
このウイルス検出方法は、上記のようにしてウイルスが付着した本発明の粒子を試料から分離、収集することによりウイルスを濃縮する段階ののち、こうして濃縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する段階を有している。
【００２８】
ウイルスの核酸増幅検査（ＮＡＴ; nucleic acid amplification test）の方法は特に限定されず、例えば、ロシュ社のＰＣＲ(Polymerization chain reaction)法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ(Transcription Mediated amplification-hybridization protection assay)法、アボット社のＬＣＲ(Ligase chain reaction)法、栄研化学社のＬＡＭＰ法（Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA）、宝酒造社のＩＣＡＮ法（Isothermal and chimeric pimer-initiated amplification of nucleic aced）等を利用することができる。
このウイルス濃縮方法を利用したウイルス検出法では、核酸増幅検査に供される検体中のウイルスが既に濃縮されているので、元の検体または試料に含まれているウイルスが極く微量であっても効率的にウイルスの検出を行うことができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例において得られるウィルス濃縮用粒子の粒径およびカチオン性基の存在量について下記の方法で定量した。
粒径の測定：光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡または透過型電子顕微鏡により写真撮影を行い２００個の粒子の粒径を測定し、その平均値を求めた。
カチオン性基の存在量：
▲１▼伝導度滴定法 ウィルス濃縮用粒子を遠心分離あるいは磁気分離により純水で２回洗浄し、粒子１gあたり混床型イオン交換樹脂５ｇを添加し、混合後１時間攪拌した後、混床型イオン交換樹脂を濾去した。この混床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した。得られた精製粒子を硫酸規定液を滴定液として滴定した。この方法は実験例１に適用した。
▲２▼非水滴定法 上記▲１▼と同様にウィルス濃縮用粒子を精製後、乾燥しクロロホルムに溶解し、クロロホルムに不溶分を濾去した後、過塩素酸／酢酸溶液の規定液を用いて滴定しカチオン性基量を定量した。この方法は実験例２、３に適用した。
【００３０】
実験例１
油性磁性流体「フェリコロイドHC50」［タイホー工業（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：０．０１μｍ）を得た。
ついで、超常磁性体４０部にシクロヘキシルメタクリレート９０部、トリメチルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０部およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３部を添加し、この系を混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散させてモノマー組成物を調整した。
一方、ポリビニルアルコール１０部、ラウリル酸ナトリルム０．０５部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１部を水１０００部に溶解してモノマー溶液を調整した。
得られた水性媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備攪拌した後、超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径が１μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸濁液（油滴分散体）を調整した。
次に、得られた懸濁液を容量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、この系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸濁重合）させることにより、本発明のウィルス濃縮用粒子を製造した。
得られた反応液に混床型イオン交換樹脂５ｇ添加した後、前記混床型イオン交換樹脂を濾過により除去した。この混床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した後乾燥した。得られた精製粒子を硫酸規定液を滴定液として滴定したところ、得られたポリマー粒子の総アミノ窒素量は１．２μmol／gであった。
【００３１】
実験例2
（１）実験例１においてシクロヘキシルメタクリレートの使用量を９５部とし、トリメチルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０部の代わりにメタクリル酸５部を使用した以外は実施例１と同様にして磁性ポリマー粒子を製造した。
（２）上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を５ｍM水酸化ナトリウム水溶液に分散し、８０℃、１２時間処理してカルボキシ変性磁性ポリマー粒子とした。（３）得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６）に添加し、ポリエチレンイミン（数平均分子量７万）の３０％水溶性１ｍｌおよびカルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０℃、２時間反応させ、本発明のウィルス濃縮用粒子を得た。
（４）得られた反応液に混床型イオン交換樹脂５ｇ添加した後、前記混床型イオン交換樹脂を濾過により除去した。この混床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した後乾燥した。
乾燥された磁性ポリマー粒子を１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、磁性体を濾別した後、０．０１mol／ｌの過塩素酸／酢酸溶液を用いてポリエチレンイミンを非水滴定したところ、上記（２）で得られた磁性ポリマー粒子に結合した総アミノ窒素量は４５．０μｍｏｌ／ｇであった。
【００３２】
実験例３
（１）実験例２（２）と同様にして得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液に添加し、ポリ−Ｌ−リジン（数平均分子量３万）の１％水溶液１ｍｌおよび水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０℃、２時間反応させ、ポリ−Ｌ−リジン固定磁性粒子からなる本発明のウィルス濃縮用粒子を得た。
（２）得られたポリ−Ｌ−リジン固定磁性粒子を実験例２（４）と同様にして精製した後、乾燥し、１０ｍｌジメチルスルホキシドに溶解し、磁性体を濾別した後、０．０１mol／ｌの過塩素酸／酢酸溶液を用いてポリ−Ｌ−リジンを非水滴定したところ、上記（２）で得られた磁性ポリマー粒子に結合した総アミノ窒素量は２２．０μｍｏｌ／ｇであった。
【表１】
【００３３】
実施例１
（１）実験例１〜３で得られたウィルス濃縮用粒子の水分散体を精製後、生理食塩水で固形分濃度５％に調整した。
（２）ＨＢＶを１０3コピー／ml含有するヒト血漿１ｍＬに上記（１）で調整した粒子懸濁液（５重量％）100μＬ、抗ＨＢｓ抗体（１mg/ml）10μlを加え、室温で１５または３０分間回転撹拌を行った。
（３）反応終了後、磁気分離スタンドにセットし、粒子と上清を分離し、上清を捨て、粒子を得た。上記作業にて得た粒子に１Ｍチオシアン酸ナトリウム水溶液50μL添加し、５分間撹拌後、磁気分離スタンドにて粒子と上清を分離し、上清（分離濃縮分画）を得た。最終容量は約50μＬであった。
分離濃縮分画を、通常の方法を用いて核酸抽出を行い、ABI PRISM TM7700 Sequence Detection System(Perkin Elmer Applied Biosystems 社製）を用い、ＤＮＡ量をTaqMan PCR法で定量した。ＤＮＡの定量は、４０回の増幅過程において、蛍光強度が一定の基準値（Threshhold:Th)を越えたサイクル数（Ｔｈサイクル）を、ウィルス濃度既知の検体の希釈系列を用いて同時に測定して作成したＤＮＡ量Thサイクルの検量線に外挿して求めた（実験Ｎｏ．１〜３）。
結果を表２に示す。
実施例２
（１）ＨＢＶを１０3コピー／ml含有するヒト血漿１ｍＬに実施例１の（１）で調整した粒子懸濁液（５重量％）100μＬ、抗ＨＢｓ抗体（１mg/ml）10μl、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ）水溶液（10%、分子量10,000）100μlを加え、室温で１５または３０分間回転撹拌を行った。以後実施例１の（４）と同様の操作を行った（実験Ｎｏ．４〜６）。結果を表２に示す。
比較例１
ＨＢＶを１０3コピー／ml含有するヒト血漿１ｍＬに実施例１の（１）で調整した粒子懸濁液（５重量％）100μＬを加え、室温で１５または３０分間回転撹拌を行った。以後実施例１の（３）と同様の操作を行った（実験Ｎｏ．７〜９）。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【発明の効果】
本発明のウイルス濃縮方法を用いることにより、遠心分離や磁気を作用させる簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に濃縮処理することができ、しかも得られた濃縮ウイルスを含む試料は核酸増幅の処理に悪影響を及ぼさない。このウイルス濃縮方法を利用するウイルス濃縮用試薬は、極く微量のウイルスを含む検体からウイルスを効率良く短時間で濃縮することができ、またウイルス検出方法はより高精度でウイルスを検出することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中のウイルスを濃縮するためのウイルス濃縮方法、ウイルス検査方法およびウイルス濃縮用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウイルスはヒトや動植物のさまざまな病気の原因の一つであり、その検査・診断のためには原因ウイルスの確認が非常に重要である。従来のウイルス検査・診断法としては、ウイルス抗原あるいは抗ウイルス抗体の免疫学的測定が一般的である。しかしながら、ウイルス感染から数週間〜数ヶ月は、ウイルス量あるいは抗ウイルス抗体量が少ないため、これらの免疫学的測定法では検出できない場合がある。この検出不可能な期間はウインドウ・ピリオド（空白期間）と呼ばれており、このような患者が献血を行った場合、その献血液は十分な感染性を持つことが多く、不特定多数の輸血患者・血液製剤利用患者に危険をおよぼす可能性がある。したがって、ウインドウ・ピリオドをできる限り短縮するため、免疫学的測定限界下のウイルスを高感度に検出できる技術の開発が急務とされている。
また、種々の抗ウイルス剤が臨床応用され始めたことによりその治療効果の確認のため極低濃度のウイルスを検出する技術も必要とされている。また、細胞培養等によって生産されるバイオ医薬品の安全性確保のため、ウイルスを高感度に検出することが重要となってきている。
【０００３】
近年、ポリメラーゼチェインリアクション法（以下ＰＣＲ法）に代表される、核酸増幅技術により、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてきた。しかしながら、ＰＣＲ法などによっても極微量のウイルス検出は特殊な施設と高度な技術が必要とされ、一般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難である。そこで、これらの問題解決のため、検体中のウイルスを濃縮する手法が用いられている。
【０００４】
従来のウイルス濃縮法の代表例としては超遠心法が挙げられるが、高価な機器と長時間を要し、かつ同時に多数の検体を処理することは困難であり簡便な方法とは言い難い。また、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）がヘパリンと結合する性質から、ヘパリンセファロース担体によるクロマトグラフィー法も報告されているが、これも同時に多数の検体を処理することは困難である。その他、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコール、ポリアニオンと２価イオンの組み合わせ、例えば酸性基を有する粒状物質（特公平６−２２６２７号公報）や粒子と２価金属を用いる方法（特開平６−２１７７６７号公報）、カチオン性基を有する水溶性高分子物質を加えウィルス除去する方法（特開平４−３４２５３６号公報）等によりウイルスを沈殿させる方法があるが、混合する試薬や分離されるウィルスに混入する多量の蛋白などにＰＣＲ阻害がある等の問題からウイルスの沈殿分離後の試料精製が必要であるという難点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のウイルス濃縮法の問題点を解決し、簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、自動化への対応も容易で、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさないウイルス濃縮方法、ウイルス濃縮用試薬およびウイルス検出方法を提供することにある。
【０００６】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは研究の結果、上記課題を解決する手段として、次の濃縮方法および濃縮用試薬を開発するに到った。
すなわち本発明は、（Ａ）標的ウイルスの表面抗原に対する抗体（以下、「特定抗ウイルス抗体」と称することがある）の存在下、ウイルスを含有する可能性のある試料と粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含む）を有する粒子（以下、「ウィルス濃縮用粒子」と称することがある）とを接触させ、ウィルスを前記粒子に付着させる工程、
（Ｂ）ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程
を含むことを特徴とするウイルス濃縮方法、
、（Ａ）標的ウイルスの表面抗原に対する抗体（以下、「特定抗ウイルス抗体」と称することがある）の存在下、ウイルスを含有する可能性のある試料と粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含む）を有する粒子（以下、「ウィルス濃縮用粒子」と称することがある）とを接触させ、ウィルスを前記粒子に付着させる工程、
（Ｂ）ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程
（Ｃ）濃縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する工程
を含むことを特徴とするウイルス検出方法
ならびに粒子表面にカチオン性基を有する粒子と標的ウイルスの表面抗原に対する抗体からなることを特徴とするウイルス濃縮用試薬を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
〈ウイルス濃縮用粒子〉
本発明において、ウイルス濃縮用粒子とは、血液や体液等の検体中のウイルスを吸着した後、分離または濃縮する粒子であり、当該粒子により分離または濃縮されたウイルスは核酸抽出・検査・診断、特に核酸増幅を伴う検査・診断に用いられる。本発明で用いるウイルス濃縮用粒子は粒子表面にカチオン性基（塩の状態を含む）を有し、粒径が０．５〜300μｍである。
【０００８】
本発明のウイルス濃縮用粒子は、水不溶性の材料であれば特に限定されず、そのような材料からなる粒子と該粒子の表面に存在するカチオン性基とから構成されている。
本発明のウイルス濃縮用粒子におけるカチオン性基は、アミノ基、アンモニウム基、イミノ基、アミジノ基、イミジノ基、ヒドラジノ基；さらにピリジル基等の窒素原子を含む環状基等を挙げることができる。カチオン性基は、アミノ基等のプロトンと結合してカチオンを形成し得る基および該基が酸と反応して塩を生成し、塩のカチオン部を形成している基を包含する。
カチオン性基は、水や緩衝液、血液、体液中に溶出するとＰＣＲ法などの核酸増幅法を阻害することがあるため、粒子に化学的に結合されている必要がある。その存在量は、粒子１ｇ当り平均で１×１０-10当量以上であり、代表的には１×１０-10〜１×１０-2当量であり、好ましくは１×１０-9〜１×１０-3当量であり、より好ましくは１×１０-8〜１×１０-3当量である。カチオン性基の存在量が粒子１ｇ当り１×１０-10当量より少ないとウイルス濃縮能力が不十分である。限定するものではないが、通常、粒径１ｇ当り１×１０-2当量より多くのカチオン性基を導入することは困難なことが多い。
【０００９】
このようなカチオン性基を有する粒子は、例えば（１）カチオン性モノマーを含むモノマー成分を重合する方法、（２）カチオン性基を有する重合開始剤を使用してモノマーを重合する方法、（３）カチオン性基を有する化合物を粒子に結合させる方法などにより製造することができる。
（１）カチオン性モノマーを含むモノマー成分を重合する方法
この方法において、使用することのできるカチオン性モノマーとしては、
２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、３−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート等のアミノアルキル基含有（メタ）アクリル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩；
２−（ジメチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、２−（ジエチルアミノエトキシ）エチル（メタ）アクリレート、３−（ジメチルアミノエトキシ）プロピル（メタ）アクリレート等のアミノアルコキシアルキル基含有（メタ）アクリル酸エステル類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩；
Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）（メタ）アクリルアミド等のＮ−アミノアルキル基含有（メタ）アクリルアミド類及びこれらの塩化メチレン、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等による４級塩等が挙げられる。なかでも、２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−（２−ジメチルアミノエチル）（メタ）アクリルアミド、及びこれらの塩化メチレンによる４級塩が好ましい。
これらは、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１０】
カチオン性モノマーと共重合するモノマーとしては、下記に示すような架橋性モノマーならびに非架橋かつ非イオン性モノマーを挙げることができる。
架橋性モノマーとしては、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１,４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１,６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、２，２'−ビス〔４−（メタ）アクリロイルオキシプロピオキシフェニル〕プロパン、２，２'−ビス〔４−（メタ）アクリロイルオキシジエトキジフェニル〕プロパン、グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールブロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等のジビニル系モノマー、トリビニル系モノマー及びテトラビニル系モノマーが挙げられる。なかでも、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレートおよびトリメチロールプロパントリメタクリレートが好ましい。
これらは１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１１】
共重合可能な非架橋性かつ非イオン性モノマーは、カチオン性モノマーあるいは架橋性モノマーのいずれかと共重合可能であって、非架橋性かつ非イオン性のモノマーである。
このようなモノマーとして、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の芳香族ビニル単量体；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等のアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステル；ブタジエン、イソプレン等のジオレフィン；酢酸ビニル等のカルボン酸ビニルエステル；塩化ビニル、塩化ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン等を挙げることができる。なかでも、スチレン、α−メチルスチレン、アクリロニトリル、メチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートが好ましい。
これらのモノマーは、１種単独であるいは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００１２】
上記カチオン性モノマーを含む重合成分は水系分散媒中で重合開始剤の存在下、乳化重合、懸濁重合などにより重合される。
重合開始剤としては、過硫酸塩類、あるいは過酸化水素−塩化第一鉄、クメンヒドロペルオキシド−アスコルビン酸ナトリウム等のレドックス系の水溶性重合開始剤、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、アゾビスイソブチロニトリルなどの油溶性重合開始剤が例示される。
また、必要に応じて界面活性剤、分散安定剤などを使用することもできる。
【００１３】
（２）カチオン性基を有するラジカル重合開始剤を使用する方法
このラジカル重合開始剤は、これを用いたラジカル重合により得られたポリマーがその末端に該ラジカル重合開始剤に由来するカチオン性基を有するようになるものである。
好ましいカチオン性基を有するラジカル重合開始剤としては、アミジノ基、イミジノ基あるいはピリジウム基を有するアゾビス型の開始剤が挙げられる。また、１０時間半減期温度が４０〜９５℃の範囲にあるものが温和な条件下で重合を行うことができるので好ましい。
カチオン性基を有するラジカル重合開始剤の好ましい具体例として、下記のものを挙げることができる。
【００１４】
２,２'−アゾビス（２−メチル−Ｎ−フェニルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５４５として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（４−クロロフェニル）−２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５４６として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５４８として販売）
２,２'−アゾビス〔２−メチル−Ｎ−（フェニルメチル）−プロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５５２として販売）
２,２'−アゾビス〔２−メチル−Ｎ−（２−プロペニル）プロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５５３として販売）
２,２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名Ｖ−５０として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−５５８として販売）
２,２'−アゾビス〔Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ハイドレート（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５７として販売）
【００１５】
２,２'−アゾビス〔２−メチル−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０４１として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０４４として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−１，３−ジアゼピン−２−イル）プロパン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５４として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）プロパン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５８として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（５−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）プロパン〕ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０５９として販売）
２,２'−アゾビス{２−〔１−（２−ヒドロキシエチル）−２−イミダゾリン−２−イル〕プロパン}ジヒドロクロライド（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０６０として販売）
２,２'−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）（和光純薬工業（株）から商品名ＶＡ−０６１として販売）
なかでも、２,２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジヒドロクロライド（Ｖ−５０）、２,２'−アゾビス〔Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン〕ハイドレート（ＶＡ−０５７）、２,２'−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン）ジヒドロクロライド（ＶＡ−０４４）の使用が好ましい。
カチオン性基を有するラジカル重合開始剤の使用量は、重合に使用するモノマー総合計量１００重量部当たり、０．１〜１０重量部用いることが好ましく、より好ましくは０．５〜５重量部である。使用量が０．１重量部未満と過少では、得られる粒子のカチオン性が低下し、１０重量部を越えて過剰では重合が不安定となり、好ましくない。
【００１６】
（３）カチオン性基を有する化合物を粒子に結合させる方法
粒子表面にカルボキシル基、ハイドロキシル基、エポキシ基、アミノ基、アミド基などの官能基を有するモノマーを共重合やシード重合し、それらの官能基を結合部として反応させることにより、カチオン性基を有する化合物を粒子表面に導入することができる。
ここで、官能基を有するモノマーをアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどを挙げることができる。
カチオン性基を有する化合物としては、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリアミン化合物、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンなどのポリアミノ酸類、前述のカチオン性基を有するモノマーを共重合したポリマーなどを挙げることができる。
【００１７】
本発明で使用できるウィルス濃縮用粒子は、その粒子の内部または表面に磁性体を含有することもできる。
この磁性体は該粒子の内部のみに含有され、表面に露出していないことが好ましい。本発明においては、ウイルス濃縮用粒子に磁性体を含有させることにより、該粒子の磁気を作用させて収集することが可能となり、遠心分離等による操作が不要で検査時間を短縮させることが可能となるほか、検査・診断の自動化への対応も容易となる。このような磁性体は、例えば四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属またはこれら金属の合金などを用いることができる。
【００１８】
磁性体の含有量は、ウイルス濃縮用粒子全体に対し10重量％以上、特に20〜100重量％であることが好ましい。この量が少なすぎると、該ウイルス濃縮用粒子に、良好な磁気分離性が得られず、その結果、後述するウイルスの分離・濃縮方法において、血液または体液等の検体からウイルス濃縮用粒子を分離するために相当に長い時間を要するので、高い時間的効率が得られないことがあり、好ましくない。
【００１９】
磁性体をウィルス濃縮用粒子に含有させるには、
（ａ）カチオン性モノマーを含む重合成分に磁性体を分散して重合を行う。重合方法としては、通常の乳化重合、懸濁重合、分散重合などの方法が挙げられる。
（ｂ）カチオン性モノマーを含む重合成分を重合して重合体粒子を合成後、該粒子表面に、磁性体層を形成する。
（ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）で得られた粒子表面に、さらにカチオン性モノマーを含む重合成分とする重合体層を形成する
などの方法をとることができる。
このようにして得られるウィルス濃縮粒子は、その分散媒に乳化剤、分散剤、未反応モノマー、水溶性ポリマー、重合開始剤の分解物などを含んでいる場合がある。
これらの物質は、核酸増幅検査段階において反応阻害物となる可能性が高いため、例えばAdv.Colloid Interface Sci.,81,77〜165(1999)などに示される方法によりウィルス濃縮用粒子の分散媒から除去することが好ましい。
後述するカチオン性基の定量に滴定を採用する場合には、最終的に混床型イオン交換樹脂などを用いてウィルス濃縮用粒子を精製することが好ましい。
また、本発明のウイルス濃縮用粒子は血漿や血清等の検体中のウイルスを高い効率で濃縮するため、通常、カラムクロマト法ではなくバッチ法にて使用される。したがって、粒子の粒径は通常0.08μm〜300μm、好ましくは0.1μm〜100μmである。粒径がこの範囲内であれば粒径が均一でなくても本発明の目的のために使用することが可能である。粒径が0.08μm未満の場合は、血液または体液からウイルス濃縮用粒子を分離する際の遠心分離の回転数や回転時間の増加を招き、装置が大型になったり、高い時間的効率が得られず好ましくない。また、粒径が300μmを越える場合は、ウイルスを捕獲する効率が低下し、ウイルス濃縮が十分に行えないことがあるため好ましくない。また、本発明のウイルス濃縮用粒子の粒子形状は球状である必要はなく、異形粒子であってもかまわない。なお球状でない粒子の粒径としては、それぞれの粒子の最長径と最短径との平均値をとるものとする。
【００２０】
（特定抗ウイルス抗体）
本発明に用いられる特定抗ウイルス抗体は、標的ウィルスの表面タンパクや糖脂質などウイルス表面抗原に対する抗体であり、さらには変異ウイルス株全てに存在する共通抗原に対する抗体であることが好ましいが、各変異ウイルス株特異的な抗原に対する抗体の混合物を用いることも可能である。また、複数のウイルスを同時に濃縮する場合は、各ウイルスに対する抗ウイルス抗体を混合して用いることができる。
標的ウィルスとしては、例えばヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、Ｃ型肝炎ウイルス等を挙げることができる。
【００２１】
（ウィルス濃縮用試薬）
本発明において、ウィルス濃縮用試薬とは、前記ウィルス濃縮用粒子と特定抗ウイルス抗体からなる。ウイルス濃縮用粒子は単独で用いても、ウイルス濃縮作用を持つが、特定抗ウイルス抗体と併用することにより、タンパク質濃度や脂質濃度が極端に高い場合などのウイルス濃縮が不安定な条件下でも、安定したウイルス濃縮作用を保つことができる。
さらに、デキストラン、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子を併用すると、ウイルス濃縮用粒子へのウイルス吸着効率を向上することができる。これらの水溶性高分子としては、デキストラン、グリコーゲン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの中性水溶性高分子が好ましく用いることができる。これらの水溶性高分子の分子量としては、500〜10,000,000のものが好ましく、2,000〜5,000,000が特に好ましい。
ウイルス濃縮用粒子、特定抗ウイルス抗体および/または水溶性高分子は、それぞれ別々に試料液に添加されても、あらかじめ混合液とした上で試料液に添加してもかまわない。あらかじめ混合液とした場合、その状態で保存することも可能である。
【００２２】
〈ウイルス濃縮方法〉
次に、本発明のウイルス濃縮用試薬によるウイルス濃縮方法について具体的に説明する。
本発明のウイルス濃縮用試薬は各種ウイルスに対して特定抗ウイルス抗体を使用することにより優れた濃縮作用を発揮する、例えばヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノウイルス、フラビウイルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘルペスウイルス、（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、EBウイルス等）、ポックスウイルス、パルボウイルス（アデノ関連ウイルス等）、オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス等）、レトロウイルス（後天性免疫不全症候群ウイルス等）、Ｃ型肝炎ウイルス等のウイルスの濃縮が可能である。
【００２３】
本発明のウイルス濃縮用試薬によるウイルス濃縮の対象となる検体としては、血漿、血清、細胞破砕液、尿、唾液等の各種体液、培養細胞上清液等を挙げることができる。このような検体はそのまま試料として使用されてもよいし、何らかの目的で希釈された状態で試料として使用されてもよい。
【００２４】
本発明のウイルス濃縮用粒子は、試料１ｍｌあたりの通常0.1〜100 mg、好ましくは0.5〜50 mgとなる割合で使用される。また、特定抗ウイルス抗体は試料１ｍｌあたり通常0.1〜100μg、好ましくは0.2〜80μgの割合で使用される。
ウイルス濃縮用粒子および特定抗ウイルス抗体の添加量が少なすぎると、ウイルス濃縮用粒子に付着できるウイルスの数が限られるため濃縮効率が悪化する。また、添加量が多すぎると、付着したウイルスを後段階で脱離させるのに多量の脱離液が必要となり濃縮効率が低下する。
ウイルス濃縮効率を向上させる目的で水溶性高分子を添加する場合、水溶性高分子の添加量は試料１ｍあたり通常、0.1〜100mg、好ましくは0.5〜50mgである。
【００２５】
試料中のウイルスを吸着したウイルス濃縮用粒子は、遠心分離あるいは自然沈降により、またウィルス濃縮用粒子が磁性体を含有する場合には磁気分離により試料から分離される。本発明で使用されるウイルス濃縮用粒子は通常、0.08〜300μmの粒径範囲を持つので、遠心機でも十分遠心分離が可能である。
分離されたウイルス濃縮用粒子は必要に応じて、低濃度の緩衝液で洗浄した後、ウイルスの粒子からの分離、核酸の抽出工程に移る。なお、核酸抽出は、ウイルスが粒子に付着したままでも行うことができる。例えば、分離されたウイルス濃縮用粒子に少量の緩衝液を加え、加熱することで直接、ウイルスの核酸を抽出することも可能であるし、市販されている核酸抽出試薬を直接添加してウイルスの核酸を抽出することも可能である。
【００２６】
ウイルスを粒子から分離する方法としては、塩溶液を作用させてウイルス濃縮用粒子とウイルスとを解離させる方法がある。塩溶液としては高濃度の臭化カリウム、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、1mMリンタングステン酸等を用いることができる。
【００２７】
〈ウイルス検出方法〉
このウイルス検出方法は、上記のようにしてウイルスが付着した本発明の粒子を試料から分離、収集することによりウイルスを濃縮する段階ののち、こうして濃縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する段階を有している。
【００２８】
ウイルスの核酸増幅検査（ＮＡＴ; nucleic acid amplification test）の方法は特に限定されず、例えば、ロシュ社のＰＣＲ(Polymerization chain reaction)法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ(Transcription Mediated amplification-hybridization protection assay)法、アボット社のＬＣＲ(Ligase chain reaction)法、栄研化学社のＬＡＭＰ法（Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA）、宝酒造社のＩＣＡＮ法（Isothermal and chimeric pimer-initiated amplification of nucleic aced）等を利用することができる。
このウイルス濃縮方法を利用したウイルス検出法では、核酸増幅検査に供される検体中のウイルスが既に濃縮されているので、元の検体または試料に含まれているウイルスが極く微量であっても効率的にウイルスの検出を行うことができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例において得られるウィルス濃縮用粒子の粒径およびカチオン性基の存在量について下記の方法で定量した。
粒径の測定：光学顕微鏡、走査型電子顕微鏡または透過型電子顕微鏡により写真撮影を行い２００個の粒子の粒径を測定し、その平均値を求めた。
カチオン性基の存在量：
▲１▼伝導度滴定法 ウィルス濃縮用粒子を遠心分離あるいは磁気分離により純水で２回洗浄し、粒子１gあたり混床型イオン交換樹脂５ｇを添加し、混合後１時間攪拌した後、混床型イオン交換樹脂を濾去した。この混床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した。得られた精製粒子を硫酸規定液を滴定液として滴定した。この方法は実験例１に適用した。
▲２▼非水滴定法 上記▲１▼と同様にウィルス濃縮用粒子を精製後、乾燥しクロロホルムに溶解し、クロロホルムに不溶分を濾去した後、過塩素酸／酢酸溶液の規定液を用いて滴定しカチオン性基量を定量した。この方法は実験例２、３に適用した。
【００３０】
実験例１
油性磁性流体「フェリコロイドHC50」［タイホー工業（株）製］にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：０．０１μｍ）を得た。
ついで、超常磁性体４０部にシクロヘキシルメタクリレート９０部、トリメチルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０部およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３部を添加し、この系を混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散させてモノマー組成物を調整した。
一方、ポリビニルアルコール１０部、ラウリル酸ナトリルム０．０５部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１部を水１０００部に溶解してモノマー溶液を調整した。
得られた水性媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加し、ホモジナイザーで予備攪拌した後、超音波分散機で分散処理することにより平均粒子径が１μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸濁液（油滴分散体）を調整した。
次に、得られた懸濁液を容量２リットルの攪拌機付き三つ口フラスコに仕込み、この系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら５時間にわたり油滴中のモノマーを重合（懸濁重合）させることにより、本発明のウィルス濃縮用粒子を製造した。
得られた反応液に混床型イオン交換樹脂５ｇ添加した後、前記混床型イオン交換樹脂を濾過により除去した。この混床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した後乾燥した。得られた精製粒子を硫酸規定液を滴定液として滴定したところ、得られたポリマー粒子の総アミノ窒素量は１．２μmol／gであった。
【００３１】
実験例2
（１）実験例１においてシクロヘキシルメタクリレートの使用量を９５部とし、トリメチルアミノエチルメタクリレートの塩化物１０部の代わりにメタクリル酸５部を使用した以外は実施例１と同様にして磁性ポリマー粒子を製造した。
（２）上記（１）で得られた磁性ポリマー粒子を５ｍM水酸化ナトリウム水溶液に分散し、８０℃、１２時間処理してカルボキシ変性磁性ポリマー粒子とした。（３）得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ６）に添加し、ポリエチレンイミン（数平均分子量７万）の３０％水溶性１ｍｌおよびカルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０℃、２時間反応させ、本発明のウィルス濃縮用粒子を得た。
（４）得られた反応液に混床型イオン交換樹脂５ｇ添加した後、前記混床型イオン交換樹脂を濾過により除去した。この混床型イオン交換樹脂による精製を２回繰り返した後乾燥した。
乾燥された磁性ポリマー粒子を１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、磁性体を濾別した後、０．０１mol／ｌの過塩素酸／酢酸溶液を用いてポリエチレンイミンを非水滴定したところ、上記（２）で得られた磁性ポリマー粒子に結合した総アミノ窒素量は４５．０μｍｏｌ／ｇであった。
【００３２】
実験例３
（１）実験例２（２）と同様にして得られたカルボキシ変性磁性ポリマー粒子１ｇ（乾燥重量）を２０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝溶液に添加し、ポリ−Ｌ−リジン（数平均分子量３万）の１％水溶液１ｍｌおよび水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ・塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド）０．２ｇを添加し、２０℃、２時間反応させ、ポリ−Ｌ−リジン固定磁性粒子からなる本発明のウィルス濃縮用粒子を得た。
（２）得られたポリ−Ｌ−リジン固定磁性粒子を実験例２（４）と同様にして精製した後、乾燥し、１０ｍｌジメチルスルホキシドに溶解し、磁性体を濾別した後、０．０１mol／ｌの過塩素酸／酢酸溶液を用いてポリ−Ｌ−リジンを非水滴定したところ、上記（２）で得られた磁性ポリマー粒子に結合した総アミノ窒素量は２２．０μｍｏｌ／ｇであった。
【表１】
実施例１
（１）実験例１〜３で得られたウィルス濃縮用粒子の水分散体を精製後、生理食塩水で固形分濃度５％に調整した。
（２）ＨＢＶを１０3コピー／ml含有するヒト血漿１ｍＬに上記（１）で調整した粒子懸濁液（５重量％）100μＬ、抗ＨＢｓ抗体（１mg/ml）10μlを加え、室温で１５または３０分間回転撹拌を行った。
（３）反応終了後、磁気分離スタンドにセットし、粒子と上清を分離し、上清を捨て、粒子を得た。上記作業にて得た粒子に１Ｍチオシアン酸ナトリウム水溶液50μL添加し、５分間撹拌後、磁気分離スタンドにて粒子と上清を分離し、上清（分離濃縮分画）を得た。最終容量は約50μＬであった。
分離濃縮分画を、通常の方法を用いて核酸抽出を行い、ABI PRISM TM7700 Sequence Detection System(Perkin Elmer Applied Biosystems 社製）を用い、ＤＮＡ量をTaqMan PCR法で定量した。ＤＮＡの定量は、４０回の増幅過程において、蛍光強度が一定の基準値（Threshhold:Th)を越えたサイクル数（Ｔｈサイクル）を、ウィルス濃度既知の検体の希釈系列を用いて同時に測定して作成したＤＮＡ量Thサイクルの検量線に外挿して求めた（実験Ｎｏ．１〜３）。
結果を表２に示す。
実施例２
（１）ＨＢＶを１０3コピー／ml含有するヒト血漿１ｍＬに実施例１の（１）で調整した粒子懸濁液（５重量％）100μＬ、抗ＨＢｓ抗体（１mg/ml）10μl、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ）水溶液（10%、分子量10,000）100μlを加え、室温で１５または３０分間回転撹拌を行った。以後実施例１の（４）と同様の操作を行った（実験Ｎｏ．４〜６）。結果を表２に示す。
比較例１
ＨＢＶを１０3コピー／ml含有するヒト血漿１ｍＬに実施例１の（１）で調整した粒子懸濁液（５重量％）100μＬを加え、室温で１５または３０分間回転撹拌を行った。以後実施例１の（３）と同様の操作を行った（実験Ｎｏ．７〜９）。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【発明の効果】
本発明のウイルス濃縮方法を用いることにより、遠心分離や磁気を作用させる簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に濃縮処理することができ、しかも得られた濃縮ウイルスを含む試料は核酸増幅の処理に悪影響を及ぼさない。このウイルス濃縮方法を利用するウイルス濃縮用試薬は、極く微量のウイルスを含む検体からウイルスを効率良く短時間で濃縮することができ、またウイルス検出方法はより高精度でウイルスを検出することができる。
Claims (3)
- （Ａ）ウイルスを含有する可能性のある試料に、粒子表面にカチオン性基を有し、粒径が０．５〜３００μｍである粒子と、標的ウイルスの表面抗原に対する抗体とを添加し、ウイルスを前記粒子に付着させる工程、および
（Ｂ）ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程、を含むことを特徴とするウイルス濃縮方法。 - （Ａ）ウイルスを含有する可能性のある試料に、粒子表面にカチオン性基を有する粒子と、標的ウイルスの表面抗原に対する抗体とを添加し、ウイルスを前記粒子に付着させる工程、
（Ｂ）ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程、および
（Ｃ）濃縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する工程、を含むことを特徴とするウイルス検出方法。 - 粒子表面にカチオン性基を有する粒子と、標的ウイルスの表面抗原に対する抗体を含むことを特徴とするウイルス濃縮用試薬。
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