WO2023106207A1 - 微生物の濃縮方法及び濃縮容器 - Google Patents

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WO2023106207A1
WO2023106207A1 PCT/JP2022/044415 JP2022044415W WO2023106207A1 WO 2023106207 A1 WO2023106207 A1 WO 2023106207A1 JP 2022044415 W JP2022044415 W JP 2022044415W WO 2023106207 A1 WO2023106207 A1 WO 2023106207A1
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porous cellulose
fine particles
cellulose fine
microorganisms
particles
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PCT/JP2022/044415
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正和 福島
光太郎 小田
和彦 荒川
弘大 原納
文映 佐野
雄一 原
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旭化成株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties

Definitions

  • the present invention relates to a method for concentrating microorganisms such as bacteria and viruses in a sample liquid containing microorganisms in a solvent using porous cellulose microparticles having a large number of pores therein, and to the concentration method.
  • infectious disease diagnosis, environmental inspection, and food microbiological inspection it is required to detect, identify, and/or count pathogens or harmful microorganisms that impair quality from samples by a rapid and simple method.
  • doctors and nurses identify pathogens or viruses by POCT (quick and easy test) in order to make appropriate clinical judgments at the patient's side at an early stage.
  • environmental indicator bacteria such as common bacteria and coliforms
  • harmful microorganisms such as food poisoning bacteria and viruses are used for employee or environmental hygiene management and quality control of raw materials, intermediate products, and final products. Targeted testing is underway. All of them require special equipment and simple operation methods that do not require microbiological knowledge, especially for small businesses and on-site operations.
  • the method for testing the microorganism includes a culture method in which the microorganism is identified based on its biochemical properties through isolation culture, and a detection method by amplifying and detecting the gene specific to the microorganism by PCR method or LAMP method. and an immunization method that utilizes a specific reaction between an antigen marker specific to the microorganism and an antibody for detection.
  • the amount of sample used for any test method is as small as about 0.01 to 1 mL
  • patient specimens e.g., urine and body fluids
  • food samples e.g., liquid samples, bacteria or virus extracts by stomacher
  • environmental samples For example, only a small part of the content of the detection substance (bacteria or virus itself, or its surface or internal components) contained in about 0.01 to 1 L that can be collected from water
  • detection substance bacteria or virus itself, or its surface or internal components contained in about 0.01 to 1 L that can be collected from water
  • enrichment culture is performed for a long time (for example, 24 hours) in order to avoid missing samples, which impairs the simplicity and rapidity of testing.
  • concentration by adsorption, separation and recovery of microorganisms by an adsorption carrier is performed.
  • Patent Document 1 E. coli is adsorbed by shaking inorganic microparticles (amorphous metal silicate) and a sample for 1 to 20 minutes.
  • the particles described in Patent Document 1 are not crosslinked cellulose particles, and require shaking for 10 minutes or more to obtain an adsorption rate of 50% or more. )
  • 10 mg of inorganic microparticles are used for 10 mL of the E. coli sample.
  • Patent Document 1 does not describe the permissible water content per unit mass of dry particles, the porosity, and the like.
  • Patent Document 2 describes a method of contacting aminosilica with a specimen containing a mixture of pathogenic bacteria and cells for bacterial disease testing of mastitis, and recovering only the pathogenic bacteria.
  • the particles described in Patent Document 2 are not crosslinked cellulose particles, and it takes 1 hour to stir the amino silica and the sample.
  • the objective is not to concentrate pathogenic bacteria but to separate them from cells, and there is no description of permissible water content per certain mass of dry particles, porosity, and the like.
  • Patent Document 3 describes calcium phosphate-based porous granules having two types of continuous pore structures: continuous fine pores with an average pore size of 20 to 500 nm and continuous small pores with an average pore size of 1 to 50 ⁇ m, which adsorb viruses and cells. Separating agents are described.
  • the particles described in Patent Document 3 are not crosslinked cellulose particles, and there is no description of the allowable water content per unit mass of dry particles, porosity, and the like.
  • Patent Document 4 discloses that a sample that may contain a virus contains particles having a cationic group on the particle surface and a particle size of 0.5 to 300 ⁇ m, and an antibody against the surface antigen of the target virus. is added to allow the virus to adhere to the particles, and the virus-attached particles are separated and collected from a sample. It is described that such a virus concentration method can easily process a large number of specimens at the same time with a simple means, can be easily adapted to automation, and can provide virus concentration that does not adversely affect the nucleic acid amplification test. .
  • the described particles are non-porous synthetic polymers obtained by polymerizing various monomers, and regarding application to the method of concentrating bacteria, let alone permissible water content per certain mass of dry particles, porosity, etc. There is no description.
  • Patent Document 5 describes a method of removing viruses from a virus-containing sample by contacting the virus-containing sample with an adsorbent having a structure in which polyethyleneimine is bound to a base carrier containing porous particles.
  • an adsorbent having a structure in which polyethyleneimine is bound to a base carrier containing porous particles.
  • cross-linked cellulose particles having specific ligands are mentioned as the base carrier, there is no description of application to bacterial concentration methods, let alone the permissible water content per certain mass of dry particles, porosity, etc.
  • Patent Document 6 describes that polycation-modified porous cellulose microparticles can be industrially used as microcarriers for cell culture of fungi, yeast, and animal and plant cells.
  • liquid removal process for removing the solvent or concentrating the microorganisms in the pores, much less the permissible water content per certain mass of dry particles, the porosity, and the like.
  • Patent Documents 1, 2, 3, and 4 describe adsorbents for cells or viruses, the materials thereof are non-porous synthetic polymers, porous amorphous metal silicates, and porous calcium phosphates. Since it is not a cellulose fine particle with a high porosity and a high permeability having characteristics such as an allowable water content per a certain mass of dry particles and a porosity described below, it is difficult to obtain a high-density body of microorganisms. be.
  • Patent Document 5 describes crosslinked cellulose particles to which polyethyleneimine is bound as an adsorbent, but such an adsorbent is bound to the specific polyethyleneimine as a ligand, and adsorbs and removes viruses.
  • Patent Documents 1, 2, 4, and 5 describe conditions for contacting an adsorbent with a microbial sample, it takes at least 10 minutes to sufficiently adsorb a 10 mL specimen sample to the adsorbent. It requires agitation and shaking, and cannot be said to be a simple operation method.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for concentrating microorganisms capable of quickly obtaining a high concentration of microorganisms by a simple means, and a concentration container for use in the concentration method. is to provide
  • Phosphate-buffered saline (-) (hereinafter also referred to as PBS (-).
  • the permissible water content C which is the mass of PBS(-) of the porous cellulose fine particles in a swollen state in which PBS(-) does not fall off under its own weight, is 1.9 or more
  • Dehydration amount (CE) obtained by subtracting the mass E of PBS(-) after centrifuging the porous cellulose fine particles in the swollen state at 1000 G for 1 minute from the permissible water content C, and dividing by E
  • a method of concentrating microorganisms in a sample liquid containing microorganisms in a solvent using porous cellulose fine particles having a large number of pores therein comprising the following steps: contacting the sample liquid with the porous cellulose fine particles to adsorb the microorganisms contained in the sample liquid to the surface of the porous cellulose fine particles; a draining step for concentrating the microorganisms on the surface and/or within the pores of the fine cellulose microparticles; , and the porous cellulose fine particles are the mass of PBS (-) of the porous cellulose fine particles in a swollen state in which 100 mg of dry particles are swollen with PBS (-) and the PBS (-) does not fall off under its own weight.
  • the allowable water content C is 1.9 g or more, and from the allowable water content C, the mass E of PBS(-) after centrifuging the porous cellulose fine particles in the swollen state at 1000 G for 1 minute is subtracted.
  • a concentration container for use in a method of concentrating microorganisms in a sample liquid containing microorganisms in a solvent using porous cellulose fine particles having a large number of pores therein
  • the concentration vessel is a tubular body having an inlet opening and an outlet opening; a filter provided on the outlet opening side; and porous cellulose fine particles filled in the space above the filter; , where The sample liquid supplied from the inlet opening side comes into contact with the porous cellulose fine particles, and the microorganisms contained in the sample liquid are adsorbed on the surface of the porous cellulose fine particles, while the solvent of the sample liquid is is removed from the outlet opening side to concentrate the microorganisms within the pores of the porous cellulose microparticles, and
  • the permissible water content of the porous cellulose microparticles is the mass of PBS(-) of the porous cellulose microparticles in a swollen state in which 100 mg of dry particles are swollen with PBS(-) and the PBS(
  • the concentration container according to any one of [20] The concentration container according to [19] above, wherein the cationic functional group is at least one selected from the group consisting of primary amino groups, secondary amino groups, and tertiary amino groups.
  • the cationic functional group is N,N-diethylaminoethyl (DEAE).
  • the concentration container according to any one of [14] to [21] wherein the cellulose constituting the porous cellulose fine particles is intermolecularly crosslinked.
  • the concentration container according to any one of [14] to [22], wherein the cellulose constituting the porous cellulose fine particles is made of cuprammonium regenerated cellulose.
  • a method for concentrating microorganisms in a sample liquid containing microorganisms in a solvent using porous cellulose microparticles having a large number of pores therein comprising the following steps: A cylindrical body having an inlet opening and an outlet opening; a filter provided on the side of the outlet opening; and porous cellulose fine particles filled in the space above the filter; a step of contacting the cellulose microparticles to allow the microorganisms contained in the sample liquid to adsorb to the surface of the porous cellulose microparticles; a draining step to concentrate the microorganisms on the surface and/or within the pores of , and the porous cellulose fine particles are the mass of PBS (-) of the porous cellulose fine particles in a swollen state in which 100 mg of dry particles are swollen with PBS (-) and the PBS
  • the allowable water content C is 1.9 g or more, and from the allowable water content C, the mass E of PBS(-) after centrifuging the porous cellulose fine particles in the swollen state at 1000 G for 1 minute is subtracted.
  • a method for concentrating microorganisms wherein the free water ratio ((CE)/E) obtained by dividing the amount of dehydration (CE) obtained by dividing by E is 2.9 or more.
  • microorganisms can be concentrated using specific porous cellulose microparticles having a high porosity and dehydration ratio, which are indicated by the permissible water content and the free water ratio. It is possible to obtain a high density of microorganisms with a high adsorption amount of microorganisms per hit, and to recover high concentration of microorganisms from the obtained high density of microorganisms. Therefore, the concentration method and the concentration container according to the present invention can be suitably used in microbiological tests and the like.
  • FIG. 1 is a photograph of porous cellulose microparticles (labeled as crosslinked cellulose) and another concentrated carrier.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram of "permissible water content” and “free water content” and an explanatory diagram of how to obtain them. It is a particle suspension of porous cellulose microparticles (indicated as particles of the present invention) and comparative particles Maruichi to Maruyo. Electron microscope of porous cellulose microparticles after adsorption of E. coli.
  • 1 is a schematic diagram of a concentration vessel for holding porous cellulose microparticles; FIG.
  • a first embodiment of the present invention is a method for concentrating microorganisms in a sample liquid containing microorganisms in a solvent using porous cellulose microparticles having a large number of pores therein, the method comprising the following steps: Process: contacting the sample liquid with the porous cellulose fine particles to adsorb the microorganisms contained in the sample liquid to the surface of the porous cellulose fine particles; a draining step for concentrating the microorganisms on the surface and/or within the pores of the fine cellulose microparticles; , and the porous cellulose fine particles are the mass of PBS (-) of the porous cellulose fine particles in a swollen state in which 100 mg of dry particles are swollen with PBS (-) and the PBS (-) does not fall off under its own weight.
  • the allowable water content C is 1.9 g or more, and from the allowable water content C, the mass E of PBS(-) after centrifuging the porous cellulose fine particles in the swollen state at 1000 G for 1 minute is subtracted.
  • FIG. 2 shows a conceptual diagram of the "permissible water content" and the "free water content ratio” and an explanatory diagram of how to obtain them.
  • the permissible water content is the mass of PBS (-) of the particles in a swollen state where 100 mg of dry particles are swollen with PBS (-) and the PBS (-) does not fall off due to their own weight. It is an absolute index indicating whether or not a material absorbs water. The larger this value is, the more voids are formed inside the particles due to swelling. Therefore, a high allowable water content means that the size of the voids during swelling is large and the porosity is high.
  • the higher the allowable water content, the better preferably 1.9 g or more, more preferably 2.1 g or more, still more preferably 2.4 g or more, most preferably 2.6 g or more. As shown in FIG.
  • the porous cellulose microparticles (indicated as crosslinked cellulose) used in the present embodiment have a large number of pores inside the microparticles when swollen and have a high porosity, compared to other concentration carriers. It turns out that it is a thing.
  • the ratio of free water is the mass of PBS(-) remaining in the particles (E: bound water content) and the PBS(- ) (CE: free water content) ratio ((CE)/E) and is a relative indicator of how much liquid the swollen particles dehydrate.
  • a larger value means that the particles have a larger amount of free water than the amount of bound water, that is, a large amount of relative dehydration. If the amount of dehydration is large, excess water can be removed, so that a high density of microorganisms (high number of adsorbed microorganisms per particle weight (microorganisms/mg)) can be obtained.
  • centrifugal separation is suitable for controlling the power to remove the contained water, and if the contained water is removed by a simple operation without using special equipment, a method of aerating and replacing air with a syringe or the like is used. preferred.
  • centrifugation at 1000 G for 1 minute corresponds to aeration of 1-2 mL of air.
  • the type of cellulose constituting the porous cellulose microparticles of the present embodiment is not particularly limited, and includes known celluloses such as cuprammonium regenerated cellulose, viscose regenerated cellulose, cotton, pulp, and polynosic, preferably cuprammonium. regenerated cellulose, viscose regenerated cellulose, and cuprammonium regenerated cellulose is more preferred. Cuprammonium regenerated cellulose has a low degree of crystallinity, so it is highly reactive when modified with various functional groups, and even porous particles can be uniformly modified to the inside of the particles. Excellent in sex.
  • the average particle diameter of the porous cellulose microparticles of the present embodiment is preferably 100 ⁇ m to 1000 ⁇ m, more preferably 100 ⁇ m to 500 ⁇ m, even more preferably 200 ⁇ m to 400 ⁇ m, still more preferably 200 ⁇ m to 280 ⁇ m. If the average particle diameter is less than 100 ⁇ m, it is necessary to reduce the opening of the filter on the inlet opening side and the outlet opening side of the concentration container for holding the porous cellulose fine particles, and when supplying the sample liquid containing microorganisms, Alternatively, the pressure loss increases when the solvent of the sample liquid is removed, resulting in lower operability and restrictions on the amount of liquid to be processed.
  • the average particle size in the present specification is the average particle size of 20 or more particles measured by swelling the porous particles with water or saline, removing excess water, and setting an appropriate magnification with an optical microscope. be.
  • the average pore size is preferably 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, more preferably 10 ⁇ m to 80 ⁇ m, still more preferably 10 ⁇ m to 50 ⁇ m.
  • the average pore diameter is less than 1 ⁇ m, free movement of the sample liquid containing microorganisms in the porous cellulose fine particles may not be realized.
  • viruses have a particle size of about 0.02 ⁇ m, and bacteria have a particle size of about 1 ⁇ m to 5 ⁇ m. In the case of viruses, the particle size is extremely small.
  • the average pore diameter of the porous cellulose fine particles is less than 1 ⁇ m, adsorption to the inside of the particles is significantly limited for any microorganism.
  • the average pore size is larger than 100 ⁇ m, a sufficient surface area for adsorption of microorganisms cannot be ensured, and thus microorganisms may not be efficiently concentrated.
  • the average pore size in this specification is obtained by removing excess water after swelling the porous particles with water or saline, setting the magnification to an appropriate magnification with an electron microscope, and measuring the distance between the membranes of 20 or more particles. It is the average pore size.
  • the diameter of each hole was defined as the shortest diameter when the hole was not perfectly spherical or circular.
  • the porous cellulose fine particles of the present embodiment preferably form a continuous pore structure that communicates with each other through the openings of the membrane separating the pores. If the structure communicates with each other, the microbes can be efficiently adsorbed to the inside of the porous cellulose fine particles, and the surface area for the adsorption of the microbes can be increased.
  • the dry surface area (specific surface area) of the porous cellulose fine particles of the present embodiment is preferably 0.3 m 2 /g or more and 4.4 m 2 /g or less, more preferably 0.6 m 2 /g or more. 0.3 m 2 /g or less, more preferably 0.8 m 2 /g or more and 1.7 m 2 /g or less. If the surface area is less than 0.3 m 2 /g, the surface area required for adsorption of microorganisms is small, and it may not be possible to efficiently concentrate microorganisms. On the other hand, when the dry surface area is 4.4 m 2 /g or more, the charge per unit area is low, which may lower the adherence rate of microorganisms.
  • the surface area in this specification is the surface area measured by the BET method.
  • the charge capacity of the porous cellulose fine particles of the present embodiment is preferably 0.5 mmol/g or more and 5.0 mmol/g or less, more preferably 0.5 mmol/g or more and 3.0 mmol/g or less, and still more preferably 0.6 mmol/g.
  • the charge capacity is within the above range, coupled with the fact that the surface area of the pores is within the specific range, the charge per unit surface area is increased, and the adherence rate of microorganisms can be improved. In addition, it is possible to collect microorganisms without being inhibited by electric charges when collecting microorganisms with an eluent.
  • the charge capacity in the present specification refers to a solution obtained by adsorbing chlorine on the amine in the porous particles using hydrochloric acid and then washing off the adsorbed chlorine with a sodium sulfate solution. It is the average charge capacity measured over the sample.
  • Cationic substituents constituting the porous cellulose fine particles of the present embodiment are not particularly limited, but are preferably selected from the group consisting of primary amino groups, secondary amino groups, and tertiary amino groups. It is at least one type, more preferably a tertiary amino group, still more preferably a diethylaminoethyl group.
  • the porous cellulose fine particles of the present embodiment are produced by forming a solution in which cellulose is dissolved into a desired shape, cooling the solution to a temperature below the solidification temperature of the solution, freezing the solution, and then extracting and removing the solvent or losing the dissolving ability.
  • the freezing temperature is preferably not set at 40°C or more lower than the freezing temperature of the solvent, etc., and is usually set in the range of 0 to 20°C lower than the freezing temperature.
  • the frozen cellulose solution or cellulose derivative solution is then subjected to extraction removal of the solvent that dissolves the cellulose or cellulose derivative, or reduction of its dissolving ability (hereinafter, these treatments are collectively referred to as "solvent removal etc.), which is a solidified porous cellulose material.
  • solvent removal etc. is a solidified porous cellulose material.
  • Conditions such as solvent removal are not particularly limited. Normally, it is sufficient to quickly put the frozen body into any coagulation bath or regeneration bath, but it is preferable and recommended to keep the coagulation bath or regeneration bath below the freezing temperature of the solution. However, in the case of a cellulose derivative, a cellulose regeneration step is necessary, and this regeneration is performed simultaneously with solvent removal or the like or sequentially (ie, after solvent removal or the like is performed).
  • Regeneration itself can be carried out by a conventional method.
  • the above production method it is not necessary to add foreign matter such as a porosifying material to the polymer solution during production, so that fine droplets of uniform diameter can be easily produced, and the particle size can be arbitrarily controlled. can be done.
  • the diameter and shape of the pores are basically determined by the size and shape of the crystals of the solvent, etc. formed when the solvent, etc. in the solution freezes and solidifies. Therefore, the shape and diameter of the pores can be adjusted by changing the freezing and solidification conditions such as the type and temperature of the polymer solution.
  • porous cellulose fine particles used in the concentration method of the present embodiment granulated cellulose particles can be used as they are, but they are preferably used after cross-linking.
  • the method of cross-linking is not limited, but for intermolecular cross-linking of the cellulose porous material, a cross-linking agent can be used as long as it has two or more functional groups capable of reacting and bonding with hydroxyl groups of cellulose. Examples include bifunctional organic substances. Examples include the X—R—Z form, which reacts relatively easily in the presence of alkaline reactants, where R represents an aliphatic residue containing carbon atoms, and X and Z are various halogens, epoxy etc., which are attached to carbons of aliphatic residues.
  • difunctional compounds suitable for the above reaction include epichlorohydrin, dichlorohydrin, 1,2- or 3,4-diepoxybutane, bisepoxy propyl ether, ethylene glycol-bis-epoxy propyl ether. , 1,4-butanediol-bis-epoxypropyl ether, and closely related compounds, but are not limited thereto. If cross-linking is performed, the crystalline structure of cellulose can be maintained even when many cationic substituents are modified, so that the structure of the particles can be stably maintained.
  • the method of modifying the cellulose constituting the porous cellulose fine particles used in the concentration method of the present embodiment with a cationic substituent is not particularly limited. It can be introduced in multiple ways, such as by modification.
  • a preferred method is to directly modify hydroxyl groups of cellulose using 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride or the like. Since many hydroxyl groups are present in cellulose, it is possible to uniformly modify even the inside of the particles with a large amount of cationic substituents by directly modifying the hydroxyl groups.
  • a third substituent such as an epoxy group, the introduction amount and variation of the cationic substituent depend on the introduction amount of the third substituent, and the introduction amount inside the particle is also controlled.
  • the reaction conditions for introducing a cationic substituent using 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride are not particularly limited, but the change in pH of the solution due to 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride itself should be considered.
  • the intrapore charge density can be controlled by setting the optimum pH and adding additives such as Glauber's salt to minimize the effects of charging of cellulose hydroxyl groups.
  • a preferred cationic functional group in this embodiment is an N,N-diethylaminoethyl (DEAE) group.
  • the dry particle weight (mg) per 1 mL of the volume of particles swollen with PBS(-) (swelling volume) is preferably 70 mg or less, more preferably 55 mg or less, and even more preferably. is 40 mg or less.
  • a low dry particle weight per swollen volume means that the porous particles have large pore sizes in the liquid and a high porosity.
  • the porous cellulose microparticles used in the adsorption method of the present embodiment utilize as much of the substance to be detected in the sample (bacteria or virus itself, or its surface or internal components) as possible. 50% or more is preferable, 60% or more is more preferable, 70% or more is more preferable, and 80% or more is most preferable.
  • the surface of the porous cellulose microparticles refers to the combination of both the outermost surface of the microparticles and the pore surfaces.
  • the amount of the sample containing microorganisms to be brought into contact in the adsorption method of the present embodiment can be increased or decreased according to the amount of porous cellulose fine particles used. method), the greater the liquid volume, the lower the probability of contact between the particles and the microorganisms during stirring. 0.1 mL or less.
  • the column method (method of contacting particles and microorganisms by solid-phase separation described in Example 4)
  • there is no limitation on the amount of liquid passing but if the sample is too large, it will take time to pass the liquid, and the operation method will not be simple. , preferably 0.1 mL or more and 10000 mL or less, more preferably 1 mL or more and 10000 mL or less, and still more preferably 1 mL or more and 1000 mL or less.
  • a second embodiment of the present invention is a concentration container for use in a method of concentrating microorganisms in a sample liquid containing microorganisms in a solvent using porous cellulose fine particles having a large number of pores therein.
  • the concentration vessel is a tubular body having an inlet opening and an outlet opening; Two filters provided on the inlet opening side and the outlet opening side at predetermined intervals, respectively; and Porous cellulose fine particles filled in the space defined by the two filters; , where The sample liquid supplied from the inlet opening side comes into contact with the porous cellulose fine particles, and the microorganisms contained in the sample liquid are adsorbed on the surface of the porous cellulose fine particles, while the solvent of the sample liquid is is removed from the outlet opening side to concentrate the microorganisms on the surface and/or within the pores of the porous cellulose microparticles, and
  • the permissible water content of the porous cellulose microparticles is the mass of PBS(-) of the porous cellulose microparticles in
  • the concentration container is characterized in that the free water ratio ((CE)/E) obtained by dividing the dehydrated amount (CE) by E is 2.9 or more.
  • the porous cellulose microparticles used in this second embodiment can be the same as those used in the first embodiment described above.
  • a schematic diagram of the concentration vessel is shown in FIG.
  • microorganism is not particularly limited, and broadly includes various bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, various viruses, fungi, protozoa, and rickettsia. In this embodiment, these microorganisms are targets to be concentrated.
  • sample liquid containing bacteria, viruses, etc. is not particularly limited, and is a patient specimen (e.g., urine or body fluid) or food sample (e.g., liquid sample, bacteria or virus extract by stomacher), or environmental sample ( for example, water quality).
  • a carrier for concentration refers to a carrier used for concentrating a solution containing the target of concentration by attaching the target and reducing the supernatant.
  • Objects to be removed include, but are not limited to, bacteria, various viruses, and proteins other than the object to be concentrated.
  • the adsorption amount per particle weight refers to the number of adsorbed microorganisms per dry weight of the carrier after adhesion of microorganisms (particles/mg), and it can be said that the higher this value, the higher the density of microorganisms obtained. .
  • This high-density body of microorganisms is not limited as to whether the carrier (composite) to which the microorganisms have adhered is used as it is or the adsorption carrier and the microorganisms are separated and used. Also, there is no restriction as to whether or not the contained moisture is removed from the high-density body.
  • the eluent can be passed through the high-density body to recover only the microorganisms.
  • the smaller the water content brought in from the high-density body the higher the concentration of the concentrate can be obtained.
  • a known method can be used to remove the contained moisture. Examples thereof include drying under reduced pressure, centrifugal separation, replacement by passing air or the like, and removal by a water-absorbing body, but are not limited to these, and are appropriately selected according to the application.
  • centrifugal separation is suitable for controlling the power to remove the contained water, and if the contained water is removed by a simple operation without using special equipment, a method of aerating and replacing air with a syringe or the like is used. preferred.
  • centrifugation at 1000 G for 1 minute corresponds to aeration of 1-2 mL of air.
  • a suitable eluent can be selected for the purpose of obtaining a viable bacterial fluid.
  • the eluent can be selected primarily from the salt concentration, preferably 0.1 M or more, more preferably 0.3 M or more, but if the salt concentration is too high, it will adversely affect the collected bacteria, so it is preferable. is less than or equal to 1M.
  • the ionic species of the eluent is selected from cations or anions. Generally, the higher the valence, the higher the elution ability. The choice of is important. On the other hand, it is necessary to consider whether the solubility is such that the above range of ion concentration can be obtained in the environment (for example, 0° C. to 40° C.) in which the present invention is implemented.
  • a salt containing magnesium ions is preferable, and magnesium chloride is more preferable.
  • the pH of the eluent is important for maintaining the survival of microorganisms and for guiding the electrostatic interaction due to the surface charge between the microorganisms and the adsorption carrier in a direction favorable to the separation.
  • a buffer can also be added to the eluent to keep the pH constant.
  • pH 2-10 is preferred for E. coli and Staphylococcus aureus, more preferably pH 4-8.
  • the eluent can contain surfactants, enzymes, chaotropic salts, sugars, amino acids, macromolecules, etc., depending on how the collected bacteria are used.
  • the high-density body when obtaining concentrated bacterial or viral surface or internal components, the high-density body can be brought into contact with the lysing component, and the target eluted component can be recovered. At this time, the smaller the water content brought in from the high-density body, the higher the concentration of the target component can be obtained, and the water content can be removed by the method described above.
  • the bacteriolytic component is appropriately selected from bacterial species or viral species and is not limited, but the excellent chemical strength (e.g., hydrolysis resistance, chemical resistance) of porous cellulose microparticles is utilized.
  • alkaline solutions organic solvents, surfactants, enzymes, chaotropic salts, sugars, amino acids, polymers and the like can be included.
  • the target component can be eluted by subjecting the high-density body to ultrasonic waves or heat treatment. can.
  • the high density of microorganisms can be washed with a suitable solution at any step.
  • one wash can be performed to remove unwanted contaminants from patient specimens or food components.
  • an appropriate eluent it can be carried out for the purpose of selectively removing only specific microorganism species or cell species.
  • direct examination for example, detection of bacteria by an immunological method
  • it can be carried out for the purpose of B/F separation of the detection reagent to act.
  • the cleaning solution is appropriately selected from bacterial species or viral species and is not limited, but considering the selection range of the eluent and/or lysis components described above, a composition that does not elute or lyse the microorganism to be tested is selected. preferable.
  • the permissible water content C (g) per 100 mg of particles is calculated by the following formula (1).
  • Permissible water content per 100 mg of particles C (g) B - (0.1 + A) ... formula (1)
  • the above column is centrifuged at 1000 G for 1 minute, and the column weight D (g) after dehydration by centrifugal force is measured.
  • the mass of PBS( ⁇ ) after centrifugation (E: bound water content) (g) per 100 mg of particles is calculated by the following formula (2).
  • Bound water content E (g) D - (0.1 + A) ... formula (2)
  • the free water content ratio F is calculated by the following formula (3).
  • F (CE) / E ... formula (3)
  • FIG. 2 shows an overview of the allowable water content (g) and the method for measuring the free water content.
  • the average particle size is the average particle size of 20 or more particles measured by swelling the porous particles with water or saline, removing excess water, and setting a suitable magnification under a microscope.
  • the average pore diameter of the pores was obtained by swelling the porous particles with water or saline, removing excess water, setting the magnification to an appropriate level with a microscope, and measuring the distance between the membranes of 20 or more particles. is the pore size.
  • the diameter of each hole was defined as the shortest diameter when the hole was not perfectly spherical or circular.
  • the surface area is the surface area measured by the BET method, and the specific surface area is the surface area per 1 g of dry particles.
  • Dry particle weight (mg) per swelling volume (mL) Using a heat drying moisture meter (MX-50, manufactured by A&D), the moisture content of the porous particle sample was measured, and the porous particle sample was passed through an empty column (Polyprep (registered trademark), Bio- Rad Laboratories, Inc.). 20 mL of PBS( ⁇ ) is added, and PBS( ⁇ ) drips from the bottom of the column due to gravity. When the PBS( ⁇ ) stops dropping, the packed volume I (mL) of the particles is measured using the scale of the column.
  • E. coli T1 phage 15 ⁇ L of E. coli strain (JM109 No. 25922) was inoculated into 10 mL of 3% Tripticase Soy Broth liquid medium (211768, manufactured by BD) sterilized by autoclave, shake cultured at 37° C. for 16 hours under aerobic conditions, and added with 1% Proteose Peptone. 100 ⁇ L of Escherichia coli T1 phage (T1, NBRC20001) diluted with an aqueous solution (SIGMA, P0431-250G) was inoculated and further cultured for 7 hours.
  • the molecular weight of 100 kDa or less was removed by ultrafiltration, and the number of phage plaques was measured by the double agar plate method and found to be 3.7e9 pfu/mL.
  • the resulting Escherichia coli T1 phage solution is appropriately diluted with physiological saline and used.
  • porous cellulose fine particles also referred to as the particles of the present invention in this document
  • (a) 500 mL of a cellulose copper ammonium solution with a viscosity of 2 poise at 5 ° C., a cellulose concentration of 2%, a copper concentration of 1.2%, and an ammonia concentration of 4% prepared using purified linter as a raw material was sprayed with nitrogen gas using a two-fluid nozzle, It was received with stirring in 10 L of silicon oil (SH200, 1.5 cs, Toray Industries, Inc.) cooled to -40°C. The silicone oil was heated to -20°C and stirred for 20 minutes, and 10 L of 40% sulfuric acid cooled to -35°C was added.
  • silicon oil SH200, 1.5 cs, Toray Industries, Inc.
  • a particle sample having an average particle size of 200 ⁇ m or more and 280 ⁇ m or less was obtained using a classifying sieve.
  • 6.66 g of a particle sample was weighed and reacted (pure water: 267.77 g, sodium dodecyl sulfate: 0.016 g, 48% sodium hydroxide aqueous solution: 13.05 g, epichlorohydrin: 3.845 g). and stirred in a constant temperature bath at 60° C. for 1 h.
  • the sample was washed with 8000 mL of pure water three times by suction filtration to obtain crosslinked cellulose microparticles.
  • the total amount of the obtained crosslinked cellulose fine particles was added to the reaction solution (pure water: 217.30 g, anhydrous mirabilite: 88.83 g, sodium dodecyl sulfate: 0.016 g, 2-(diethylamino)ethyl chloride hydrochloride aqueous solution (50%): 11. 08 g) and stirred.
  • reaction starter solution (48% sodium hydroxide aqueous solution: 5.33 g, pure water: 6.83 g) was added and lightly stirred, and then the reaction was carried out while stirring in a constant temperature bath at 70°C for 1 hour.
  • a neutralizing solution (36% hydrochloric acid: 3.14 g, pure water: 3.14 g) was added and stirred, and the sample was washed three times with 8000 mL of pure water by suction filtration to obtain the particles of the present invention.
  • the obtained particles had an average particle diameter of 240 ⁇ m, an average pore diameter of 30 ⁇ m, through holes having an average pore diameter of 30 ⁇ m or less, a surface area (specific surface area) per 1 g of dry particles of 1.1 m 2 /g, and a charge capacity of 1. .80 mmol/g.
  • the porous cellulose fine particles prepared in this manner are referred to as (a).
  • reaction starter solution (48% aqueous sodium hydroxide solution: 1.930 g, pure water: 6.83 g) was added and stirred lightly, and then the reaction was allowed to proceed while stirring in a constant temperature bath at 70°C for 1 hour.
  • a neutralizing solution (36% hydrochloric acid: 3.14 g, pure water: 3.14 g) was added and stirred, and the sample was washed three times with 8000 mL of pure water by suction filtration, and the charge capacity was 0.55 mmol / g. of particles were obtained.
  • the porous cellulose fine particles prepared in this manner are designated as (b).
  • porous cellulose fine particles prepared in this way are referred to as (ii). As described above, four porous cellulose fine particles having different charge capacities were obtained.
  • Example 1 Measurement of dry particle weight per swollen volume
  • the dry particle weight (mg) per swollen volume (mL) was measured for the particles of the present invention (a) and the comparative particles (round one) to (round four). The results are shown in Table 2 below.
  • the particles of the present invention had the smallest dry particle weight per swollen volume compared to the comparative particles, and even with a small weight, they significantly absorbed water and swelled. Compared to the comparative particles (Maruichi), which have similar average pore opening diameters when swollen, there is a marked difference, which suggests that the characteristics of the crosslinked cellulose material and structure contribute to this.
  • Example 2 Measurement of permissible water content C and free water content F
  • the permissible water content C and free water content F was measured. The results are shown in Table 3 below.
  • the particles of the present invention retain significantly more water when packed into an empty column compared to the comparative particles (Maruichi) to (Maru4).
  • the moisture is easily liberated from the particles by a gentle centrifugal force of 1000 G for 1 minute and replaced with gas, resulting in physical properties with a significantly high percentage of free moisture.
  • the particles of the present invention are highly permeable to liquids or gases due to their high porosity.
  • Example 3 Measurement of adsorption performance of E. coli by vortex method
  • the particles of the present invention (A) and the comparative particles (Maruichi) to (Wet or suspended particles are weighed divided by the moisture content) 10 mL of PBS(-) was added to each particle and autoclave sterilized at 121° C. for 20 minutes. Centrifugation was performed at 1000 G for 1 minute, the supernatant was removed by aspiration with an aspirator, and 10 mL of sterilized PBS(-) was added. After washing the particles and balancing the charge twice in this way, the volume was diluted to 4 mL.
  • FIG. 3 shows suspensions of the particles of the present invention (a) prepared in this manner and the comparative particles (maruichi) to (maru4).
  • 0.2 mL of the uniformly dispersed particle suspension thus prepared (equivalent to a swollen particle volume of 0.056 mL) is measured into a 2 mL sterile sampling tube, and the E. coli solution prepared in (8) above is diluted 1e4 or 1e6 times. After adding 0.8 mL of the diluted sample, it was vortexed for 30 seconds or 2 minutes at the maximum strength of TUBE MIXER (eccentric vibration method MT-360 manufactured by TOMY).
  • TUBE MIXER eccentric vibration method MT-360 manufactured by TOMY
  • the supernatant was diluted with physiological saline to a dilution ratio K (fold) suitable for plate smear culture, and 100 ⁇ L of the supernatant was inoculated into a standard agar medium (8-MR22, manufactured by Poremedia). After culturing at 35° C. for 48 hours, the number of colonies L (cfu/mL) was measured. In addition, 0.2 mL of physiological saline was used instead of the particle suspension, and the same operation as above was performed to measure the colony number M (cfu/mL). The adsorption amount and adsorption rate of E.
  • Particles (a) of the present invention maintained a high adsorption rate in a wide range of E. coli concentrations (1e3 to 1e5 cfu/mL) compared to comparative particles (Maruichi) to (Maru4).
  • E. coli concentrations 1e3 to 1e5 cfu/mL
  • comparative particles (Maruichi) to (Maru4) In order to obtain a high adsorption capacity, it is necessary to adsorb E. coli to the inside of the particles, so the particles must have a sufficiently large pore size.
  • the adsorption rate of the particles (a) of the present invention is remarkably high. It was found that due to the permeability, highly efficient adsorption of E. coli, which could not be achieved with conventional particles, was realized.
  • FIG. 4 shows an example of a SEM image of porous cellulose fine particles after adsorption of E. coli.
  • the particles of the present invention (a) have a high porosity, the volume of the swollen particles is uniform, and compared to the comparative particles (Maruichi) to (Maruyon), they exhibit highly efficient adsorption performance. , it is possible to obtain a high density of microorganisms with a remarkably large adsorption amount N (number/mg) per dry particle weight.
  • Example 4 Measurement of adsorption performance of E. coli by column method
  • An empty column (Presh-SPE (registered trademark) manufactured by Asti) was filled with 0.2 mL of the uniformly dispersed particle suspension prepared in Example 3, and excess PBS (-) was removed by aspiration from the outlet.
  • a column packed with particles was prepared.
  • 10 mL of a 1e3-fold diluted sample of the E. coli solution prepared in (8) above hereinafter referred to as 1e3-fold diluted E. coli solution or E. coli sample
  • the liquid that passed through the column (hereinafter referred to as flow-through) was collected.
  • the particles of the present invention (A) have a higher adsorption rate T than the comparative particles (Maruichi) to (Marushi), and the vortex method (that is, a method of contacting particles and microorganisms by uniform dispersion), It was found that high adsorption performance can be exhibited regardless of the column method (that is, the contact method of particles and microorganisms by solid phase separation). In addition, it was confirmed that the column method can wash the particles after E. coli adsorption, and that the free water remaining in the particles can be easily removed by aeration.
  • Example 5 Measurement of adsorption performance of microorganisms other than E. coli by column method
  • E. coli, Staphylococcus aureus, and E. coli T1 phage as a virus prepared in (8) above
  • the adsorption amount S of the microorganism per dry particle weight, and the adsorption rate T were calculated respectively.
  • 10 ⁇ L of the diluted solution was mixed with 30 ⁇ L of JM109 E. coli at 1e9 cfu/mL and 5 mL of soft agar, solidified on a standard agar medium, and cultured at 35° C.
  • the particles of the present invention (a) can adsorb the gram-negative bacterium Escherichia coli and the gram-positive bacterium yellow grapes with high efficiency regardless of the bacterial species. Furthermore, it was shown that as microorganisms, not only bacteria but also viruses can be similarly adsorbed.
  • Example 6 Method for recovering bacteria from E. coli adsorbed particles (high density of microorganisms) obtained by column method to obtain E. coli concentrate
  • 1 mL of 1 M magnesium chloride was passed through the Escherichia coli adsorption column finally obtained in Example 4 from which free water was removed, and the flow-through of the eluate was collected.
  • 100 ⁇ L of the diluted solution was inoculated onto a standard agar medium (8-MR22, manufactured by Poremedia), cultured at 35° C. for 48 hours, and the number of colonies was measured. bottom.
  • Example 7 Measurement of adsorption rate T (%) and concentration factor W (times) of particles (a) to (ii) of the present invention having different charge capacities]
  • Example 8 Measurement of adsorption rate T (%) and concentration factor W (times) of the particles of the present invention (a) according to bacterial concentrations, permeation volumes and eluent volumes of different E. coli samples]
  • a column filled with 0.2 mL of the particle suspension of the particles of the present invention (a) (2 mg in terms of dry particle weight) was used to determine the bacterial concentration O of different E. coli samples.
  • Table 10 shows the measurement results of the adsorption rate T (%) and the concentration ratio W (times) depending on the amount of liquid and the amount of eluent.
  • the amount of eluent in Table 10 is the amount (mL) of 1 M magnesium chloride passed through as an eluent.
  • the column packed with 0.2 mL of the particle suspension of the particles of the present invention (a) (equivalent to 2 mg in dry particle weight and 0.056 mL in swollen particle volume) had a flow rate of E. coli sample of It was found that 10 to 1000 mL can be passed through and can be recovered with an eluent volume of 0.1 to 1 mL.
  • this column was able to adsorb E. coli samples up to a bacterial concentration O of 1e8 cfu/mL, and a particularly high adsorption rate T was obtained at concentrations of 1e1 to 1e7 cfu/mL.
  • microorganisms can be concentrated using specific porous cellulose microparticles having a high porosity and dehydration ratio, which are indicated by the permissible water content and the free water ratio. It is possible to obtain a high density of microorganisms with a high adsorption amount of microorganisms per hit, and to recover high concentration of microorganisms from the obtained high density of microorganisms. Therefore, the concentration method and the concentration container according to the present invention can be suitably used in microbiological tests and the like.

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Abstract

簡便な手段で迅速に細菌等の高濃縮物を得ることができる濃縮方法及び容器を提供する。本発明は、溶媒中に微生物を含有する試料液体中の微生物をその内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法であって、試料液体を該多孔質セルロース微粒子に接触させて微生物を多孔質セルロース微粒子の表面に吸着させる工程；及び試料液体の溶媒を除去して多孔質セルロース微粒子の空孔内に該微生物を濃縮する抜液工程を含み、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、該許容含水量Ｃから膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）をＥで除した遊離水分比率が２．９以上である微生物の濃縮方法及び容器に関する。

Description

微生物の濃縮方法及び濃縮容器
　本発明は、溶媒中に微生物、例えば、細菌、ウイルスを含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法、並びに該濃縮方法に用いる濃縮容器に関する。
　感染症診断、又は環境検査や食品微生物検査において病原体又は品質を害する有害微生物を試料中から迅速かつ簡便な方法で検出し、同定し、及び／又は計数することが求められている。
　例えば、感染症診断では医師や看護師が被検者の傍らで早期に適切な臨床判断を行うためにＰＯＣＴ（簡易迅速検査）による病原菌又はウイルスの同定が行われている。また、環境検査や食品微生物検査では、従業員又は環境の衛生管理、原料・中間品・最終製品の品質管理として一般細菌や大腸菌群などの環境指標菌や、食中毒菌、ウイルスなどの有害微生物を対象とした検査が行われている。いずれも小規模事業や、オンサイトになるほど特殊機器や、微生物学知識を必要としない平易な操作方法が求められる。
　該微生物の検査方法は、分離培養を経てその生化学的性状をもとに該微生物の同定を行う培養法、該微生物に特異的な遺伝子をもとにＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などにより増幅し検出する遺伝子法、該微生物特有の抗原マーカーと抗体との特異的反応を利用して検出を行う免疫法に大別できる。
　いずれの検査法も利用する試料が０．０１～１ｍＬ程度と少ないため、患者検体（例えば、尿や体液）又は食品試料（例えば、液状試料やストマッカーによる細菌又はウイルス抽出液）、又は環境試料（例えば、水質）より採取可能な０．０１～１Ｌ程度に含まれる検出物質（菌やウイルスそのもの、又はその表面または内在成分）の含有量のごく一部しか利用できない。これは、例えば、簡易迅速検査として利用される遺伝子法や免疫法の検出精度又は感度の制限につながる。
　また、微生物が微量である場合、サンプリングでの空振りを避けるために長時間（例えば、２４時間）の増菌培養が行われており、検査の簡便性や迅速性を損ねている。
　かかる問題を解決し、かつ大型装置を用いず十分な検出物質を確保する手段として、吸着担体による微生物の吸着、分離、回収による濃縮が行われる。
　例えば、以下の特許文献１では、無機微小粒子（非晶質金属珪酸塩）と試料とを１～２０分間振盪することで大腸菌を吸着している。しかしながら、特許文献１に記載された粒子は、架橋セルロース粒子ではなく、５０％以上の吸着率を得るために１０分以上の振盪を要しており、また、１ｅ３ｃｆｕ／ｍＬ（以下、１ｅＭは１０のＭ乗を表す）の大腸菌試料１０ｍＬに対し１０ｍｇもの無機微小粒子を使用している。また、特許文献１には、乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等に関する記載はない。
　以下の特許文献２には、乳房炎の細菌性疾病検査のために病因細菌と細胞とが混在している検体にアミノシリカを接触し、病因細菌だけを回収する方法が記載されている。しかしながら、特許文献２に記載された粒子は、架橋セルロース粒子ではく、アミノシリカと試料との攪拌に１時間を要している。また病因細菌の濃縮ではなく細胞との分離が目的であり、ましてや乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等に関する記載はない。
　他方、以下の特許文献３には、平均孔径２０～５００ｎｍの連続微細気孔と平均孔径１～５０μｍの連続小気孔の２種類の連続気孔構図を有するリン酸カルシウム系多孔質顆粒で、ウイルス及び細胞の吸着分離剤が記載されている。しかしながら、特許文献３に記載された粒子は、架橋セルロース粒子ではく、乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等に関する記載はない。
　以下の特許文献４には、ウイルスを含有する可能性のある試料に、粒子表面にカチオン性基を有し、粒径が０．５～３００μｍである粒子と、標的ウイルスの表面抗原に対する抗体とを添加し、ウイルスを前記粒子に付着させる工程と、ウイルスが付着した前記粒子を試料から分離、収集する工程を含むウイルス濃縮方法が記載されている。かかるウイルス濃縮方法により、簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、自動化への対応も容易で、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさないウイルス濃縮を提供できると記載されている。しかしながら、記載された粒子は、各種モノマーを重合して得た非多孔質の合成ポリマーであり、細菌の濃縮方法への適用について、ましてや乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等に関する記載はない。
　以下の特許文献５には、ウイルス含有試料を、多孔性粒子を含むベース担体にポリエチレンイミンが結合した構造を有する吸着剤と接触させて、前記ウイルス含有試料からウイルスを除去する方法が記載されている。ベース担体として特定のリガンドを有する架橋セルロース粒子が挙げられているが、細菌の濃縮方法への適用について、ましてや乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等に関する記載はない。
　以下の特許文献６ではポリカチオンで修飾された多孔質セルロース微粒子を菌体、酵母、動植物細胞培養用のマイクロキャリアとして産業上利用できることが記載されているが、付着及び増殖を前提としたものであって、溶媒を除去したり、空孔内に微生物を濃縮する抜液工程に関する記載はなく、ましてや乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等に関する記載はない。
特許第５９７２１７４号公報 特許第４８８９２６３号公報 特許第２５４３７６６号公報 特許第４１６１１６７号公報 特開２０１９－１９４５４７号公報 特開平４－９１１４２号公報
　特許文献１、２、３、４には、細胞又はウイルスの吸着剤が記載されているものの、その材質は、非多孔質の合成ポリマー、多孔質の非晶質金属珪酸塩、多孔質のリン酸カルシウム等であり、以下に説明する乾燥粒子の一定質量当たりの許容含水量、空隙率等の特性を有する空隙率及び透過率の高いセルロース微粒子ではないため、微生物の高密度体を得ることは困難である。
　また、特許文献５には、吸着剤としてポリエチレンイミンが結合した架橋セルロース粒子が記載されているが、かかる吸着剤は、リガンドとして上記特定のポリエチレンイミンが結合されたものであり、ウイルスの吸着除去に特化したものである。
　さらに、特許文献１、２、４、５には、微生物試料に吸着剤を接触するための条件が記載されているものの、１０ｍＬの検体試料を吸着剤に十分に吸着するためには少なくとも１０分攪拌・振盪を要しており、平易な操作方法とは言えない。
　前述した従来技術の現状に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、簡便な手段で、迅速に微生物の高濃縮物を得ることができる微生物の濃縮方法及び該濃縮方法に用いるための濃縮容器を提供することである。
　本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、吸着剤としての多孔質セルロース微粒子において、乾燥粒子１００ｍｇをＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（－）（以下、ＰＢＳ（－）ともいう。）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで1分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上であるものとすることにより、前記課題を解決しうることを予想外に見出し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
　［１］溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法であって、以下の工程：
　該試料液体を該多孔質セルロース微粒子に接触させて、該試料液体中に含有される微生物を、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着させる工程；及び
　該試料液体の溶媒を除去して、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物を濃縮する抜液工程；
を含み、該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで1分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上である、微生物の濃縮方法。
　［２］以下の工程：
　前記抜液工程後に、溶離液を用いて多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に濃縮された微生物を、該溶離液中に回収する工程；
をさらに含む、前記［１］に記載の方法。
　［３］前記各工程間に、液体又は気体で、多孔質セルロース微粒子を洗浄する工程をさらに含む、前記［１］又は［２］に記載の方法。
　［４］前記多孔質セルロース微粒子の平均粒子径は１００μｍ以上１０００μｍ以下である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］前記多孔質セルロース微粒子の空孔の平均開孔径が１μｍ以上１００μｍ以下である、前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］前記多孔質セルロース微粒子は、隣接した空孔間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成している、前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］前記多孔質セルロース微粒子の乾燥粒子１ｇ当たりの表面積（比表面積）が、０．３ｍ2／ｇ以上４．４ｍ2／ｇ以下である、前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
　［８］前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、カチオン性官能基を有し、かつ、荷電容量が、０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上５．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、前記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
　［９］前記カチオン性官能基が、第一級アミノ基、第二級アミノ基、及び第三級アミノ基からなる群より選択される少なくとも一種である、前記［８］に記載の方法。
　［１０］前記カチオン性官能基が、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）である、前記［９］に記載の方法。
　［１１］前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、分子間架橋されている、前記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
　［１２］前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、銅アンモニア再生セルロースからなる、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
　［１３］前記微生物は、細菌又はウイルスである、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
　［１４］溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法に用いるための濃縮容器であって、
　該濃縮容器は、
　入口開口と出口開口を有する筒状本体；
　該出口開口側に設けたフィルター；及び
　該フィルター上の空間に充填された多孔質セルロース微粒子；
を備え、ここで、
　該入口開口側から供給された該試料液体は、該多孔質セルロース微粒子に接触し、該試料液体中に含有される微生物は、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着されながら、該試料液体の溶媒は、該出口開口側から除去されて、該多孔質セルロース微粒子の空孔内に該微生物が濃縮され、かつ、
　該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上であることを特徴とする、濃縮容器。
　［１５］前記多孔質セルロース微粒子の平均粒子径は１００μｍ以上１０００μｍ以下である、前記［１４］に記載の濃縮容器。
　［１６］前記多孔質セルロース微粒子の空孔の平均開孔径が１μｍ以上１００μｍ以下である、前記［１４］又は［１５］に記載の濃縮容器。
　［１７］前記多孔質セルロース微粒子は、隣接した空孔間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成していることを特徴とする、前記［１４］～［１６］のいずれかに記載の濃縮容器。
　［１８］前記多孔質セルロース微粒子の乾燥粒子１ｇ当たりの表面積（比表面積）が、０．３ｍ2／ｇ以上４．４ｍ2／ｇ以下である、前記［１４］～［１７］のいずれかに記載の濃縮容器。
　［１９］前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、カチオン性官能基を有し、かつ、荷電容量が、０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上５．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、前記［１４］～［１８］のいずれかに記載の濃縮容器。
　［２０］前記カチオン性官能基が、第一級アミノ基、第二級アミノ基、及び第三級アミノ基からなる群より選択される少なくとも一種である、前記［１９］に記載の濃縮容器。
　［２１］前記カチオン性官能基が、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）である、前記［２０］に記載の方法。
　［２２］前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、分子間架橋されている、前記［１４］～［２１］のいずれかに記載の濃縮容器。
　［２３］前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、銅アンモニア再生セルロースからなる、前記［１４］～［２２］のいずれかに記載の濃縮容器。
　［２４］前記微生物は、細菌又はウイルスである、前記［１４］～［２３］のいずれかに記載の濃縮容器。
　［２５］溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法であって、以下の工程：
　入口開口と出口開口を有する筒状本体；該出口開口側に設けたフィルター；及び該フィルター上の空間に充填された多孔質セルロース微粒子；を備えた濃縮容器中で、該試料液体を該多孔質セルロース微粒子に接触させて、該試料液体中に含有される微生物を、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着させる工程；及び
　通気を行い、該試料液体の溶媒を除去して、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物を濃縮する抜液工程；
を含み、該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上である、微生物の濃縮方法。
　［２６］前記通気は、前記濃縮容器入口開口部からシリンジにより、空気を通気するものである、前記［２５］に記載の微生物の濃縮方法。
　［２７］前記空気の体積は前記多孔質セルロール微粒子１ｍｇあたり、０．５ｍＬ以上１ｍＬ以下である、前記［２６］に記載の微生物の濃縮方法。
　本発明に係る濃縮方法及び濃縮容器では、許容含水量及び遊離水分比率で指標される空隙率及び脱水率が高い特定の多孔質セルロース微粒子を用いて微生物を濃縮することができるため、粒子乾燥重量当たり微生物の吸着量が高く、微生物の高密度体を得ることができ、また、得られた微生物の高密度体から高濃度の微生物を回収することもできる。それゆえ、本発明に係る濃縮方法及び濃縮容器は、微生物検査等において好適に利用可能である。
多孔質セルロース微粒子（架橋セルロースと表示）と、他の濃縮担体の写真である。 「許容含水量」、「遊離水分比率」の概念図、及び求め方の説明図である。 多孔質セルロース微粒子（本発明粒子と表示）、及び比較粒子丸一～丸四の粒子懸濁液である。 大腸菌吸着後の多孔質セルロース微粒子の電子顕微鏡である。 多孔質セルロース微粒子を保持するための濃縮容器の概略図である。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明の第一の実施形態は、溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法であって、以下の工程：
　該試料液体を該多孔質セルロース微粒子に接触させて、該試料液体中に含有される微生物を、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着させる工程；及び
　該試料液体の溶媒を除去して、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物を濃縮する抜液工程；
を含み、該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上である、微生物の濃縮方法である。
［許容含水量（ｇ）、遊離水分比率］
　「許容含水量」、「遊離水分比率」の概念図、及び求め方の説明図を図２に示す。
　許容含水量は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での粒子のＰＢＳ（－）の質量であり、粒子がどれだけ多くの液体を吸水するかを示す絶対指標である。この値が大きいほど粒子は膨潤により内部に空隙を形成するため、許容含水量が高いことは、膨潤時の空孔のサイズが大きいこと、空隙率が高いことを意味する。また一般に、空隙率が高い程、多孔質中の水は透過しやすいことが知られており、許容含水量が高いことは水の透過率が高いことを意味する。空孔サイズが大きいと、微生物を空孔内部の表面に吸着することができ、水の透過性が高いと、微生物が空孔内部に浸透しやすくなる。また、微生物回収時にも微生物を溶離（脱離）しやすくなる。許容含水量は高いほど好ましく、好ましくは１．９ｇ以上、より好ましくは２．１ｇ以上、さらに好ましくは２．４ｇ以上，最も好ましくは２．６ｇ以上である。図１に示すように本実施形態で用いる多孔質セルロース微粒子（架橋セルロースと表示）は、他の濃縮用担体に比較して、膨潤時に微粒子内部に多数の空孔を有し、空隙率が高いものであることが分かる。
　遊離水分比率は、上記膨潤状態における許容含水量Ｃから１０００Ｇの遠心力を１分間加えたとき、粒子に残るＰＢＳ（－）の質量（Ｅ：結合水分量）と、粒子から除かれるＰＢＳ（－）の質量（Ｃ－Ｅ：遊離水分量）の比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）であり、膨潤粒子がどれだけ多くの液体を脱水するかを示す相対指標である。この値が大きいほど粒子は結合水分量に対し遊離水分量が多いこと、すなわち相対的な脱水量が多いことを意味する。脱水量が多いと、余分な水分を排除することができるため、微生物の高密度体（粒子重量当たりの高い吸着微生物数（個／ｍｇ））を得ることができる。遊離水分比率は高いほど好ましく、好ましくは２．９以上、より好ましくは５．７以上、さらに好ましくは６．４以上、最も好ましくは７．１以上である。
　抜液工程における含有水分の除去は公知の方法を利用できる。例えば、減圧乾燥や、遠心分離、空気等を通気することによる置換、吸水体による除去等が挙げられるがこの限りではなく、用途に応じて適切に選択される。例えば、含有水分を除去する力を制御する場合は遠心分離が好適であり、特殊機器を用いず平易な操作で含有水分を除去する場合は、シリンジ等により空気等を通気し、置換する方法が好適である。一実施形態の例において、１０００Ｇによる１分間の遠心分離は、１～２ｍＬの空気の通気に相当する。
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースの種類は、特に制限はないが、銅アンモニア再生セルロース、ビスコース再生セルロース、コットン、パルプ、ポリノジックなどの公知のセルロースが挙げられ、好ましくは銅アンモニア再生セルロース、ビスコース再生セルロースであり、より好ましくは銅アンモニア再生セルロースである。銅アンモニア再生セルロースは、結晶化度が低いため各種官能基修飾の際の反応性が高く、多孔粒子であっても粒子内部にまで均質に修飾することが可能である、かつ、粒子の形態安定性にも優れる。
［平均粒子径（μｍ）］
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子の平均粒子径は、１００μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下、さらに好ましくは２００μｍ以上４００μｍ以下、さらに好ましくは２００μｍ以上２８０μｍ以下である。平均粒子径が１００μｍより小さいと、多孔質セルロース微粒子を保持するための濃縮容器の入口開口側と出口開口側のフィルターの目開きを小さくする必要があり、微生物を含有する試料液体を供給する際、または該試料液体の溶媒を除去する際の圧力損失が増大し、操作性の低下や、処理液量への制約が生じる。他方、平均粒子径が１０００μｍより大きいと、粒子にかかる抵抗が増大し、粒子内部よりも粒子間隙の流れが優先される結果、透水性が不均一化（又は低下）する場合がある。本明細書における平均粒子径とは、多孔粒子を水又は生理食塩水で膨潤した後に余分な水を除去し、光学顕微鏡により適当な倍率に設定して、２０粒子以上測定した平均の粒子径である。
［空孔の平均開孔径（μｍ）］
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子の空孔の大きさは、平均開孔径が１μｍ以上１００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１０μｍ以上８０μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。平均開孔径が１μｍより小さいときは、多孔質セルロース微粒子中での微生物を含有する試料液体の自由な移動が実現できない場合がある。また、一般にウイルスの粒径は凡そ０．０２μｍであり、細菌の粒径は凡そ１μｍ～５μｍであり、ウイルスの場合は粒径が極めて小さいため、細孔内の移動（変位）は、ブラウン運動が支配的になり、他方、細菌はその粒径が支配的になるため、いずれの微生物においても多孔質セルロース微粒子の平均開孔径が１μｍより小さいときは粒子内部への吸着が著しく制限される場合がある。他方、平均開孔径が１００μｍより大きいと微生物の吸着に十分な表面積を確保することができないため、微生物を効率よく濃縮することができない場合がある。本明細書における平均開孔径とは、多孔粒子を水又は生理食塩水で膨潤した後に余分な水を除去し、電子顕微鏡により適当な倍率に設定して、膜間の距離を２０粒子以上測定した平均の開孔径である。また各空孔の開孔径については、それが真球や真円でない場合は、最も短い直径をもって定義した。
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子は、空孔間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成していることが好ましい。互いに連通した構造であれば多孔質セルロース微粒子の内部にまで効率よく微生物を吸着することができ、更には微生物が吸着するための表面積を高くすることができる。
［比表面積（ｍ2／ｇ）］
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子の乾燥時の表面積（比表面積）は、０．３ｍ2／ｇ以上４．４ｍ2／ｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．６ｍ2／ｇ以上３．３ｍ2／ｇ以下、さらに好ましくは０．８ｍ2／ｇ以上１．７ｍ2／ｇ以下である。表面積が０．３ｍ2／ｇより小さいと、微生物の吸着に必要な表面が少なく、効率よく微生物を濃縮できない場合がある。他方、乾燥時の表面積が４．４ｍ2／ｇ以上であると単位面積当たりの荷電が低くなってしまい微生物の付着率が低下してしまう場合がある。本明細書における表面積とはＢＥＴ法により測定した表面積である。
［荷電容量（ｍｍｏｌ／ｇ）］
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子の荷電容量は、ポリスチレン、ゼラチンなどの粒子と違い基材であるセルロースに含まれる水酸基の影響も考慮する必要がある。またデキストラン粒子などの多糖類の粒子と比べても分子内の水素結合や結晶化度が大きく違うため考慮する必要がある。本実施形態の多孔粒子の荷電容量は、０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上５．０ｍｍｏｌ／ｇ以下が好ましく、より好ましくは０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上３．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、さらに好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｇ以上３．０ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、よりさらに好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｇ以上２．５ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、よりさらに好ましくは０．７ｍｍｏｌ／ｇ以上２．５ｍｍｏｌ／ｇ以下であり、特に好ましくは０．９ｍｍｏｌ／ｇ以上２．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である。荷電容量が上記範囲であると、細孔の表面積が特定範囲であることと相まって、単位表面積当たりの荷電が多くなり微生物の付着率を向上することができる。また、溶離液により微生物を回収する際に荷電による阻害を受けず、微生物の回収が可能である。本明細書における荷電容量とは、多孔粒子中のアミンに塩酸を用いて塩素を吸着させた後に、硫酸ナトリウム溶液で吸着した塩素を洗い流した溶液を、クロム酸カリウムを指示薬として硝酸銀滴定して３サンプル以上測定した平均の荷電容量である。
　　本実施形態の多孔質セルロース微粒子を構成するカチオン性の置換基は特に制限されないが、好ましくは、第一級アミノ基、第二級アミノ基、及び第三級アミノ基からなる群より選択される少なくとも一種であり、より好ましくは第三級アミノ基であり、更に好ましくはジエチルアミノエチル基である。
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子は、セルロースを溶解した溶液を望みの形状に成形しつつ溶液の固化温度以下に冷却して凍結させ、次いで溶媒を抽出除去するか又は溶解能力を失わせる方法によって製造することができる。一般には、凍結温度は、溶媒等の凍結温度よりも４０℃以上低くは設定されないことが好ましく、通常は凍結温度よりも０～２０℃低い範囲に選ばれることが多い。
　また、凍結されたセルロース溶液あるいはセルロース誘導体溶液は、次いで、セルロース又はセルロース誘導体を溶解している溶媒を抽出除去するか、その溶解能を低めて（以下、これらの処理を総称して「溶媒除去等」ともいう。）、固化されたセルロース多孔体とする。溶媒除去等の条件は特に制限されるものではない。通常は、凍結体を素早く任意の凝固浴または再生浴中に投入すれば足りるが、凝固浴または再生浴も溶液の凍結温度以下にすることが好ましく推奨される。但し、セルロース誘導体の場合、セルロース再生工程が必要であり、この再生は溶媒除去等と同時に又は逐次的に（すなわち、溶媒除去等を行った後に）行なう。再生自体は常法によって行うことができる。上記製造方法を用いれば、製造時に高分子溶液には多孔化材などの異物を入れる必要がないため、微小な均一径の液滴を容易に作ることができ、粒径コントロールを任意に行なうことができる。空孔の径と形状は基本的に溶液中の溶媒などが凍結固化する際に形成する溶媒などの結晶の大きさと形状により決まる。従って、高分子溶液の種類、温度などの凍結固化条件を変化させることにより空孔の形状及び孔径を調整することができる。
　尚、上記の製造方法を用いれば、得られる多孔質セルロース微粒子は、空孔間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成しているものとなる。
　本実施形態の濃縮方法に用いる多孔質セルロース微粒子としては、造粒したセルロース粒子をそのまま使用することもできるが、架橋して使用することが好ましい。架橋の方法に制限はないが、セルロース多孔体の分子間架橋は、セルロースの水酸基と反応結合し得る官能基を２つ以上もつものならば架橋剤として使用できる。例として、二官能性有機物質が挙げられる。その例としては、アルカリ性反応物質存在下で比較的容易に反応するＸ－Ｒ－Ｚ形〔式中、Ｒは炭素原子を含有する脂肪族残基を表し、Ｘ及びＺは、各種ハロゲン、エポキシ等であり、それらは脂肪族残基の炭素と結合している。〕がある。上記反応に適する二官能性化合物の例には、エピクロロヒドリン、ジクロロヒドリン、１，２－若しくは３，４－ジエポキシブタン、ビスエポキシ・プロピルエーテル、エチレングリコール－ビス－エポキシ・プロピルエーテル、１，４－ブタンジオール－ビス－エボキシプロピルエーテル、これらに密接に関係ある化合物類があるが、特にこれらに限定されるものではない。架橋を行えばカチオン性の置換基を多く修飾した際にも、セルロースの結晶構造を維持することができるため、粒子の構造を安定に保つことができる。
　本実施形態の濃縮方法に用いる多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースにカチオン性の置換基を修飾する方法は特に制限はないが、直接水酸基に修飾する方法や、エポキシ基を有する官能基を介して修飾する方法など、複数の方法で導入することが可能である。好ましくは２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩などを用いて、直接セルロースの水酸基に修飾する方法である。セルロースには水酸基が多く存在するため、直接水酸基を修飾することで粒子の内部にまで均質に多量のカチオン性の置換基を修飾することが可能である。一方でエポキシ基などの第三置換基を介して導入する際には、カチオン性の置換基の導入量、ばらつきが第三置換基の導入量に依存してしまい、粒子内部の導入量まで制御することが困難である。また２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩を用いてカチオン性の置換基を導入する際の反応条件は特に制限はないが、２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩自体による溶液のｐＨの変化を考慮した最適なｐＨの設定と、セルロースの水酸基の荷電の影響を最小限にするために芒硝などの添加物を入れることで、孔内部荷電密度を制御することができる。
　尚、本実施形態においては好ましいカチオン性官能基は、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基である。
［膨潤体積（ｍＬ）当たりの乾燥粒子重量（ｍｇ）］
　本実施形態の多孔質セルロース微粒子は、ＰＢＳ（－）で膨潤した粒子の体積（膨潤体積）１ｍＬ当たりの乾燥粒子重量（ｍｇ）が７０ｍｇ以下であることが好ましく、より好ましくは５５ｍｇ以下、更に好ましくは４０ｍｇ以下である。膨潤体積当たりの乾燥粒子重量が低いことは、多孔性粒子において液体内での空孔のサイズが大きく、空隙率が高いことを意味する。膨潤体積当たりの乾燥粒子重量が上記範囲であると、水の透過性が高くなり、また微生物の孔内での自由な移動が実現されることにより空孔内部の表面に効率的に吸着させることができる。更には微生物回収時にも、溶離液と溶離された微生物の孔外への移動性が高まるため、微生物を溶離しやすくなる。
［吸着率（％）］
　本実施形態の吸着方法に用いる多孔質セルロース微粒子は、試料中の検出物質（菌やウイルスそのもの、又はその表面または内在成分）をできるだけ多く利用するため、多孔質セルロース微粒子の表面に微生物の吸着率が高いものほどよく、５０％以上であるものが好ましく、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは８０％以上である。ここで、多孔質セルロース微粒子の表面とは、微粒子の最表面及び空孔表面の両方を合わせたものを指す。
［微生物の含有試料の量（ｍＬ）］
　本実施形態の吸着方法において接触させる微生物の含有試料の量は、多孔質セルロース微粒子の使用量に応じて増減することができるが、ボルテックス法（実施例３記載の均一分散による粒子と微生物の接触方法）においては液量が多くなるほど攪拌時の粒子と微生物との接触確率が低下するため乾燥重量２ｍｇに対しては１０ｍＬ以下が好ましく、より好ましくは５ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍＬ以下、最も好ましくは０．１ｍＬ以下である。他方カラム法（実施例４記載の固相分離による粒子と微生物の接触方法）においては通液量の制限はないが、試料が多すぎると通液に時間を要し平易な操作方法とならないため、好ましくは０．１ｍＬ以上１００００ｍＬ以下、より好ましくは１ｍＬ以上１００００ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍＬ以上１０００ｍＬ以下である。
　本発明の第二の実施形態は、溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法に用いるための濃縮容器であって、
　該濃縮容器は、
　入口開口と出口開口を有する筒状本体；
　該入口開口側と該出口開口側にそれぞれ所定間隔を空けて設けた２つのフィルター；及び
　該２つのフィルターにより画された空間に充填された多孔質セルロース微粒子；
を備え、ここで、
　該入口開口側から供給された該試料液体は、該多孔質セルロース微粒子に接触し、該試料液体中に含有される微生物は、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着されながら、該試料液体の溶媒は、該出口開口側から除去されて、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物が濃縮され、かつ、
　該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上であることを特徴とする濃縮容器である。
　かかる第二の実施形態で用いる多孔質セルロース微粒子は、前記した第一の実施形態で用いるものと同一であることができる。
本濃縮容器の概略図を図５に示す。
　本明細書中、用語「微生物」とは、特に制限はなく、各種細菌、例えば、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、サルモネラ菌、各種ウイルス、真菌、原虫、リケッチア等を広く包含する。本実施形態では、これらの微生物が濃縮される対象である。また、細菌、ウイルス等を含有する試料液体とは、特に制限はなく、患者検体（例えば、尿や体液）又は食品試料（例えば、液状試料やストマッカーによる細菌又はウイルス抽出液）、又は環境試料（例えば、水質）を広く包含する。
　本明細書中、濃縮用担体とは、濃縮対象を含んだ溶液より、対象を付着し上清を減らすことで濃縮するために用いる担体を指す。除去対象に関しては濃縮対象物以外の細菌、各種ウイルス、タンパク質などが挙げられるが、特に制限はない。
［粒子重量当たりの吸着量（個／ｍｇ）］
　本明細書中、粒子重量当たりの吸着量とは、微生物が付着した後の担体乾燥重量あたりの吸着微生物数（個／ｍｇ）を指し、この値が大きいほど微生物の高密度体を得たといえる。この微生物の高密度体は、微生物が付着した後の担体（複合体）のまま利用するか、吸着担体と微生物とを分離して利用するかの制限はない。また、高密度体から含有水分を除去するか、除去しないかの制限はない。
［微生物の濃縮］
　一実施形態の例として濃縮された細菌液を得る場合、該高密度体に溶離液を通水し、微生物のみを回収することができる。このとき高密度体から持ち込まれる含有水分が少ないほど高濃度の濃縮体を得ることができる。含有水分の除去は公知の方法を利用できる。例えば、減圧乾燥や、遠心分離、空気等を通気することによる置換、吸水体による除去等が挙げられるがこの限りではなく、用途に応じて適切に選択される。例えば、含有水分を除去する力を制御する場合は遠心分離が好適であり、特殊機器を用いず平易な操作で含有水分を除去する場合は、シリンジ等により空気等を通気し、置換する方法が好適である。本実施形態において、１０００Ｇによる１分間の遠心分離は、１～２ｍＬの空気の通気に相当する。生きた細菌液を得る目的では適切な溶離液を選択することができる。
　溶離液は、第一に塩の濃度から選択することができ、好ましくは０．１Ｍ以上、さらに好ましくは０．３Ｍ以上であるが塩濃度が高すぎると回収細菌への悪影響を及ぼすため、好ましくは１Ｍ以下である。
　第二に、溶離液のイオン種は、陽イオン又は陰イオンから選択され、一般的に価数が高いほど溶離能力が高くなるが、例えば、ホウ酸ナトリウムでは溶離能力が消失することからイオン種の選択は重要である。他方、本発明の実施環境（例えば、０℃～４０℃）において上記範囲のイオン濃度が得られる溶解度であるかを考慮する必要がある。上記を考慮した一実施形態として好ましくはマグネシウムイオンを含む塩であり、より好ましくは塩化マグネシウムである。
　第三に溶離液のｐＨは、微生物の生存維持や、微生物と吸着担体の表面電荷による静電相互作用を乖離に有利な方向へ誘導するために重要である。ｐＨを一定に保つために溶離液に緩衝液を添加することもできる。一実施形態では、大腸菌および黄色ブドウ球菌ではｐＨ２～１０が好ましく、より好ましくはｐＨ４～８である。但し、微生物種により適切に選択されるものでありこの範囲に限るものではない。溶離液は回収した細菌の利用形態に応じて界面活性剤、酵素、カオトロピック塩、糖、アミノ酸、高分子等を含むことができる。
［微生物成分の濃縮］
　別の実施形態の例として濃縮された細菌又はウイルスの表面または内在成分を得る場合、該高密度体に溶菌成分を接触させ、目的の溶出成分を回収することができる。このとき高密度体から持ち込まれる含有水分が少ないほど高濃度の目的成分を得ることができ、含有水分の除去は上述の方法を利用できる。溶菌成分は細菌種またはウイルス種より適切に選択されるものであり限定されるものではないが、多孔質セルロース微粒子が化学的強度（例えば、耐加水分解性、耐薬品性）に優れる点を利用し、例えば、アルカリ液、有機溶剤、界面活性剤、酵素、カオトロピック塩、糖、アミノ酸、高分子等を含むことができる。また、多孔質セルロース微粒子が物理的強度（例えば、耐熱性、耐摩耗性）に優れている点を利用し、該高密度体を超音波や加熱処理を行うことで目的成分を溶出することもできる。
［洗浄による夾雑成分分離］
　微生物の高密度体は任意の工程で適切な溶液により洗浄することができる。洗浄の例として、一つは患者検体や食品成分から望まない夾雑成分を除く目的で行うことができる。　また、適切な溶離液を選択することで特定の微生物種や細胞種だけを選択除去する目的で行うことができる。また、高密度体を直接検査に供する場合（例えば、免疫法による細菌検出）などにおいて、作用させる検出用試薬のＢ／Ｆ分離の目的で行うことができる。洗浄液は細菌種またはウイルス種より適切に選択されるものであり限定されるものではないが、上述した溶離液又は／および溶菌成分の選択範囲を考慮し、被検査微生物を溶離又は溶菌しない組成が好ましい。
　以下、実施例、比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
　まず、実施例、比較例で用いた構造体の各物性値の測定方法、菌液の調製方法等を説明する。
（１）許容含水量（ｇ）、及び遊離水分比率
　エンプティカラム（ポリプレップ（登録商標），Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）の風袋重量Ａ（ｇ）を測定する。加熱乾燥式水分計（ＭＸ－５０，Ａ＆Ｄ製）を用いて、多孔粒子試料の水分率を測定し、乾燥重量が１００ｍｇとなるように多孔粒子試料をカラムに充填する。ＰＢＳ（－）（１６６－２３５５５，富士フイルム和光純薬製）を２０ｍＬ添加し、重力によりＰＢＳ（－）がカラム下部より滴下し、落ちなくなった時点でのカラム重量Ｂ（ｇ）を測定する。粒子の１００ｍｇ当たりの許容含水量Ｃ（ｇ）を下記式（１）によって算出する。
　　　粒子の１００ｍｇ当たりの許容含水量Ｃ（ｇ）＝Ｂ－（０．１＋Ａ）…式（１）
　次に、上記のカラムを１０００Ｇで１分間、遠心分離を行い、遠心力により脱水した後のカラム重量Ｄ（ｇ）を測定する。粒子の１００ｍｇ当たりの、遠心後のＰＢＳ（－）の質量（Ｅ：結合水分量）（ｇ）を下記式（２）によって算出する。
　　　結合水分量Ｅ（ｇ）＝Ｄ－（０．１＋Ａ）…式（２）
　遊離水分比率Ｆを、下記式（３）によって算出する。
　　　Ｆ＝（Ｃ－Ｅ）／Ｅ…式（３）
　許容含水量（ｇ）、及び遊離水分比率の測定方法の概要を図２に示す。
（３）平均粒子径（μｍ）
　平均粒子径は、多孔粒子を水又は生理食塩水で膨潤した後に余分な水を除去し、顕微鏡により適当な倍率に設定して、２０粒子以上測定した平均の粒子径である。
（４）空孔の平均開孔径（μｍ）
　空孔の平均開孔径は、多孔粒子を水又は生理食塩水で膨潤した後に余分な水を除去し、顕微鏡により適当な倍率に設定して、膜間の距離を２０粒子以上測定した平均の開孔径である。また、各空孔の開孔径については、それが真球や真円でない場合は、最も短い直径をもって定義した。
（５）比表面積（ｍ2／ｇ）
　表面積は、ＢＥＴ法により測定した表面積であり、比表面積は乾燥粒子１ｇ当たりの表面積である。
（６）荷電容量
　試料を５．０ｇ測りとり、ロート、吸引ろ過器を用いて、蒸留水３０ｍＬで２回洗浄し、水で置換する。０．３Ｎの塩酸水溶液３０ｍＬで２回、１０-4Ｎ塩酸の塩酸水溶液５０ｍＬで４回の順に洗浄する。その後ロート、吸引ろ過器を用いて、１０％硫酸ナトリウム水溶液５０ｍＬ×４回洗浄し、ろ液を回収する。回収したろ液に０．１Ｎクロム酸カリウム水溶液を２ｍＬずつ入れて攪拌する。そして１Ｎ硝酸銀水溶液にて滴定し、滴定量Ａ（ｍＬ）を求める。
　また、別途上述の工程にて１０％硫酸ナトリウム水溶液で洗浄まで終えた試料を純水５０ｍＬで４回洗浄し、１０５℃で１５時間以上乾燥し、天秤にて重量を測定し、乾燥重量Ｂ（ｇ）を求める。
　荷電容量測定は、上記測定した滴定量Ｇ（ｍＬ）と試料の乾燥重量Ｈ（ｇ）を用いて下記式（４）によって算出する。
　　　荷電容量（ｍｍｏｌ／ｇ）＝１（Ｎ）（ｍｏｌ／Ｌ）×Ｇ／Ｈ…式（４）
（７）膨潤体積（ｍＬ）当たりの乾燥粒子重量（ｍｇ）
　加熱乾燥式水分計（ＭＸ－５０，Ａ＆Ｄ製）を用いて、多孔粒子試料の水分率を測定し、乾燥重量が１００ｍｇとなるように多孔粒子試料をエンプティカラム（ポリプレップ（登録商標），　Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）に充填する。ＰＢＳ（－）を２０ｍＬ添加し、重力によりＰＢＳ（－）がカラム下部より滴下し、落ちなくなった時点での粒子の充填体積Ｉ（ｍＬ）をカラムの目盛りを用いて計測する。膨潤体積当たりの乾燥粒子重量Ｊ（ｍｇ／ｍＬ）を下記式（５）によって算出する。
　　　膨潤体積当たりの乾燥粒子重量Ｊ（ｍｇ／ｍＬ）＝１００／Ｉ…式（５）
（８）各種菌液の調製方法
（大腸菌液の調製）
　オートクレーブ滅菌した３％Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ液体培地（２１１７６８、ＢＤ社製）１ｍＬに大腸菌株１５μＬ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２５９２２）を植菌し、好気性条件下３７℃で１６時間振盪培養する。２０００×ｇで５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去し、１ｍＬの蒸留水を添加してＯＤ（６００ｎｍ）＝１（凡そ１ｅ９ｃｆｕ／ｍＬ）の菌液を得る。得られた大腸菌液を生理食塩水で適宜希釈して使用する。
（黄色ブドウ球菌液の調製）
　オートクレーブ滅菌した３％Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ液体培地（２１１７６８、ＢＤ社製）１ｍＬに黄色ブドウ球菌株１５μＬ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．２５９２３）を植菌し、好気性条件下３７℃で１６時間振盪培養する。２０００×ｇで５分間遠心分離を行い、上澄み液を除去し、１ｍＬの蒸留水を添加してＯＤ（６００ｎｍ）＝１（およそ１ｅ９ｃｆｕ／ｍＬ）の菌液を得る。得られた黄色ブドウ球菌液を生理食塩水で適宜希釈して使用する。
（大腸菌Ｔ１ファージの調製）
　オートクレーブ滅菌した３％Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ液体培地（２１１７６８、ＢＤ社製）１０ｍＬに大腸菌株１５μＬ（ＪＭ１０９　Ｎｏ．２５９２２）を植菌し、好気性条件下３７℃で１６時間振盪培養後、１％Ｐｒｏｔｅｏｓｅ　Ｐｅｐｔｏｎｅ水溶液（ＳＩＧＭＡ、Ｐ０４３１－２５０Ｇ）で希釈した大腸菌Ｔ１ファージ（Ｔ１、ＮＢＲＣ２０００１）を１００μＬ植菌し、さらに７時間培養した。培養液を０．２２μｍフィルターで菌体除去後、限外ろ過で１００ｋＤａ以下の分子量を排除し、二重寒天平板法によりファージプラーク数を計測したところ、３．７ｅ９ｐｆｕ／ｍＬだった。得られた大腸菌Ｔ１ファージ液を生理食塩水で適宜希釈して使用する。
（９）多孔質セルロース微粒子、及び比較対象の粒子の準備
　比較例として準備した比較粒子（丸一）～（丸四）の名称、入手先、物性等を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［多孔質セルロース微粒子（本書中、本発明粒子ともいう。）（イ）の調製］
　精製リンターを原料として調整した５℃における粘度２ポイズ、セルロース濃度２％、銅濃度１．２％、アンモニア濃度４％のセルロース銅安溶液を、二流体ノズルを用いて窒素ガスと共に５００ｍＬ噴霧し、－４０℃に冷却したシリコンオイル（ＳＨ２００、１．５ｃｓ、東レ社）１０Ｌ中に撹拌しながら受けた。シリコンオイルを－２０℃に昇温し２０分間撹拌を続け、－３５℃に冷却した４０％硫酸１０Ｌを投入した。硫酸投入後、８時間撹拌を続け２０℃に昇温し、シリコンオイルを除去して残りを抜き出し水洗し、多孔質セルロース微粒子を得た。分級ふるいを用いて平均粒子径が２００μｍ以上２８０μｍ以下となる粒子サンプルを得た。
　次に、粒子サンプルを６．６６ｇ測り取り、反応液（純水：２６７．７７ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム：０．０１６ｇ、４８％水酸化ナトリウム水溶液：１３．０５ｇ、エピクロロヒドリン：３．８４５ｇ）に投入し、６０℃での恒温槽内で１ｈ攪拌した。吸引ろ過により８０００ｍＬの純水で３回試料を洗浄し、架橋セルロース微粒子を得た。
　得られた架橋セルロース微粒子全量を反応液（純水：２１７．３０ｇ、無水芒硝：８８．８３ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム：０．０１６ｇ、２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩水溶液（５０％）：１１．０８ｇ）に投入し、攪拌した。その後反応開始液（４８％水酸化ナトリウム水溶液：５．３３ｇ、純水：６．８３ｇ）を加え軽く攪拌した後、７０℃での恒温槽内で１ｈ攪拌しながら反応した。１ｈ経過後中和溶液（３６％塩酸：３．１４ｇ、純水：３．１４ｇ）を投入し攪拌し、吸引ろ過により８０００ｍＬの純水で３回試料を洗浄し、本発明粒子を得た。得られた粒子は平均粒子径２４０μｍ、空孔の平均開孔径３０μｍ、平均開孔径３０μｍ以下の貫通孔、乾燥粒子１ｇ当たりの表面積（比表面積）１．１ｍ2／ｇであり、荷電容量は１．８０ｍｍｏｌ／ｇであった。このように調製した多孔質セルロース微粒子を（イ）とする。
［荷電容量の異なる多孔質セルロース微粒子（ロ）～（二）の調製］
　前記と同様の手順で架橋セルロース微粒子を得た後、粒子６．６６ｇを反応液（純水：２１７．３０ｇ、無水芒硝：８８．８３ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム：０．０１６ｇ、２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩水溶液（５０％）：２．３２５ｇ）に投入し、攪拌した。その後反応開始液（４８％水酸化ナトリウム水溶液：１．９３０ｇ、純水：６．８３ｇ）を加え軽く攪拌した後、７０℃での恒温槽内で１ｈ攪拌しながら反応した。１ｈ経過後中和溶液（３６％塩酸：３．１４ｇ、純水：３．１４ｇ）を投入し攪拌し、吸引ろ過により８０００ｍＬの純水で３回試料を洗浄し、荷電容量０．５５ｍｍｏｌ／ｇの粒子を得た。このように調製した多孔質セルロース微粒子を（ロ）とする。
　次に、荷電容量０．５５ｍｍｏｌ／ｇの粒子を再度得た後、粒子６．６６ｇを反応液（純水：２１７．３０ｇ、無水芒硝：８８．８３ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム：０．０１６ｇ、２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩水溶液（５０％）：２．３２５ｇ）に投入し、攪拌した。その後反応開始液（４８％水酸化ナトリウム水溶液：１．９３０ｇ、純水：６．８３ｇ）を加え軽く攪拌した後、７０℃での恒温槽内で１ｈ攪拌しながら反応した。１ｈ経過後中和溶液（３６％塩酸：３．１４ｇ、純水：３．１４ｇ）を投入し攪拌し、吸引ろ過により８０００ｍＬの純水で３回試料を洗浄し、荷電容量１．０４ｍｍｏｌ／ｇの粒子を得た。このように調製した多孔質セルロース微粒子を（ハ）とする。
　さらに、荷電容量１．８０ｍｍｏｌ／ｇの粒子を再度得た後、粒子６．６６ｇを反応液（純水：２１７．３０ｇ、無水芒硝：８８．８３ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム：０．０１６ｇ、２－（ジエチルアミノ）エチルクロリド塩酸塩水溶液（５０％）：１１．０８ｇ）に投入し、攪拌した。その後反応開始液（４８％水酸化ナトリウム水溶液：５．３３ｇ、純水：６．８３ｇ）を加え軽く攪拌した後、７０℃での恒温槽内で１ｈ攪拌しながら反応した。１ｈ経過後中和溶液（３６％塩酸：３．１４ｇ、純水：３．１４ｇ）を投入し攪拌し、吸引ろ過により８０００ｍＬの純水で３回試料を洗浄し、荷電容量２．６０ｍｍｏｌ／ｇの粒子を得た。このように調製した多孔質セルロース微粒子を（二）とする。
　以上より、荷電容量の異なる４つの多孔質セルロース微粒子を得た。
［実施例１：膨潤体積当たりの乾燥粒子重量の測定］
　本発明粒子（イ）、及び比較粒子（丸一）～（丸四）について膨潤体積（ｍＬ）当たりの乾燥粒子重量（ｍｇ）を測定した。結果を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明粒子は、比較粒子と比べて膨潤体積当たりの乾燥粒子重量が最も小さく、少ない重量でも著しく水分を吸収し膨潤した。膨潤時の空孔の平均開孔径が類似する比較粒子（丸一）と比べても、顕著な差が見られることから架橋セルロース素材、及び構造体の特徴が寄与していると考えらえる。
［実施例２：許容含水量Ｃ、遊離水分比率Ｆの測定］
　多孔性粒子への液体又は気体の透過しやすさを測定するため、本発明粒子（イ）～（二）、及び比較粒子（丸一）～（丸四）についての許容含水量Ｃ、及び遊離水分比率Ｆを測定した。結果を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　許容含水量の比較より、本発明粒子は、比較粒子（丸一）～（丸四）に比べてエンプティカラムに充填したとき、著しく多い水分を保持することが分かる。他方、１０００Ｇ、１分間のゆるやかな遠心力によって容易に水分が粒子から遊離し、気体に置換される結果、遊離水分比率が著しく高い物理的性質を有することが分かった。つまり、本発明粒子は高い空隙率により液体又は気体を著しく透過しやすい粒子であることが分かった。
［実施例３：ボルテックス法による大腸菌の吸着性能の測定]
　実施例１で求めた膨潤体積当たりの乾燥粒子重量をもとに、以下の表４に示すように膨潤粒子体積が一律となるよう本発明粒子（イ）、及び比較粒子（丸一）～（丸四）を測りとった（湿潤状態や懸濁状態の粒子は水分含有率で除した重量を測りとる）。各粒子にＰＢＳ（－）１０ｍＬを添加し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。１０００Ｇで１分間、遠心分離を行い、上澄み液をアスピレーターで吸引除去し、滅菌ＰＢＳ（－）１０ｍＬを添加した。こうして粒子の洗浄及び電荷の平衡化を２回行った後、最終液量が４ｍＬとなるようメスアップした。このように調製した本発明粒子（イ）、及び比較粒子（丸一）～（丸四）の懸濁液を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　このように調製した均一に分散した粒子懸濁液０．２ｍＬ（膨潤粒子体積０．０５６ｍＬに相当）を２ｍＬ滅菌サンプリングチューブに測りとり、前記（８）で調製した大腸菌液を１ｅ４又は１ｅ６倍に希釈した試料を０．８ｍＬ添加後、ＴＵＢＥ ＭＩＸＥＲ（偏芯振動方式　ＭＴ－３６０　ＴＯＭＹ製）の最大強さで３０秒間又は２分間ボルテックスした。４００Ｇで１分間遠心分離し、上澄み液を平板塗抹培養に適する濃度の希釈率Ｋ（倍）まで生理食塩水で希釈後、標準寒天培地（８－ＭＲ２２　ポアメディア社製）に１００μＬ接種した。３５℃で４８時間培養し、コロニー数Ｌ（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定した。また、粒子懸濁液の代わりに生理食塩水０．２ｍＬを用い、上記と同一操作を行い、コロニー数Ｍ（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定した。乾燥粒子重量当たりの大腸菌の吸着量、及び吸着率を、下記式（５）と（６）より、それぞれ、算出した。なお、下式の乾燥粒子重量は表４記載の数値を用いる。
　　　乾燥粒子重量当たりの吸着量Ｎ（個／ｍｇ）＝Ｋ×（Ｍ－Ｌ）／（乾燥粒子重量／２０）…式（５）
　　　吸着率（％）＝（Ｍ－Ｌ）／Ｍ×１００…式（６）
　結果を以下の表５に示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明粒子（イ）は、比較粒子（丸一）～（丸四）と比べて、幅広い大腸菌の濃度範囲（１ｅ３～１ｅ５ｃｆｕ／ｍＬ）において高い吸着率を維持した。高い吸着容量を得るためには粒子内部まで大腸菌を吸着させる必要があり、そのために粒子は十分に大きな空孔の開孔径が必要となるが、膨潤時の空孔の平均開孔径が類似する比較粒子（丸一）と比べても、本発明粒子（イ）は著しく高い吸着率であることから、本発明粒子（イ）が、空孔の開孔径だけでなく、高い空隙率から得られる高い透過性により、従来粒子では成し得えない高効率な大腸菌の吸着を実現していることが分かった。
　また、ボルテックス２分において吸着率７０％以上である比較粒子（丸三）と（丸四）が、３０秒では吸着率が著しく低下する一方、本発明粒子（イ）は３０秒でも変わらない性能を発揮しており、上記の構造的特徴が迅速な吸着にも寄与することが分かった。
　図４に、大腸菌吸着後の多孔質セルロース微粒子のＳＥＭ画像の一例を示す。
　また、本発明粒子（イ）は高い空隙率を持つにもかかわらず、膨潤粒子体積を一律として比較粒子（丸一）～（丸四）と比べても高効率な吸着性能を発揮することから、乾燥粒子重量当たりの吸着量Ｎ（個／ｍｇ）が著しく大きい微生物の高密度体を得ることができる。
［実施例４：カラム法による大腸菌の吸着性能の測定］
　実施例３で調製した均一に分散した粒子懸濁液０．２ｍＬをエンプティカラム（Ｐｒｅｓｈ－ＳＰＥ（登録商標）　アスティ社製）に充填し、余分なＰＢＳ（－）を出口から吸引除去することで粒子が充填されたカラムを作製した。前記（８）で調製した大腸菌液を１ｅ３倍に希釈した試料（以下、１ｅ３倍希釈した大腸菌液、または大腸菌試料という。）１０ｍＬを、ディスポシリンジを用いて１００μＬ／秒で上記カラムに通液し、カラムを通過した液（以下、フロースルーという。）を回収した。次いで生理食塩水１ｍＬをカラムに通液して大腸菌吸着カラムを洗浄し、さらに１０ｍＬの空気を通気して遊離水分を除去した。上述の大腸菌試料、及びフロースルーは平板塗抹培養に適する濃度の希釈率まで生理食塩水で希釈後、標準寒天培地（８－ＭＲ２２　ポアメディア社製）に１００μＬ接種し、３５℃で４８時間培養し、コロニー数を測定した。乾燥粒子重量当たりの大腸菌の吸着量Ｔ、及び吸着率Ｓを、下記式（７）と（８）より、それぞれ、算出した。なお、下式の乾燥粒子重量は表４記載の数値を用いる。

　　　大腸菌試料：菌濃度Ｏ（ｃｆｕ／ｍＬ）＝接種したコロニー数（ｃｆｕ／ｍＬ）×希釈率Ｑ
　　　フロースルー：菌濃度Ｐ（ｃｆｕ／ｍＬ）＝接種したコロニー数（ｃｆｕ／ｍＬ）×希釈率Ｒ
　　　乾燥粒子重量当たりの吸着量Ｓ（個／ｍｇ）＝（Ｏ－Ｐ）×１０（ｍＬ）／（乾燥粒子重量／２０）…式（７）
　　　吸着率Ｔ（％）＝（Ｏ－Ｐ）／Ｏ×１００…式（８）
　結果を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　カラム法においても本発明粒子（イ）は、比較粒子（丸一）～（丸四）と比べて高い吸着率Ｔを得ており、ボルテックス法（すなわち均一分散による粒子と微生物の接触方法）、カラム法（すなわち固相分離による粒子と微生物の接触方法）にかかわらず高い吸着性能を発揮きることが分かった。また、カラム法では大腸菌吸着後に、粒子を洗浄できること、また通気を行い粒子に残される遊離水分を容易に除去できることが確認できた。
［実施例５：カラム法による大腸菌以外の微生物の吸着性能の測定］
　実施例３と実施例４と同じ手順で、前記（８）で調製した大腸菌、黄色ブドウ球菌、及びウィルスとして大腸菌Ｔ１ファージについて、乾燥粒子重量当あたりの該微生物の吸着量Ｓ、及び吸着率Ｔをそれぞれ、算出した。但し、大腸菌Ｔ１ファージの計測は、希釈後液１０μＬを、１ｅ９ｃｆｕ／ｍＬのＪＭ１０９大腸菌３０μＬ及び軟寒天５ｍＬと混和後、標準寒天培地上で固化し、３５℃で２４時間培養したプラーク数を測定した。また、大腸菌Ｔ１ファージの吸着率Ｔ及び乾燥微粒子重量当たりの吸着量Ｓは、ｃｆｕ／ｍＬをｐｆｕ／ｍＬと読み替えて計算した。結果を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示す結果から、本発明粒子（イ）は、グラム陰性菌である大腸菌、また、グラム陽性菌である黄色ブドウを菌種に依らず高い効率で吸着できることが分かった。さらに微生物として細菌だけでなくウィルスにも同様に吸着能力を発揮することが示された。
［実施例６：カラム法より得られた大腸菌吸着粒子（微生物の高密度体）から菌を回収し、大腸菌の濃縮物を得る方法］
　実施例４で最終的に得た遊離水分を除いた大腸菌吸着カラムに、溶離液として１Ｍ塩化マグネシウム１ｍＬを通液し、溶離液のフロースルーを回収した。フロースルーは平板塗抹培養に適する濃度の希釈率Ｖまで生理食塩水で希釈後、標準寒天培地（８－ＭＲ２２　ポアメディア社製）に１００μＬ接種し、３５℃で４８時間培養し、コロニー数を測定した。大腸菌の濃縮倍率Ｗは下記式（９）により算出した。
　　　溶離液のフロースルー：菌濃度Ｕ（ｃｆｕ／ｍＬ）＝接種したコロニー数（ｃｆｕ／ｍＬ）×希釈率Ｖ
　　　濃縮倍率Ｗ（倍）＝溶離液のフロースルーの菌濃度Ｕ／大腸菌試料の菌濃度Ｏ…式（９）
　結果を以下の表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明粒子（イ）は、１以上の濃縮倍率が得られており、溶離液の通液によって菌を濃縮できることが示された。
［実施例７：荷電容量の異なる本発明粒子（イ）～（二）の吸着率Ｔ（％）と濃縮倍率Ｗ（倍）の測定］
　
　実施例４と実施例５と同じ手順で、荷電容量の異なる４つの本発明粒子（イ）～（二）について吸着率Ｔ（％）と濃縮倍率Ｗ（倍）を測定した結果を以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９に示す結果から、多孔質セルロース微粒子の荷電容量は０．５５～２．６ｍｍｏｌ／ｇにおいて５０％以上の吸着率を得られることが分かった。また、濃縮倍率Ｗは溶離液が１Ｍ塩化マウネシウムであるとき、荷電容量１．０４～２．６ｍｍｏｌのときが、より好ましいことが分かった。
［実施例８：異なる大腸菌試料の菌濃度、通液量及び溶離液量による本発明粒子（イ）の吸着率Ｔ（％）と濃縮倍率Ｗ（倍）の測定］
　実施例４と実施例５と同じ手順で、本発明粒子（イ）の粒子懸濁液０．２ｍＬ（乾燥粒子重量で２ｍｇ）を充填したカラムを用いて、異なる大腸菌試料の菌濃度Ｏ、通液量及び溶離液量による吸着率Ｔ（％）と濃縮倍率Ｗ（倍）を測定した結果を以下の表１０に示す。なお、表１０の溶離液量とは溶離液として１Ｍ塩化マグネシウムを通液した量（ｍＬ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示す結果から、本発明粒子（イ）の粒子懸濁液０．２ｍＬ（乾燥粒子重量で２ｍｇ、膨潤粒子体積で０．０５６ｍＬに相当）を充填したカラムは、大腸菌試料の通液量１０～１０００ｍLを通液でき、また、溶離液量０．１～１ｍＬで回収でき、この範囲において実施例４と実施例５と同様の高い吸着率Ｔと濃縮倍率Ｗを維持できることが分かった。また、本カラムは、大腸菌試料の菌濃度Ｏが１ｅ８ｃｆｕ／ｍＬまで吸着でき、特に、１ｅ１～１ｅ７ｃｆｕ／ｍＬの濃度で高い吸着率Ｔが得られた。
　本発明に係る濃縮方法及び濃縮容器では、許容含水量及び遊離水分比率で指標される空隙率及び脱水率が高い特定の多孔質セルロース微粒子を用いて微生物を濃縮することができるため、粒子乾燥重量当たり微生物の吸着量が高く、微生物の高密度体を得ることができ、また、得られた微生物の高密度体から高濃度の微生物を回収することもできる。それゆえ、本発明に係る濃縮方法及び濃縮容器は、微生物検査等において好適に利用可能である。

Claims (27)

  1. 　溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法であって、以下の工程：
    　該試料液体を該多孔質セルロース微粒子に接触させて、該試料液体中に含有される微生物を、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着させる工程；及び
    　該試料液体の溶媒を除去して、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物を濃縮する抜液工程；
    を含み、該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上である、微生物の濃縮方法。
  2. 　以下の工程：
    　前記抜液工程後に、溶離液を用いて多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に濃縮された微生物を、該溶離液中に回収する工程；
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記各工程間に、液体又は気体で、多孔質セルロース微粒子を洗浄する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記多孔質セルロース微粒子の平均粒子径は１００μｍ以上１０００μｍ以下である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記多孔質セルロース微粒子の空孔の平均開孔径が１μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記多孔質セルロース微粒子は、隣接した空孔間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成している、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　前記多孔質セルロース微粒子の乾燥粒子１ｇ当たりの表面積（比表面積）が、０．３ｍ2／ｇ以上４．４ｍ2／ｇ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 　前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、カチオン性官能基を有し、かつ、荷電容量が、０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上５．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　前記カチオン性官能基が、第一級アミノ基、第二級アミノ基、及び第三級アミノ基からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項８に記載の方法
  10. 　前記カチオン性官能基が、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基である、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、分子間架橋されている、請求項１又は２に記載の方法。
  12. 　前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、銅アンモニア再生セルロースからなる、請求項１又は２に記載の方法。
  13. 　前記微生物は、細菌又はウイルスである、請求項１又は２に記載の方法。
  14. 　溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法に用いるための濃縮容器であって、
    　該濃縮容器は、
    　入口開口と出口開口を有する筒状本体；
    　該出口開口側に設けたフィルター；及び
    　該フィルター上の空間に充填された多孔質セルロース微粒子；
    を備え、ここで、
    　該入口開口側から供給された該試料液体は、該多孔質セルロース微粒子に接触し、該試料液体中に含有される微生物は、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着されながら、該試料液体の溶媒は、該出口開口側から除去されて、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物が濃縮され、かつ、
    　該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上であることを特徴とする、濃縮容器。
  15. 　前記多孔質セルロース微粒子の平均粒子径は１００μｍ以上１０００μｍ以下である、請求項１４に記載の濃縮容器。
  16. 　前記多孔質セルロース微粒子の空孔の平均開孔径が１μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  17. 　前記多孔質セルロース微粒子は、隣接した空孔間を隔てる膜の開口部により互いに連通した連続孔構造を形成していることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  18. 　前記多孔質セルロース微粒子の乾燥粒子１ｇ当たりの表面積（比表面積）が、０．３ｍ2／ｇ以上４．４ｍ2／ｇ以下である、請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  19. 　前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、カチオン性官能基を有し、かつ、荷電容量が、０．５ｍｍｏｌ／ｇ以上５．０ｍｍｏｌ／ｇ以下である、請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  20. 　前記カチオン性官能基が、第一級アミノ基、第二級アミノ基、及び第三級アミノ基からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１９に記載の濃縮容器。
  21. 　前記カチオン性官能基が、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基である、請求項２０に記載の濃縮容器。
  22. 　前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、分子間架橋されている、請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  23. 　前記多孔質セルロース微粒子を構成するセルロースは、銅アンモニア再生セルロースからなる、請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  24. 　前記微生物は、細菌又はウイルスである、請求項１４又は１５に記載の濃縮容器。
  25. 　溶媒中に微生物を含有する試料液体中の該微生物を、その内部に多数の空孔を有する多孔質セルロース微粒子を用いて濃縮する方法であって、以下の工程：
    　入口開口と出口開口を有する筒状本体；該出口開口側に設けたフィルター；及び該フィルター上の空間に充填された多孔質セルロース微粒子；を備えた濃縮容器中で、該試料液体を該多孔質セルロース微粒子に接触させて、該試料液体中に含有される微生物を、該多孔質セルロース微粒子の表面に吸着させる工程；及び
    　通気を行い、該試料液体の溶媒を除去して、該多孔質セルロース微粒子の表面及び／又は空孔内に該微生物を濃縮する抜液工程；
    を含み、該多孔質セルロース微粒子は、乾燥粒子１００ｍｇをＰＢＳ（－）で膨潤させ、自重でＰＢＳ（－）が落ちなくなった膨潤状態での該多孔質セルロース微粒子のＰＢＳ（－）の質量である許容含水量Ｃが１．９ｇ以上であり、かつ、該許容含水量Ｃから、該膨潤状態での多孔質セルロース微粒子を１０００Ｇで１分間、遠心した後のＰＢＳ（－）の質量Ｅを、減じて得た脱水量（Ｃ－Ｅ）を、Ｅで除した遊離水分比率（（Ｃ－Ｅ）／Ｅ）が２．９以上である、微生物の濃縮方法。
  26. 　前記通気は、前記濃縮容器入口開口部からシリンジにより、空気を通気するものである、請求項２５に記載の微生物の濃縮方法。
  27. 　前記空気の体積は前記多孔質セルロール微粒子１ｍｇあたり、０．５ｍＬ以上１ｍＬ以下である、請求項２６に記載の微生物の濃縮方法。
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