TW202331257A - 微生物之濃縮方法及濃縮容器 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種能夠以簡便方法迅速獲得細菌等之高濃縮物之濃縮方法及容器。本發明係關於一種微生物之濃縮方法及容器,該微生物之濃縮方法係使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之微生物進行濃縮之方法,包括如下步驟:使試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸而使微生物吸附於多孔質纖維素微粒子之表面之步驟;以及將試樣液體之溶劑去除而使該微生物濃縮於多孔質纖維素微粒子之孔隙內之排液步驟;以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,自該容許含水量C減去使膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率為2.9以上。
Description
本發明係關於一種使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有例如細菌、病毒之微生物的試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法;以及該濃縮方法中所用之濃縮容器。
於傳染病診斷、或環境檢查、食品微生物檢查中,要求以迅速且簡便之方法自試樣中檢測、鑑定病原體或有損品質之有害微生物、及/或對其進行計數。
例如,於傳染病診斷中,為了使醫生或護士於受檢者身邊早期進行適當之臨床判斷,而利用POCT(簡易迅速檢查)進行病原菌或病毒之鑑定。又,於環境檢查或食品微生物檢查中,作為從業人員或環境之衛生管理、原料、半成品、最終製品之品質管理,而進行以一般細菌或大腸桿菌群等環境指標菌、或者食物中毒菌、病毒等有害微生物作為對象之檢查。均越為小規模事務、或越在現場,則越需要無需特殊機器、或微生物學知識之簡易操作方法。
該微生物之檢查方法可大致分為:培養法,其經由分離培養,基於其生物化學性狀,進行該微生物之鑑定;基因法,其基於對該微生物具有特異性之基因,藉由PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈反應)法或LAMP(loop-mediated isothermal amplification,環介導等溫擴增)法等進行擴增檢測;免疫法,其利用該微生物特有之抗原標記物與抗體之特異性反應來進行檢測。
任一檢查法所利用之試樣均較少,為0.01~1 mL左右,故僅可利用可自患者檢體(例如尿或體液)或食品試樣(例如液狀試樣或利用Stomachere所得之細菌或病毒提取液)、或環境試樣(例如水質)採取到之含量為0.01~1 L左右之檢測物質(菌或病毒本身、或其表面或內在成分)之極少一部分。這一情況導致例如用作簡易迅速檢查之基因法或免疫法之檢測精度或感度受到限制。
又,於微生物為微量之情形時,為了避免取樣中之無效情況,而進行長時間(例如24小時)之增菌培養,從而損及檢查之簡便性或迅速性。
作為解決該問題且於不使用大型裝置之情況下確保充分之檢測物質的方法,藉由基於吸附載體之微生物之吸附、分離、回收,而進行濃縮。
例如,於以下之專利文獻1中,藉由將無機微小粒子(非晶質金屬矽酸鹽)及試樣振盪1~20分鐘來吸附大腸桿菌。然而,專利文獻1所記載之粒子並非交聯纖維素粒子,為了獲得50%以上之吸附率,需進行10分鐘以上之振盪,又,對於1e3 cfu/mL(以下,1eM表示10之M次方)之大腸桿菌試樣10 mL,竟使用有10 mg之無機微小粒子。又,於專利文獻1中,並無乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等之相關記載。
以下之專利文獻2中記載有一種方法,其為了進行乳房炎之細菌性疾病檢查,而使病因細菌與細胞混合存在之檢體與胺基二氧化矽接觸,從而僅回收病因細菌。然而,專利文獻2所記載之粒子並非交聯纖維素粒子,胺基二氧化矽及試樣之攪拌需耗時1小時。又,其目的在於與細胞分離而非病因細菌之濃縮,更無乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等之相關記載。
另一方面,以下之專利文獻3記載有一種具有平均孔徑20~500 nm之連續微細氣孔及平均孔徑1~50 μm之連續小氣孔這2種連續氣孔結構之磷酸鈣系多孔質顆粒,其為病毒及細胞之吸附分離劑。然而,專利文獻3所記載之粒子並非交聯纖維素粒子,並無乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等之相關記載。
以下之專利文獻4中記載有一種病毒濃縮方法,其包括如下步驟:向可能含有病毒之試樣中添加於粒子表面具有陽離子性基且粒徑為0.5~300 μm之粒子、及針對靶向病毒之表面抗原之抗體,使病毒附著於上述粒子之步驟;以及自試樣分離並收集附著有病毒之上述粒子之步驟。據載,藉由該病毒濃縮方法,能夠以簡便之方法,同時地簡便處理大量檢體,亦容易應對自動化,能夠提供不會對核酸擴增檢查造成不良影響之病毒濃縮。然而,所記載之粒子係使各種單體聚合而獲得之非多孔質之合成聚合物,無應用於細菌濃縮方法之相關記載,更無乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等之相關記載。
以下之專利文獻5中記載有使含病毒之試樣與吸附劑接觸而自上述含病毒之試樣中去除病毒之方法,上述吸附劑具有聚伸乙基亞胺與包含多孔性粒子之基礎載體結合之結構。作為基礎載體,例舉了具有特定配體之交聯纖維素粒子,但無應用於細菌濃縮方法之相關記載,更無乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等之相關記載。
以下之專利文獻6中記載了產業上可利用經聚陽離子修飾之多孔質纖維素微粒子作為菌體、酵母、動植物細胞培養用之微載體,但以附著及增殖為前提,且並無去除溶劑或使微生物濃縮於孔隙內之排液步驟之相關記載,更無乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等之相關記載。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第5972174號公報
[專利文獻2]日本專利第4889263號公報
[專利文獻3]日本專利第2543766號公報
[專利文獻4]日本專利第4161167號公報
[專利文獻5]日本專利特開2019-194547號公報
[專利文獻6]日本專利特開平4-91142號公報
[發明所欲解決之問題]
專利文獻1、2、3、4中雖記載了細胞或病毒之吸附劑,但其材質係非多孔質之合成聚合物、多孔質之非晶質金屬矽酸鹽、多孔質磷酸鈣等,並非以下所說明之具有乾燥粒子之每一定質量之容許含水量、空隙比等特性之空隙比及透過率較高之纖維素微粒子,因此難以獲得微生物之高密度體。
又,專利文獻5中記載有一種結合有聚伸乙基亞胺之交聯纖維素粒子作為吸附劑,但該吸附劑結合有上述特定之聚伸乙基亞胺作為配體,且專用於病毒之吸附去除。
進而,專利文獻1、2、4、5中雖記載了用以使微生物試樣與吸附劑接觸之條件,但為了使10 mL之檢體試樣充分吸附於吸附劑,至少需要攪拌、振盪10分鐘,不可謂簡易操作方法。
鑒於上述先前技術之現狀,本發明所欲解決之問題係提供一種能夠以簡便方法迅速獲得微生物之高濃縮物的微生物之濃縮方法、及用於該濃縮方法之濃縮容器。
[解決問題之技術手段]
本發明人等為了解決該課題而銳意研究、不斷試驗,結果意外發現關於作為吸附劑之多孔質纖維素微粒子,以Phosphate-buffered saline(磷酸鹽緩衝液)(-)(以下亦稱為PBS(-))使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上時,可解決上述課題,從而完成了本發明。
即,本發明如下所述。
[1]一種微生物之濃縮方法,其係使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,且包括以下步驟:
使該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,而使該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面之步驟;以及
將該試樣液體之溶劑去除,而使該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之排液步驟;
關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
[2]如上述[1]所記載之方法,其進而包括以下步驟:
於上述排液步驟後,使用溶離液,將濃縮於多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之微生物回收至該溶離液中之步驟。
[3]如上述[1]或[2]所記載之方法,其進而包括於上述各步驟間,藉由液體或氣體洗淨多孔質纖維素微粒子之步驟。
[4]如上述[1]至[3]中任一項所記載之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子之平均粒徑為100 μm以上1000 μm以下。
[5]如上述[1]至[4]中任一項所記載之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子之孔隙之平均開孔徑為1 μm以上100 μm以下。
[6]如上述[1]至[5]中任一項所記載之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子形成有藉由將相鄰之孔隙間隔開之膜之開口部而彼此連通的連續孔結構。
[7]如上述[1]至[6]中任一項所記載之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子之乾燥粒子每1 g之表面積(比表面積)為0.3 m
2/g以上4.4 m
2/g以下。
[8]如上述[1]至[7]中任一項所記載之方法,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素具有陽離子性官能基,且荷電容量為0.5 mmol/g以上5.0 mmol/g以下。
[9]如上述[8]所記載之方法,其中上述陽離子性官能基係選自由一級胺基、二級胺基、及三級胺基所組成之群中之至少一種。
[10]如上述[9]所記載之方法,其中上述陽離子性官能基係N,N-二乙基胺基乙基(DEAE)。
[11]如上述[1]至[10]中任一項所記載之方法,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素經分子間交聯。
[12]如上述[1]至[11]中任一項所記載之方法,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素包含銅氨再生纖維素。
[13]如上述[1]至[12]中任一項所記載之方法,其中上述微生物係細菌或病毒。
[14]一種濃縮容器,其特徵在於:其用於使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,
該濃縮容器具備:
具有入口開口及出口開口之筒狀本體;
設置於該出口開口側之過濾器;以及
填充於該過濾器上之空間之多孔質纖維素微粒子;
此處,
自該入口開口側供給之該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面,並且該試樣液體之溶劑自該出口開口側去除,該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之孔隙內,且
關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
[15]如上述[14]所記載之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子之平均粒徑為100 μm以上1000 μm以下。
[16]如上述[14]或[15]所記載之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子之孔隙之平均開孔徑為1 μm以上100 μm以下。
[17]如上述[14]至[16]中任一項所記載之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子形成有藉由將相鄰之孔隙間隔開之膜之開口部而彼此連通的連續孔結構。
[18]如上述[14]至[17]中任一項所記載之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子之乾燥粒子每1 g之表面積(比表面積)為0.3 m
2/g以上4.4 m
2/g以下。
[19]如上述[14]至[18]中任一項所記載之濃縮容器,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素具有陽離子性官能基,且荷電容量為0.5 mmol/g以上5.0 mmol/g以下。
[20]如上述[19]所記載之濃縮容器,其中上述陽離子性官能基係選自由一級胺基、二級胺基、及三級胺基所組成之群中之至少一種。
[21]如上述[20]所記載之方法,其中上述陽離子性官能基係N,N-二乙基胺基乙基(DEAE)。
[22]如上述[14]至[21]中任一項所記載之濃縮容器,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素經分子間交聯。
[23]如上述[14]至[22]中任一項所記載之濃縮容器,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素包含銅氨再生纖維素。
[24]如上述[14]至[23]中任一項所記載之濃縮容器,其中上述微生物係細菌或病毒。
[25]一種微生物之濃縮方法,其係使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,且包括以下步驟:
於具備具有入口開口及出口開口之筒狀本體、設置於該出口開口側之過濾器、及填充於該過濾器上之空間之多孔質纖維素微粒子的濃縮容器中,使該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,而使該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面之步驟;以及
進行通氣,將該試樣液體之溶劑去除,而使該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之排液步驟;
關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
[26]如上述[25]所記載之微生物之濃縮方法,其中上述通氣係利用注射器自上述濃縮容器入口開口部通入空氣。
[27]如上述[26]所記載之微生物之濃縮方法,其中上述空氣之體積係相對於上述多孔質纖維素微粒子每1 mg為0.5 mL以上1 mL以下。
[發明之效果]
於本發明之濃縮方法及濃縮容器中,可使用以容許含水量及游離水分比率為指標之空隙比及脫水率較高之特定之多孔質纖維素微粒子來對微生物進行濃縮,因此粒子每單位乾燥重量之微生物之吸附量較高,可獲得微生物之高密度體,又,亦可自所獲得之微生物之高密度體回收高濃度之微生物。因此,本發明之濃縮方法及濃縮容器適宜用於微生物檢查等中。
以下,詳細地對本發明之實施方式進行說明。
本發明之第一實施方式係一種微生物之濃縮方法,其係使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,且包括以下步驟:
使該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,而使該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面之步驟;以及
將該試樣液體之溶劑去除,而使該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之排液步驟;
關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
[容許含水量(g)、游離水分比率]
將「容許含水量」、「游離水分比率」之概念圖、及求出方法之說明圖示於圖2中。
容許含水量係以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的粒子之PBS(-)之質量,係表示粒子吸收多少液體之絕對指標。該值越大,粒子越能藉由膨潤而於內部形成空隙,因此容許含水量高意味著膨潤時之孔隙之尺寸大及空隙比高。又,一般而言,已知空隙比越高,多孔質中之水越容易透過,容許含水量高意味著水之透過率高。若孔隙尺寸大,則可將微生物吸附至孔隙內部之表面,若水之透過性高,則微生物容易滲透至孔隙內部。又,於回收微生物時,亦容易使微生物溶離(脫離)。容許含水量越高越佳,較佳為1.9 g以上,更佳為2.1 g以上,進而較佳為2.4 g以上,最佳為2.6 g以上。如圖1所示,可知本實施方式中所用之多孔質纖維素微粒子(表示為交聯纖維素)相較於其他濃縮用載體,於膨潤時在微粒子內部具有大量孔隙,係空隙比較高者。
游離水分比率係自上述膨潤狀態下的容許含水量C開始,實施1000 G之離心力1分鐘時,殘留於粒子中之PBS(-)之質量(E:結合水分量)與自粒子中去除之PBS(-)之質量(C-E:游離水分量)的比率((C-E)/E),係表示膨潤粒子脫去多少液體之相對指標。該值越大,意味著粒子之游離水分量相較於結合水分量越多,即相對脫水量越多。若脫水量較多,則可排除多餘之水分,因此可獲得微生物之高密度體(粒子每單位重量之高吸附微生物數(個/mg))。游離水分比率越高越佳,較佳為2.9以上,更佳為5.7以上,進而較佳為6.4以上,最佳為7.1以上。
排液步驟中之所含水分之去除可利用公知之方法。例如可例舉:減壓乾燥、離心分離、藉由通入空氣等進行之置換、利用吸水體進行之去除等,但並不僅限於此,可根據用途進行適當選擇。例如,於對去除所含水分之力進行控制之情形時,較佳為離心分離,於不使用特殊機器而以簡易操作去除所含水分之情形時,較佳為藉由注射器等通入空氣等而進行置換之方法。於一實施方式之例中,1000 G下之1分鐘之離心分離相當於通入1~2 mL之空氣。
構成本實施方式之多孔質纖維素微粒子之纖維素之種類並無特別限制,可例舉:銅氨再生纖維素、黏膠再生纖維素、棉、紙漿、高濕模量黏膠纖維等公知之纖維素,較佳為銅氨再生纖維素、黏膠再生纖維素,更佳為銅氨再生纖維素。銅氨再生纖維素由於結晶度較低,故進行各種官能基修飾時,反應性較高,即便為多孔粒子,亦可均勻地修飾至粒子內部,且粒子之形態穩定性亦優異。
[平均粒徑(μm)]
本實施方式之多孔質纖維素微粒子之平均粒徑較佳為100 μm以上1000 μm以下,更佳為100 μm以上500 μm以下,進而較佳為200 μm以上400 μm以下,進而更佳為200 μm以上280 μm以下。若平均粒徑小於100 μm,則需減小用以保持多孔質纖維素微粒子之濃縮容器之入口開口側及出口開口側之過濾器之網眼,於供給含有微生物之試樣液體時或去除該試樣液體之溶劑時,壓力損失增大,操作性降低,或對處理液量產生制約。另一方面,若平均粒徑大於1000 μm,則粒子所受阻力增大,粒子間隙之流動優先於粒子內部之流動,結果存在透水性變得不均勻(或降低)之情況。本說明書中之平均粒徑係指以水或生理鹽水使多孔粒子膨潤後,去除多餘之水,藉由光學顯微鏡,設定為適當之倍率,對20個粒子以上進行測定所得之平均粒徑。
[孔隙之平均開孔徑(μm)]
關於本實施方式之多孔質纖維素微粒子之孔隙之大小,平均開孔徑較佳為1 μm以上100 μm以下,更佳為10 μm以上80 μm以下,進而較佳為10 μm以上50 μm以下。於平均開孔徑小於1 μm時,存在多孔質纖維素微粒子中含有微生物之試樣液體無法實現自由移動之情況。又,一般而言,病毒之粒徑大約為0.02 μm,細菌之粒徑大約為1 μm~5 μm,於病毒之情形時,由於粒徑極小,故細孔內之移動(位移)以布朗運動為主導,另一方面,於細菌之情形時,其粒徑成為主導,故任一微生物均於多孔質纖維素微粒子之平均開孔徑小於1 μm時,存在向粒子內部之吸附明顯受限之情況。另一方面,若平均開孔徑大於100 μm,則無法確保足以吸附微生物之表面積,故存在無法高效率地對微生物進行濃縮之情況。本說明書中之平均開孔徑係指以水或生理鹽水使多孔粒子膨潤後,去除多餘之水,藉由電子顯微鏡,設定為適當之倍率,對20個粒子以上測定膜間之距離所得之平均開孔徑。又,關於各孔隙之開孔徑,於粒子非真球或真圓之情形時,以最短直徑進行定義。
本實施方式之多孔質纖維素微粒子較佳為形成有藉由將孔隙間隔開之膜之開口部而彼此連通的連續孔結構。若為彼此連通之結構,則可將微生物高效率地吸附至多孔質纖維素微粒子之內部,進而可擴大用以吸附微生物之表面積。
[比表面積(m
2/g)]
本實施方式之多孔質纖維素微粒子之乾燥時之表面積(比表面積)較佳為0.3 m
2/g以上4.4 m
2/g以下,更佳為0.6 m
2/g以上3.3 m
2/g以下,進而較佳為0.8 m
2/g以上1.7 m
2/g以下。若表面積小於0.3 m
2/g,則供微生物吸附之表面較少,存在無法高效率地對微生物進行濃縮之情況。另一方面,若乾燥時之表面積為4.4 m
2/g以上,則存在每單位面積之荷電變低而微生物之附著率降低之情況。本說明書中之表面積係指藉由BET(brunauer-emmett-teller,布厄特)法測得之表面積。
[荷電容量(mmol/g)]
關於本實施方式之多孔質纖維素微粒子之荷電容量,不同於聚苯乙烯、明膠等粒子,亦需考慮作為基材之纖維素中所含之羥基之影響。又,相較於葡聚糖粒子等多糖類粒子,分子內之氫鍵或結晶度亦大有不同,故需納入考量。本實施方式之多孔粒子之荷電容量較佳為0.5 mmol/g以上5.0 mmol/g以下,更佳為0.5 mmol/g以上3.0 mmol/g以下,進而較佳為0.6 mmol/g以上3.0 mmol/g以下,進而更佳為0.6 mmol/g以上2.5 mmol/g以下,特佳為0.7 mmol/g以上2.5 mmol/g以下,進而特佳為0.9 mmol/g以上2.0 mmol/g以下。若荷電容量處於上述範圍內,則結合細孔之表面積處於特定範圍內之情況,每單位表面積之荷電變多,而可提昇微生物之附著率。又,於藉由溶離液回收微生物時,可不受到荷電之妨礙地回收微生物。本說明書中,所謂荷電容量,係指對於多孔粒子中之胺,使用鹽酸使其吸附氯後,藉由硫酸鈉溶液沖洗所吸附之氯,針對所得之溶液,以鉻酸鉀作為指示劑,進行硝酸銀滴定,對3個樣品以上進行測定所得之平均荷電容量。
構成本實施方式之多孔質纖維素微粒子之陽離子性取代基並無特別限制,較佳為選自由一級胺基、二級胺基、及三級胺基所組成之群中之至少一種,更佳為三級胺基,進而較佳為二乙基胺基乙基。
本實施方式之多孔質纖維素微粒子可藉由如下方法加以製造,即,使溶解有纖維素之溶液成形為所需之形狀,並且冷卻至溶液之固化溫度以下而使其冷凍,繼而提取去除溶劑或使其失去溶解能力。一般而言,冷凍溫度較佳為不設定為較溶劑等之冷凍溫度低40℃以上,通常選定為較冷凍溫度低0~20℃之範圍。
又,關於經冷凍之纖維素溶液或者纖維素衍生物溶液,繼而提取去除溶解有纖維素或纖維素衍生物之溶劑,或者降低其溶解能力(以下,亦將該等處理統稱為「溶劑去除等」),而製成固化之纖維素多孔體。溶劑去除等之條件並無特別限制。通常,只要快速將冷凍體投入任意之凝固浴或再生浴中即可,較為推薦使凝固浴或再生浴亦處於溶液之冷凍溫度以下。但,於纖維素衍生物之情形時,需進行纖維素再生步驟,該再生可與溶劑去除等同時進行或逐次(即,於進行完溶劑去除等之後)進行。再生本身可按照慣例進行。若使用上述製造方法,則於製造時無需向高分子溶液中添加多孔化材等異物,因此可輕易製作微小之直徑均勻之液滴,可任意進行粒徑控制。孔隙之直徑及形狀基本上取決於溶液中之溶劑等冷凍固化時所形成之溶劑等之結晶之大小及形狀。因此,可藉由改變高分子溶液之種類、溫度等冷凍固化條件來調整孔隙之形狀及孔徑。
再者,若使用上述製造方法,則所獲得之多孔質纖維素微粒子會形成藉由將孔隙間隔開之膜之開口部而彼此連通的連續孔結構。
作為本實施方式之濃縮方法中所用之多孔質纖維素微粒子,可直接使用已造粒之纖維素粒子,較佳為交聯後使用。交聯之方法並無限制,關於纖維素多孔體之分子間交聯,只要具有2個以上之可與纖維素之羥基反應鍵結之官能基,則可用作交聯劑。作為例,可例舉二官能性有機物質。作為其例,有於鹼性反應物質存在下相對容易進行反應之X-R-Z形(式中,R表示含有碳原子之脂肪族殘基,X及Z係各種鹵素、環氧基等,其等與脂肪族殘基之碳鍵結)。適於上述反應之二官能性化合物之例有:表氯醇、二氯丙醇、1,2-或者3,4-二環氧丁烷、二環氧丙醚、乙二醇二環氧丙醚、1,4-丁二醇二環氧丙醚、與其等密切相關之化合物類,但並不特別限定於該等。若可進行交聯,則即便修飾有大量之陽離子性取代基時,仍可維持纖維素之結晶結構,故可穩定地保持粒子之結構。
對構成本實施方式之濃縮方法中所用之多孔質纖維素微粒子之纖維素修飾陽離子性取代基之方法並無特別限制,可藉由直接對羥基進行修飾之方法、或經由具有環氧基之官能基進行修飾之方法等複數種方法進行導入。較佳為使用2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽等直接對纖維素之羥基進行修飾之方法。由於纖維素中存在大量羥基,故藉由直接修飾羥基,可均勻地將大量陽離子性取代基修飾至粒子之內部。另一方面,於經由環氧基等第三取代基進行導入時,陽離子性取代基之導入量、偏差取決於第三取代基之導入量,連粒子內部之導入量都難以控制。又,使用2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽導入陽離子性取代基時之反應條件並無特別限制,可藉由考慮由2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽本身引起之溶液之pH值變化而設定最佳pH值、以及添加芒硝等添加物以將纖維素之羥基之荷電之影響控制到最小限度,來控制孔內部荷電密度。
再者,於本實施方式中,較佳之陽離子性官能基係N,N-二乙基胺基乙基(DEAE)。
[每單位膨潤體積(mL)之乾燥粒子重量(mg)]
關於本實施方式之多孔質纖維素微粒子,經PBS(-)膨潤過之粒子每1 mL體積(膨潤體積)之乾燥粒子重量(mg)較佳為70 mg以下,更佳為55 mg以下,進而較佳為40 mg以下。所謂每單位膨潤體積之乾燥粒子重量低,意味著於多孔性粒子中,液體內之孔隙之尺寸大,空隙比高。若每單位膨潤體積之乾燥粒子重量處於上述範圍內,則水之透過性變高,且微生物於孔內實現自由移動,藉此可有效率地吸附於孔隙內部之表面。進而,於回收微生物時,溶離液與所溶離之微生物向孔外之移動性亦變高,故容易將微生物溶離。
[吸附率(%)]
關於本實施方式之吸附方法中所用之多孔質纖維素微粒子,為了儘可能多地利用試樣中之檢測物質(菌或病毒本身、或者其表面或內在成分),微生物於多孔質纖維素微粒子之表面之吸附率越高越好,較佳為50%以上者,更佳為60%以上,進而較佳為70%以上,最佳為80%以上。此處,多孔質纖維素微粒子之表面係指微粒子之最表面及孔隙表面這兩者之總合。
[含有微生物之試樣之量(mL)]
本實施方式之吸附方法中所接觸之含有微生物之試樣之量可根據多孔質纖維素微粒子之使用量來增減,於渦漩法(實施例3所記載之基於均勻分散之粒子與微生物之接觸方法)中,液量越多,則攪拌時粒子與微生物之接觸概率越低,故相對於乾燥重量每2 mg,較佳為10 mL以下,更佳為5 mL以下,進而較佳為1 mL以下,最佳為0.1 mL以下。另一方面,於管柱法(實施例4所記載之基於固相分離之粒子與微生物之接觸方法)中,通液量並無限制,但若試樣過多,則通液較為耗時而無法實現簡易之操作方法,故較佳為0.1 mL以上10000 mL以下,更佳為1 mL以上10000 mL以下,進而較佳為1 mL以上1000 mL以下。
本發明之第二實施方式係一種濃縮容器,其特徵在於:其用於使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,
該濃縮容器具備:
具有入口開口及出口開口之筒狀本體;及
於該入口開口側及該出口開口側分別隔開規定間隔地設置之2個過濾器;以及
填充於由該2個過濾器所劃分出之空間中之多孔質纖維素微粒子;
此處,
自該入口開口側供給之該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面,並且該試樣液體之溶劑自該出口開口側去除,該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內,且
關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
該第二實施方式中所使用之多孔質纖維素微粒子可與上述第一實施方式中所使用者相同。
將本濃縮容器之概略圖示於圖5中。
於本說明書中,用語「微生物」並無特別限制,廣泛包括:各種細菌,例如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙氏桿菌;各種病毒;真菌;原蟲;立克次體等。於本實施方式中,該等微生物係被濃縮對象。又,含有細菌、病毒等之試樣液體並無特別限制,廣泛包括:患者檢體(例如尿或體液)或食品試樣(例如液狀試樣或利用Stomachere所得之細菌或病毒提取液)、或環境試樣(例如水質)。
於本說明書中,濃縮用載體係指用於自包含有濃縮對象之溶液使對象附著並減少上清液從而進行濃縮之載體。關於去除對象,可例舉:除濃縮對象物以外之細菌、各種病毒、蛋白質等,並無特別限制。
[粒子每單位重量之吸附量(個/mg)]
於本說明書中,所謂粒子每單位重量之吸附量,係指微生物附著後之載體每單位乾燥重量之吸附微生物數(個/mg),該值越大,越可謂獲得了微生物之高密度體。該微生物之高密度體可直接利用微生物附著後之載體(複合體),或使吸附載體與微生物分離後加以利用,並無限制。又,可自高密度體中將所含水分去除,亦可不去除,並無限制。
[微生物之濃縮]
作為一實施方式之例,獲得濃縮之細菌液,於此情形時,可向該高密度體中通入溶離液,僅回收微生物。此時,自高密度體帶入之所含水分越少,越可獲得高濃度之濃縮體。所含水分之去除可利用公知之方法。例如可例舉:減壓乾燥、離心分離、利用通入空氣等所進行之置換、利用吸水體進行之去除等,但並不限定於此,可根據用途適當進行選擇。例如,於對去除所含水分之力進行控制之情形時,較佳為離心分離;於不使用特殊機器而以簡易操作去除所含水分之情形時,較佳為藉由注射器等通入空氣等而進行置換之方法。於本實施方式中,以1000 G進行之1分鐘之離心分離相當於通入1~2 mL之空氣。為了獲得活細菌液,可選擇適當之溶離液。
關於溶離液,第一,可自鹽之濃度中進行選擇,較佳為0.1 M以上,進而較佳為0.3 M以上,但若鹽濃度過高,則會對回收細菌造成不良影響,故較佳為1 M以下。
第二,溶離液之離子種類可自陽離子或陰離子進行選擇,一般而言,價數越高,溶離能力越高,但例如使用硼酸鈉時,溶離能力會消失,故離子種類之選擇較為重要。另一方面,需考慮於本發明之實施環境(例如0℃~40℃)下是否為可獲得上述範圍之離子濃度之溶解度。作為考慮了上述情況之一實施方式,較佳為包含鎂離子之鹽,更佳為氯化鎂。
第三,溶離液之pH值對於維持微生物之存活、或將微生物與吸附載體之表面電荷之靜電相互作用向有利於背離之方向引導較為重要。為了保持pH值不變,亦可向溶離液中添加緩衝液。於一實施方式中,關於大腸桿菌及金黃色葡萄球菌,較佳為pH值2~10,更佳為pH值4~8。但,可根據微生物種類適當進行選擇,並不限定於該範圍。溶離液可根據所回收之細菌之利用形態而包含界面活性劑、酵素、離液鹽、糖、胺基酸、高分子等。
[微生物成分之濃縮]
作為另一實施方式之例,獲得濃縮之細菌或病毒之表面或內在成分,於此情形時,可使該高密度體與溶菌成分接觸,而回收目標之溶出成分。此時,自高密度體帶入之所含水分越少,越可獲得高濃度之目標成分,所含水分之去除可利用上述方法。溶菌成分可根據細菌種類或病毒種類適當進行選擇,並無限定,基於多孔質纖維素微粒子之化學強度(例如,耐水解性、耐化學品性)優異之方面而言,例如可包含:鹼液、有機溶劑、界面活性劑、酵素、離液鹽、糖、胺基酸、高分子等。又,基於多孔質纖維素微粒子之物理強度(例如,耐熱性、耐磨性)優異之方面而言,亦可藉由對該高密度體進行超音波或加熱處理,而溶出目標成分。
[利用洗淨進行之夾雜成分分離]
微生物之高密度體可於任意之步驟中藉由適當之溶液進行洗淨。作為洗淨之一例,可以自患者檢體或食品成分中去除非所需之夾雜成分為目的來進行洗淨。又,可以藉由選擇適當之溶離液而僅選擇去除特定之微生物種類或細胞種類為目的來進行洗淨。又,於將高密度體直接供於檢查之情形(例如,利用免疫法進行之細菌檢測)等中,可以發揮作用之檢測用試劑之B/F分離為目的來進行洗淨。洗淨液可根據細菌種類或病毒種類適當進行選擇,並無限定,考慮到上述溶離液或/及溶菌成分之選擇範圍,較佳為不會使受檢微生物溶離或溶菌之組成。
[實施例]
以下,藉由實施例、比較例,具體地對本發明進行說明,但本發明並不僅限於實施例。
首先,對實施例、比較例中所使用之結構體之各物性值之測定方法、菌液之製備方法等進行說明。
(1)容許含水量(g)、及游離水分比率
測定空管柱(Poly-Prep(註冊商標),Bio-Rad Laboratories, Inc.製造)之皮重A(g)。使用加熱乾燥式水分計(MX-50,A&D製造),測定多孔粒子試樣之水分率,以乾燥重量成為100 mg之方式將多孔粒子試樣填充至管柱中。添加20 mL之PBS(-)(166-23555,FUJIFILM Wako Pure Chemical製造),PBS(-)藉由重力而自管柱下部滴落,測定不再滴落之時間點之管柱重量B(g)。藉由下述式(1)算出粒子每100 mg之容許含水量C(g)。
粒子每100 mg之容許含水量C(g)=B-(0.1+A)…式(1)
然後,以1000 G對上述管柱進行1分鐘離心分離,測定藉由離心力而脫水後之管柱重量D(g)。藉由下述式(2)算出粒子每100 mg之離心後之PBS(-)之質量(E:結合水分量)(g)。
結合水分量E(g)=D-(0.1+A)…式(2)
藉由下述式(3)算出游離水分比率F。
F=(C-E)/E…式(3)
將容許含水量(g)、及游離水分比率之測定方法之概要示於圖2中。
(3)平均粒徑(μm)
平均粒徑係以水或生理鹽水使多孔粒子膨潤後,去除多餘之水,利用顯微鏡,設定為適當之倍率,對20個粒子以上進行測定所得之平均粒徑。
(4)孔隙之平均開孔徑(μm)
孔隙之平均開孔徑係以水或生理鹽水使多孔粒子膨潤後,去除多餘之水,利用顯微鏡,設定為適當之倍率,測定20個粒子以上之膜間之距離所得之平均開孔徑。又,關於各孔隙之開孔徑,於其並非真球或真圓之情形時,以最短直徑進行定義。
(5)比表面積(m
2/g)
表面積係藉由BET法測得之表面積,比表面積係乾燥粒子每1 g之表面積。
(6)荷電容量
量取5.0 g試樣,使用漏斗、抽氣過濾器,以蒸餾水30 mL進行2次洗淨,以水進行置換。依序以0.3 N之鹽酸水溶液30 mL洗淨2次,以10
-4N鹽酸之鹽酸水溶液50 mL洗淨4次。其後,使用漏斗、抽氣過濾器,以10%硫酸鈉水溶液50 mL洗淨4次,並回收濾液。向所回收之濾液中以2 mL為單位逐次添加0.1 N鉻酸鉀水溶液並加以攪拌。繼而,藉由1 N硝酸銀水溶液進行滴定,求出滴定量A(mL)。
又,另外,將上述步驟中以10%硫酸鈉水溶液洗淨完畢之試樣利用純水50 mL洗淨4次,於105℃下乾燥15小時以上,藉由天平測定重量,求出乾燥重量B(g)。
荷電容量測定係使用上述測得之滴定量G(mL)及試樣之乾燥重量H(g),藉由下述式(4)而算出。
荷電容量(mmol/g)=1(N)(mol/L)×G/H…式(4)
(7)每單位膨潤體積(mL)之乾燥粒子重量(mg)
使用加熱乾燥式水分計(MX-50,A&D製造),測定多孔粒子試樣之水分率,以乾燥重量成為100 mg之方式將多孔粒子試樣填充至空管柱(Poly-Prep(註冊商標),Bio-Rad Laboratories, Inc.製造)中。添加20 mL之PBS(-),PBS(-)藉由重力而自管柱下部滴落,使用管柱之刻度,測量不再滴落之時間點之粒子之填充體積I(mL)。藉由下述式(5)算出每單位膨潤體積之乾燥粒子重量J(mg/mL)。
每單位膨潤體積之乾燥粒子重量J(mg/mL)=100/I…式(5)
(8)各種菌液之製備方法
(大腸桿菌液之製備)
向經高壓釜滅菌之3%Tripticase Soy Broth(胰蛋白酶大豆培養液)液體培養基(211768,BD Company製造)1 mL中植入大腸桿菌株15 μL(ATCC No.25922),於好氣性條件下,於37℃下振盪培養16小時。以2000×g離心分離5分鐘,去除上清液,添加1 mL之蒸餾水,獲得OD(optical density,光學密度)(600 nm)=1(大約1e9 cfu/mL)之菌液。藉由生理鹽水適當稀釋所獲得之大腸桿菌液以使用。
(金黃色葡萄球菌液之製備)
向經高壓釜滅菌之3%Tripticase Soy Broth液體培養基(211768,BD Company製造)1 mL中植入金黃色葡萄球菌株15 μL(ATCC No.25923),於好氣性條件下,於37℃下振盪培養16小時。以2000×g離心分離5分鐘,去除上清液,添加1 mL之蒸餾水,獲得OD(600 nm)=1(大約1e9 cfu/mL)之菌液。以生理鹽水適當稀釋所獲得之金黃色葡萄球菌液以使用。
(大腸桿菌T1噬菌體之製備)
向經高壓釜滅菌之3%Tripticase Soy Broth液體培養基(211768,BD Company製造)10 mL中植入大腸桿菌株15 μL(JM109 No.25922),於好氣性條件下,於37℃下振盪培養16小時後,植入以1%Proteose Peptone(䏡蛋白腖)水溶液(SIGMA,P0431-250G)稀釋過之大腸桿菌T1噬菌體(T1,NBRC20001)100 μL,進而培養7小時。藉由0.22 μm過濾器對培養液實施菌體去除後,藉由超過濾將100 kDa以下之分子量排除,藉由雙層瓊脂平板法測量噬菌斑數量,結果為3.7e9 pfu/mL。以生理鹽水適當稀釋所獲得之大腸桿菌T1噬菌體液以使用。
(9)多孔質纖維素微粒子、及比較對象之粒子之準備
將作為比較例所準備之比較粒子(①)~(④)之名稱、來源、物性等示於以下之表1中。
[表1]
[表1] | |||||
本發明粒子(1)~(4) | 比較粒子① | 比較粒子② | 比較粒子③ | 比較粒子④ | |
名稱 | 多孔質纖維素微粒子 | Cultispher R-S | Cytodex R-1 | Florisil | DOWEX™1X8 |
製造商 | - | M9043-10G/Sigma-Aldrich | 17044802/Cytiva | 065-05252/FUJIFILM Wako Pure Chemical | 327-97491/FUJIFILM Wako Pure Chemical |
原材料 | 交聯纖維素 | 交聯明膠 | 交聯葡聚糖 | 活性矽酸鎂 | 交聯聚苯乙烯 |
修飾基 | 二乙基胺基乙基 | 無 | 二乙基胺基乙基 | 無 | 三甲基苄基銨 |
比表面積(乾燥時) (m 2/g) | 1.1 | 0.4 | 0.44 | 289 | 無資料 |
孔徑(濕潤時) (μm) | 30 | 20 | 非多孔質 | 0.006 | 非多孔質 |
電荷容量(mmol/g) | 0.55~2.6 | 0.52 | 1.53 | 檢測極限以下 | 3.2 |
[多孔質纖維素微粒子(於本說明書中,亦稱為本發明粒子)(1)之製備]
使用二流體噴嘴,將以精製棉絨作為原料調整之5℃下之黏度2泊、纖維素濃度2%、銅濃度1.2%、氨濃度4%之纖維素銅銨溶液與氮氣一同噴霧500 mL,於攪拌下接收至冷卻至-40℃之矽油(SH200,1.5 cs,Toray Industries, Inc.)10 L中。將矽油升溫至-20℃,繼續攪拌20分鐘,投入冷卻至-35℃之40%硫酸10 L。投入硫酸後,繼續攪拌8小時,升溫至20℃,去除矽油,抽出殘留物並進行水洗,獲得多孔質纖維素微粒子。使用分級篩,獲得平均粒徑成為200 μm以上280 μm以下之粒子樣品。
然後,量取6.66 g粒子樣品,投入至反應液(純水:267.77 g,十二烷基硫酸鈉:0.016 g,48%氫氧化鈉水溶液:13.05 g,表氯醇:3.845 g)中,於60℃之恆溫槽內攪拌1小時。藉由抽氣過濾,以8000 mL之純水將試樣洗淨3次,獲得交聯纖維素微粒子。
將所獲得之交聯纖維素微粒子之全部量投入至反應液(純水:217.30 g,無水芒硝:88.83 g,十二烷基硫酸鈉:0.016 g,2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽水溶液(50%):11.08 g)中並加以攪拌。其後,添加反應起始液(48%氫氧化鈉水溶液:5.33 g,純水:6.83 g)並輕輕攪拌後,一面於70℃之恆溫槽內攪拌1小時一面進行反應。經過1小時後,投入中和溶液(36%鹽酸:3.14 g,純水:3.14 g)並攪拌,藉由抽氣過濾,以8000 mL之純水將試樣洗淨3次,獲得本發明粒子。關於所獲得之粒子,平均粒徑為240 μm,孔隙之平均開孔徑為30 μm,具有平均開孔徑30 μm以下之貫通孔,乾燥粒子每1 g之表面積(比表面積)為1.1 m
2/g,荷電容量為1.80 mmol/g。將如此製備之多孔質纖維素微粒子作為(1)。
[荷電容量不同之多孔質纖維素微粒子(2)~(4)之製備]
以與上述相同之順序獲得交聯纖維素微粒子後,將粒子6.66 g投入至反應液(純水:217.30 g,無水芒硝:88.83 g,十二烷基硫酸鈉:0.016 g,2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽水溶液(50%):2.325 g)中並加以攪拌。其後,添加反應起始液(48%氫氧化鈉水溶液:1.930 g,純水:6.83 g)並輕輕攪拌後,一面於70℃之恆溫槽內攪拌1小時一面進行反應。經過1小時後,投入中和溶液(36%鹽酸:3.14 g,純水:3.14 g)並攪拌,藉由抽氣過濾,以8000 mL之純水將試樣洗淨3次,獲得荷電容量0.55 mmol/g之粒子。將如此製備之多孔質纖維素微粒子作為(2)。
然後,再次獲得荷電容量0.55 mmol/g之粒子後,將粒子6.66 g投入至反應液(純水:217.30 g,無水芒硝:88.83 g,十二烷基硫酸鈉:0.016 g,2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽水溶液(50%):2.325 g)中並加以攪拌。其後,添加反應起始液(48%氫氧化鈉水溶液:1.930 g,純水:6.83 g)並輕輕攪拌後,一面於70℃之恆溫槽內攪拌1小時一面進行反應。經過1小時後,投入中和溶液(36%鹽酸:3.14 g,純水:3.14 g)並攪拌,藉由抽氣過濾,以8000 mL之純水將試樣洗淨3次,獲得荷電容量1.04 mmol/g之粒子。將如此製備之多孔質纖維素微粒子作為(3)。
進而,再次獲得荷電容量1.80 mmol/g之粒子後,將粒子6.66 g投入至反應液(純水:217.30 g,無水芒硝:88.83 g,十二烷基硫酸鈉:0.016 g,2-(二乙基胺基)氯乙烷鹽酸鹽水溶液(50%):11.08 g)中並加以攪拌。其後,添加反應起始液(48%氫氧化鈉水溶液:5.33 g,純水:6.83 g)並輕輕攪拌後,一面於70℃之恆溫槽內攪拌1小時一面進行反應。經過1小時後,投入中和溶液(36%鹽酸:3.14 g,純水:3.14 g)並攪拌,藉由抽氣過濾,以8000 mL之純水將試樣洗淨3次,獲得荷電容量2.60 mmol/g之粒子。將如此製備之多孔質纖維素微粒子作為(4)。
藉由以上,獲得荷電容量不同之4種多孔質纖維素微粒子。
[實施例1:每單位膨潤體積之乾燥粒子重量之測定]
對於本發明粒子(1)、及比較粒子(①)~(④),測定每單位膨潤體積(mL)之乾燥粒子重量(mg)。將結果示於以下之表2中。
[表2]
[表2] | |||||
本發明粒子(1) | 比較粒子① | 比較粒子② | 比較粒子③ | 比較粒子④ | |
每單位膨潤體積之乾燥粒子重量 (mg/mL) | 36 | 83 | 59 | 500 | 333 |
本發明粒子相較於比較粒子,每單位膨潤體積之乾燥粒子重量最小,即便為較小之重量,仍明顯吸收水分而膨潤。即便與膨潤時之孔隙之平均開孔徑相似之比較粒子(①)相比,仍可見明顯差異,故認為是交聯纖維素原材料、及結構體之特徵在發揮作用。
[實施例2:容許含水量C、游離水分比率F之測定]
為了測定液體或氣體透過多孔性粒子之容易性,對本發明粒子(1)~(4)、及比較粒子(①)~(④)之容許含水量C、及游離水分比率F進行測定。將結果示於以下之表3中。
[表3]
[表3] | ||||||||
本發明粒子 | 比較粒子 | |||||||
(2) | (3) | (1) | (4) | ① | ② | ③ | ④ | |
電荷容量(mmol/g) | 0.55 | 1.04 | 1.8 | 2.6 | 0.52 | 1.53 | 檢測極限以下 | 3.2 |
粒子每100 mg之容許含水量C (g) | 2.080 | 2.600 | 2.980 | 3.380 | 1.190 | 1.851 | 0.216 | 0.261 |
粒子每100 mg之結合水分量E(g) | 0.311 | 0.322 | 0.330 | 0.339 | 0.404 | 0.932 | 0.057 | 0.084 |
游離水分比率F((C-E)/E) | 5.7 | 7.1 | 8.0 | 9.0 | 1.9 | 1.0 | 2.8 | 2.1 |
根據容許含水量之比較,可知本發明粒子相較於比較粒子(①)~(④),於填充至空管柱中時,明顯保持較多水分。另一方面,藉由1000 G、1分鐘之和緩之離心力,輕易使水分自粒子游離,被置換成氣體,結果可知具有游離水分比率明顯較高之物理性質。亦即,可知本發明粒子係藉由較高之空隙比而明顯較為容易使液體或氣體透過之粒子。
[實施例3:利用渦漩法進行之大腸桿菌之吸附性能之測定]
基於實施例1中求得之每單位膨潤體積之乾燥粒子重量,如以下之表4所示,以膨潤粒子體積一致之方式量取本發明粒子(1)、及比較粒子(①)~(④)(濕潤狀態或懸浮狀態之粒子係量取除以水分含有率所得之重量)。向各粒子中添加PBS(-)10 mL,於121℃下進行20分鐘之高壓釜滅菌。以1000 G離心分離1分鐘,藉由吸出器將上清液抽吸去除,添加滅菌PBS(-)10 mL。如此進行2次之粒子之洗淨及電荷之平衡化後,將最終液量定容為4 mL。將如此製備之本發明粒子(1)、及比較粒子(①)~(④)之懸浮液示於圖3中。
[表4]
[表4] | |||||
本發明粒子(1) | 比較粒子① | 比較粒子② | 比較粒子③ | 比較粒子④ | |
乾燥粒子重量 (mg) | 40 | 93 | 66 | 560 | 373 |
膨潤粒子體積 (mL) | 1.12 | 1.12 | 1.12 | 1.12 | 1.12 |
粒子懸浮液之最終液量 (mL) | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
最終濃度 (mg/mL) | 10 | 23 | 16 | 140 | 93 |
量取如此製備之均勻分散之粒子懸浮液0.2 mL(相對於膨潤粒子體積0.056 mL)至2 mL滅菌取樣管中,添加0.8 mL之將上述(8)中所製備之大腸桿菌液稀釋至1e4或1e6倍所得之試樣後,於管混合器(TUBE MIXER)(偏芯振動方式,MT-360,TOMY製造)之最大強度下渦漩30秒或2分鐘。以400 G離心分離1分鐘,以生理鹽水將上清液稀釋至適於平板塗抹培養之濃度之稀釋率K(倍)後,接種100 μL至標準瓊脂培養基(8-MR22、Pourmedia公司製造)中。於35℃下培養48小時,測定菌落數L(cfu/mL)。又,使用生理鹽水0.2 mL代替粒子懸浮液,進行與上述相同之操作,測定菌落數M(cfu/mL)。分別藉由下述式(5)及(6)算出乾燥粒子每單位重量之大腸桿菌之吸附量、及吸附率。再者,下式之乾燥粒子重量係使用表4所記載之數值。
乾燥粒子每單位重量之吸附量N(個/mg)=K×(M-L)/(乾燥粒子重量/20)…式(5)
吸附率(%)=(M-L)/M×100…式(6)
將結果示於以下之表5中。
[表5]
[表5] | |||||||
渦漩時間 | 試樣 | 測定項目 | 本發明粒子(1) | 比較粒子① | 比較粒子② | 比較粒子③ | 比較粒子④ |
… | 稀釋至1e4倍之大腸桿菌液 (1.3e5 cfu/mL) | 吸附率 (%) | 81 | <1 | <1 | <1 | 17 |
乾燥粒子每單位重量之吸附量N (個/mg) | 5e4 | 無法算出 | 無法算出 | 無法算出 | 1e3 | ||
稀釋至1e6倍之大腸桿菌液 (2.0e3 cfu/mL) | 吸附率 (%) | 84 | 42 | 38 | 84 | 53 | |
乾燥粒子每單位重量之吸附量N (個/g) | 9e2 | 2e2 | 3e2 | 6e1 | 7e1 | ||
2分鐘 | 稀釋至1e4倍之大腸桿菌液 (0.7e5 cfu/mL) | 吸附率(%) | 84 | 16 | <1 | 12 | 76 |
乾燥粒子每單位重量之吸附量N (個/mg) | 3e4 | 2e3 | 無法算出 | 3e2 | 3e3 | ||
稀釋至1e6倍之大腸桿菌液 (0.8e3 cfu/mL) | 吸附率 (%) | 74 | 8.3 | 1.7 | 90 | 74 | |
乾燥粒子每單位重量之吸附量N (個/mg) | 3e2 | 1e1 | 4e0 | 3e1 | 3e1 |
本發明粒子(1)相較於比較粒子(①)~(④),於較寬之大腸桿菌濃度範圍(1e3~1e5 cfu/mL)內,維持較高之吸附率。為了獲得較高之吸附容量,需將大腸桿菌吸附至粒子內部,因此,粒子需要具有充分大之孔隙開孔徑,而即便與膨潤時之孔隙之平均開孔徑相似之比較粒子(①)相比,本發明粒子(1)亦顯示出明顯較高之吸附率,故可知,本發明粒子(1)不僅藉由孔隙之開孔徑,還藉由根據較高之空隙比所獲得之較高透過性,而實現了先前粒子無法實現之高效率之大腸桿菌之吸附。
又,比較粒子(③)及(④)於渦漩2分鐘時,吸附率為70%以上,但於渦漩30秒時,吸附率明顯降低;另一方面,本發明粒子(1)即便於渦漩30秒時,仍保持發揮性能不變,可知上述結構性特徵亦有助於實現迅速吸附。
圖4表示大腸桿菌吸附後之多孔質纖維素微粒子之SEM(scanning electron microscope,掃描式電子顯微鏡)圖像之一例。
又,本發明粒子(1)儘管具有較高之空隙比,但使膨潤粒子體積保持一致,與比較粒子(①)~(④)相比,仍發揮高效率之吸附性能,故可獲得乾燥粒子每單位重量之吸附量N(個/mg)明顯較大之微生物之高密度體。
[實施例4:利用管柱法進行之大腸桿菌之吸附性能之測定]
將實施例3中所製備之均勻分散之粒子懸浮液0.2 mL填充至空管柱(Presh-SPE(註冊商標)、AiSTI SCIENCE Co., Ltd.製造)中,將多餘之PBS(-)自出口抽吸去除,藉此製作填充有粒子之管柱。使用拋棄式注射器,以100 μL/秒,向上述管柱中通入將上述(8)中所製備之大腸桿菌液稀釋至1e3倍所得之試樣(以下,稱為稀釋至1e3倍之大腸桿菌液、或大腸桿菌試樣)10 mL,回收通過管柱之液(以下稱為流出物)。然後,將生理鹽水1 mL通入管柱而洗淨吸附有大腸桿菌之管柱,進而通入10 mL之空氣而去除游離水分。關於上述大腸桿菌試樣、及流出物,以生理鹽水將該等稀釋至適於平板塗抹培養之濃度之稀釋率之後,接種100 μL至標準瓊脂培養基(8-MR22 Pourmedia公司製造)中,於35℃下培養48小時,測定菌落數。分別藉由下述式(7)及(8)算出乾燥粒子每單位重量之大腸桿菌之吸附量T、及吸附率S。再者,下式之乾燥粒子重量係使用表4所記載之數值。
大腸桿菌試樣:菌濃度O(cfu/mL)=所接種之菌落數(cfu/mL)×稀釋率Q
流出物:菌濃度P(cfu/mL)=所接種之菌落數(cfu/mL)×稀釋率R
乾燥粒子每單位重量之吸附量S(個/mg)=(O-P)×10(mL)/(乾燥粒子重量/20)…式(7)
吸附率T(%)=(O-P)/O×100…式(8)
將結果示於以下之表6中。
[表6]
[表6] | ||||||
試樣 | 測定項目 | 本發明粒子(1) | 比較粒子① | 比較粒子② | 比較粒子③ | 比較粒子④ |
稀釋至1e3倍之大腸桿菌液 (3e6 cfu/mL) | 吸附率T (%) | 96 | 12 | <1 | <1 | 39 |
乾燥粒子每單位重量之吸附量S (個/mg) | 2e7 | 9e5 | 無法算出 | 無法算出 | 7e5 |
於管柱法中,本發明粒子(1)相較於比較粒子(①)~(④),亦獲得了較高之吸附率T,可知本發明粒子(1)無論於渦漩法(即基於均勻分散之粒子與微生物之接觸方法)中,抑或於管柱法(即基於固相分離之粒子與微生物之接觸方法)中,均可發揮較高之吸附性能。又,確認到於管柱法中,可於大腸桿菌吸附後將粒子洗淨,又,可進行通氣而輕易將殘留於粒子中之游離水分去除。
[實施例5:利用管柱法進行之除大腸桿菌以外之微生物之吸附性能之測定]
按照與實施例3及實施例4相同之順序,對於上述(8)中所製備之大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、及作為病毒之大腸桿菌T1噬菌體,分別算出乾燥粒子每單位重量之該微生物之吸附量S、及吸附率T。其中,關於大腸桿菌T1噬菌體之測量,係將稀釋後液體10 μL與1e9 cfu/mL之JM109大腸桿菌30 μL及軟瓊脂5 mL混和後,於標準瓊脂培養基上固化,於35℃下培養24小時,測定所得之菌斑數。又,大腸桿菌T1噬菌體之吸附率T及乾燥微粒子每單位重量之吸附量S係將cfu/mL替換為pfu/mL來進行計算。將結果示於以下之表7中。
[表7]
[表7] | |||
微生物種類 | 革蘭氏陰性菌 | 革蘭氏陽性菌 | 病毒 |
大腸桿菌 | 金黃色葡萄球菌 | 大腸桿菌T1噬菌體 | |
菌株 | ATCC No.25922 | ATCC No.25923 | NBRC 20001 |
微生物試樣之濃度O | 1e6 (cfu/mL) | 0.9e6 (cfu/mL) | 0.7e6 (pfu/mL) |
吸附率T(%) | 99 | 97 | 100 |
乾燥粒子每單位重量之吸附量S (個/mg) | 5e6 | 4e6 | 3e6 |
根據表7所示之結果可知,本發明粒子(1)對於作為革蘭氏陰性菌之大腸桿菌、及作為革蘭氏陽性菌之金黃色葡萄球菌,無論菌種為何,均可高效率地進行吸附。進而可知,作為微生物,不僅對細菌,對病毒亦同樣地發揮吸附能力。
[實施例6:自藉由管柱法所獲得之大腸桿菌吸附粒子(微生物之高密度體) 回收菌而獲得大腸桿菌之濃縮物之方法]
向實施例4中最終所獲得之去除了游離水分之大腸桿菌吸附管柱中通入作為溶離液之1 M氯化鎂1 mL,回收溶離液之流出物。關於流出物,以生理鹽水將其稀釋至適於平板塗抹培養之濃度之稀釋率V之後,接種100 μL至標準瓊脂培養基(8-MR22 Pourmedia公司製造)中,於35℃下培養48小時,測定菌落數。大腸桿菌之濃縮倍率W係藉由下述式(9)算出。
溶離液之流出物:菌濃度U(cfu/mL)=所接種之菌落數(cfu/mL)×稀釋率V
濃縮倍率W(倍)=溶離液之流出物之菌濃度U/大腸桿菌試樣之菌濃度O…式(9)
將結果示於以下之表8中。
[表8]
[表8] | ||||||
試樣 | 測定項目 | 本發明粒子(1) | 比較粒子① | 比較粒子② | 比較粒子③ | 比較粒子④ |
稀釋至1e3倍之大腸桿菌液 (3e6 cfu/mL) | 濃縮倍率W (倍) | 2.7 | <0.1 | 0.9 | <0.1 | 0.3 |
本發明粒子(1)獲得了1以上之濃縮倍率,表示可藉由溶離液之通液對菌進行濃縮。
[實施例7:荷電容量不同之本發明粒子(1)~(4)之吸附率T(%)及濃縮倍率W(倍)之測定]
按照與實施例4及實施例5相同之順序,對荷電容量不同之4種本發明粒子(1)~(4),測定吸附率T(%)及濃縮倍率W(倍),將所得之結果示於以下之表9中。
[表9]
[表9] | ||||
本發明粒子(2) | 本發明粒子(3) | 本發明粒子(1) | 本發明粒子(4) | |
荷電容量 (mmol/g) | 0.55 | 1.04 | 1.8 | 2.6 |
大腸桿菌試樣之菌濃度O (cfu/mL) | 1e6 | 1e6 | 1e6 | 1e6 |
吸附率T (%) | 51 | 96 | 96 | 98 |
濃縮倍率W (倍) | 0.7 | 6.8 | 2.7 | 4.0 |
根據表9所示之結果,可知多孔質纖維素微粒子之荷電容量為0.55~2.6 mmol/g時可獲得50%以上之吸附率。又,可知濃縮倍率W於溶離液為1 M氯化鎂時、荷電容量為1.04~2.6 mmol時,更佳。
[實施例8:不同之大腸桿菌試樣之菌濃度、通液量及溶離液量下之本發明粒子(1)之吸附率T(%)及濃縮倍率W(倍)之測定]
按照與實施例4及實施例5相同之順序,使用填充有本發明粒子(1)之粒子懸浮液0.2 mL(以乾燥粒子重量計為2 mg)之管柱,測定不同之大腸桿菌試樣之菌濃度O、通液量及溶離液量下之吸附率T(%)及濃縮倍率W(倍),將所得之結果示於以下之表10中。再者,表10之溶離液量係指通入1 M氯化鎂作為溶離液時之量(mL)。
[表10]
[表10] | ||||||
大腸桿菌試樣之菌濃度O (cfu/mL) | 1e6 | 1e6 | 1e1 | 1e3 | 1e7 | 1e8 |
大腸桿菌試樣之通液量 (mL) | 10 | 10 | 100 | 1000 | 10 | 10 |
溶離液量 (mL) | 1 | 0.1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
吸附率T (%) | 96 | 98 | 100 | 100 | 94 | 46 |
濃縮倍率W (倍) | 2.7 | 12 | 39 | 284 | 2.6 | 0.6 |
根據表10所示之結果,可知填充有本發明粒子(1)之粒子懸浮液0.2 mL(以乾燥粒子重量計相當於2 mg,以膨潤粒子體積計相當於0.056 mL)之管柱可通入大腸桿菌試樣之通液量10~1000 mL,又,可以溶離液量0.1~1 mL進行回收,於該範圍內,可維持與實施例4及實施例5相同之較高之吸附率T及濃縮倍率W。又,本管柱最高可於大腸桿菌試樣之菌濃度O為1e8 cfu/mL之情況下進行吸附,尤其於1e1~1e7 cfu/mL之濃度下可獲得較高之吸附率T。
[產業上之可利用性]
於本發明之濃縮方法及濃縮容器中,能夠使用以容許含水量及游離水分比率為指標之空隙比及脫水率較高之特定之多孔質纖維素微粒子來對微生物進行濃縮,因此粒子每單位乾燥重量之微生物之吸附量較高,能夠獲得微生物之高密度體,又,亦能夠自所獲得之微生物之高密度體回收高濃度之微生物。因此,本發明之濃縮方法及濃縮容器適宜用於微生物檢查等中。
圖1係多孔質纖維素微粒子(表示為交聯纖維素)、及其他濃縮載體之照片。
圖2係「容許含水量」、「游離水分比率」之概念圖、及求出方法之說明圖。
圖3係多孔質纖維素微粒子(表示為本發明粒子)、及比較粒子①~④之粒子懸浮液。
圖4係大腸桿菌吸附後之多孔質纖維素微粒子之電子顯微鏡。
圖5係用以保持多孔質纖維素微粒子之濃縮容器之概略圖。
Claims (27)
- 一種微生物之濃縮方法,其係使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,且包括以下步驟: 使該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,而使該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面之步驟;以及 將該試樣液體之溶劑去除,而使該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之排液步驟; 關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
- 如請求項1之方法,其進而包括以下步驟: 於上述排液步驟後,使用溶離液,將濃縮於多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之微生物回收至該溶離液中之步驟。
- 如請求項1或2之方法,其進而包括於上述各步驟間,藉由液體或氣體洗淨多孔質纖維素微粒子之步驟。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子之平均粒徑為100 μm以上1000 μm以下。
- 如請求項1至4中任一項之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子之孔隙之平均開孔徑為1 μm以上100 μm以下。
- 如請求項1至5中任一項之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子形成有藉由將相鄰之孔隙間隔開之膜之開口部而彼此連通的連續孔結構。
- 如請求項1至6中任一項之方法,其中上述多孔質纖維素微粒子之乾燥粒子每1 g之表面積(比表面積)為0.3 m 2/g以上4.4 m 2/g以下。
- 如請求項1至7中任一項之方法,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素具有陽離子性官能基,且荷電容量為0.5 mmol/g以上5.0 mmol/g以下。
- 如請求項8之方法,其中上述陽離子性官能基係選自由一級胺基、二級胺基、及三級胺基所組成之群中之至少一種。
- 如請求項9之方法,其中上述陽離子性官能基係N,N-二乙基胺基乙基(DEAE)。
- 如請求項1至10中任一項之方法,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素經分子間交聯。
- 如請求項1至11中任一項之方法,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素包含銅氨再生纖維素。
- 如請求項1至12中任一項之方法,其中上述微生物係細菌或病毒。
- 一種濃縮容器,其特徵在於:用於使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法, 該濃縮容器具備: 具有入口開口及出口開口之筒狀本體; 設置於該出口開口側之過濾器;以及 填充於該過濾器上之空間之多孔質纖維素微粒子; 此處, 自該入口開口側供給之該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面,並且該試樣液體之溶劑自該出口開口側去除,該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內,且 關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
- 如請求項14之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子之平均粒徑為100 μm以上1000 μm以下。
- 如請求項14或15之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子之孔隙之平均開孔徑為1 μm以上100 μm以下。
- 如請求項14至16中任一項之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子形成有藉由將相鄰之孔隙間隔開之膜之開口部而彼此連通的連續孔結構。
- 如請求項14至17中任一項之濃縮容器,其中上述多孔質纖維素微粒子之乾燥粒子每1 g之表面積(比表面積)為0.3 m 2/g以上4.4 m 2/g以下。
- 如請求項14至18中任一項之濃縮容器,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素具有陽離子性官能基,且荷電容量為0.5 mmol/g以上5.0 mmol/g以下。
- 如請求項19之濃縮容器,其中上述陽離子性官能基係選自由一級胺基、二級胺基、及三級胺基所組成之群中之至少一種。
- 如請求項20之濃縮容器,其中上述陽離子性官能基係N,N-二乙基胺基乙基(DEAE)。
- 如請求項14至21中任一項之濃縮容器,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素經分子間交聯。
- 如請求項14至22中任一項之濃縮容器,其中構成上述多孔質纖維素微粒子之纖維素包含銅氨再生纖維素。
- 如請求項14至23中任一項之濃縮容器,其中上述微生物係細菌或病毒。
- 一種微生物之濃縮方法,其係使用內部具有大量孔隙之多孔質纖維素微粒子來對溶劑中含有微生物之試樣液體中之該微生物進行濃縮之方法,且包括以下步驟: 於具備具有入口開口及出口開口之筒狀本體、設置於該出口開口側之過濾器、及填充於該過濾器上之空間之多孔質纖維素微粒子的濃縮容器中,使該試樣液體與該多孔質纖維素微粒子接觸,而使該試樣液體中所含之微生物吸附於該多孔質纖維素微粒子之表面之步驟;以及 進行通氣,將該試樣液體之溶劑去除,而使該微生物濃縮於該多孔質纖維素微粒子之表面及/或孔隙內之排液步驟; 關於該多孔質纖維素微粒子,以PBS(-)使乾燥粒子100 mg膨潤,PBS(-)不再因自身重量而滴落之膨潤狀態下的該多孔質纖維素微粒子之PBS(-)之質量即容許含水量C為1.9 g以上,且自該容許含水量C減去使該膨潤狀態下的多孔質纖維素微粒子以1000 G離心1分鐘後之PBS(-)之質量E而獲得脫水量(C-E),以該脫水量(C-E)除以E所獲得之游離水分比率((C-E)/E)為2.9以上。
- 如請求項25之微生物之濃縮方法,其中上述通氣係利用注射器自上述濃縮容器入口開口部通入空氣。
- 如請求項26之微生物之濃縮方法,其中上述空氣之體積係相對於上述多孔質纖維素微粒子每1 mg為0.5 mL以上1 mL以下。
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