CN101421012A - 使用经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质分离样品中的组分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供从包含微粒和可溶性物质的样品中分离一种或多种感兴趣组分的方法。该方法包括以下步骤：(a)将样品过滤通过表面硅醇基团已与一种或多种硅烷反应而被活化的二氧化硅过滤介质，以及(b)同时俘获微粒和使可溶性组分与二氧化硅过滤介质结合。接着，从二氧化硅过滤介质洗脱感兴趣的、已经结合的可溶性组分。在本发明的一个实施方式中，经过处理的二氧化硅过滤介质俘获不需要的可溶性物质，从流出液中回收所需感兴趣组分。在本发明的另一个实施方式中，从洗脱液和流出液中回收不同的感兴趣组分。优选的经过处理的二氧化硅过滤介质是经过硅烷处理的稻壳灰、燕麦壳灰或硅藻土。

Description

使用经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质分离样品中的组分的方法
发明领域
本发明涉及从包含微粒物质和可溶性组分的样品中分离一种或多种感兴趣组分的方法。更具体来说，本发明涉及使用稻壳灰之类的经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质同时分离蛋白质和俘获微粒。微粒的例子包括微生物。
发明背景
生物科技中的材料制备包括对被许多其他生物组分包围的特定材料进行离析、分离和纯化。无论所述材料来源于发酵、转基因植物或转基因山羊的羊乳；必须以相当纯的形式收集感兴趣的材料。如果起始混合物非常复杂，则对感兴趣材料的离析会非常困难，经常需要进行高成本的操作。在生物科技和一些其它的工业(包括水处理、食品和饮料、以及化学工业)中，人们非常需要能够减少分离操作数量和简化回收过程的技术。
微生物污染在许多工业(包括酿造、酿酒、果汁和饮料、乳业、工业酶和制药)中是一个普遍的问题，因此将产品与微生物分离是很重要的。迄今为止，加热灭菌和基于大小的过滤是用来解决该问题的最常用的方法。这些方法中的每个方法都有优点和缺点。加热灭菌的主要缺点在于，该技术的应用仅限于不会受高温影响的产品。基于大小的过滤的缺点是高成本和耗时。另外，基于大小的过滤不能用于所需组分大小与细菌相同的情况(例如乳品工业)。
已经开发出的用来简化分离的技术的例子包括膨胀床吸附和色谱法。膨胀床吸附可以从同时包含可溶性组分和微粒组分的发酵混合物中俘获可溶性组分。在该方法中，不需要在用床处理样品之前进行预先过滤步骤。发酵混合物向上流过吸附剂珠粒床；随着床向上的膨胀，向上的流分会托起珠粒，使珠粒悬浮。可溶性组分被珠粒俘获，而微粒物质从珠粒周围流过，从床的顶部离开。然后通过洗脱步骤从珠粒中回收可溶性组分。但是由于该技术还存在一些技术问题，因此尚未能广泛应用，这些问题包括规模放大的困难、保持稳定的床、珠粒被从顶部携带出床的问题、发酵混合物在珠粒上结垢的问题、珠粒的清洁和重新使用问题、珠粒的使用寿命以及在吸附步骤中可变的压降。
固液色谱是基于流动液体和固体吸附剂之间的一种或多种溶质的分配的任意的分离方法。在色谱中使用许多种不同的固体吸附剂(通常称为“固定相填料”)。不同的固定相填料可以获得不同的色谱技术，通常根据这些色谱技术的相互作用机理对其进行分类。相互作用可以由一种或多种以下的机理产生：电荷(离子交换色谱)；范德华力(疏水相互作用色谱)；尺寸和形状(尺寸排阻)；亲合性(例如蛋白质-A，生物素-抗生物素蛋白，生物素-抗生物素蛋白链菌素，凝集素，抗体，果胶，染料配体，固定的金属亲合性)(参见Harvey W.Blanch和Douglas S.Clark所著的＂Biochemical Engineering＂，Marcel Dekker Inc，1996；第502-506页)。通过设计定制的亲合性色谱(Custom Affinity Chromatography)来俘获特定的蛋白质，对于各种待俘获的蛋白质，该色谱需要特定的亲合性介质和特定的配体。开发这种特定的介质需要大量的时间、人工和成本。色谱通常需要预先过滤步骤来除去固体材料。
过滤是使进料流通过多孔介质，从而除去微粒。通过包括直接碰撞、筛分等的各种机理将微粒俘获在介质上。使用各种介质的过滤方法，已经被用于诸如废水处理、酿酒、饮料生产和工业酶生产之类的应用中以除去微粒。
过滤介质也被称为助滤剂，可以是疏松的微粒或结构化的材料。它们是微粒形式的固体材料，不溶于待过滤的液体；它们被加入液体中，或涂敷在过滤器或过滤器基质上。使用过滤介质的目的是加快过滤，减少过滤器表面的结垢，减少过滤层的破裂，或者在其他方面提高过滤性能。通常用作过滤介质的材料包括纤维素纤维、硅藻土、活性碳、膨胀珍珠岩、石棉纤维等。
经常根据过滤介质的物理形式对其进行描述。一些过滤介质基本上是不连续的薄膜，它们通过将污染物保持在薄膜表面上从而进行过滤(表面过滤器)。这些过滤介质主要通过机械应变来工作，过滤介质的孔径必须小于需要从液体中除去的污染物的粒度。这些过滤介质通常具有低流速，以及迅速堵塞的倾向。
其它的过滤介质为沉积在多孔载体或基材上的细小纤维或微粒材料的多孔饼或床的形式。被过滤的溶液必须通过细小材料的间隙中形成的孔的路径，留下保留在过滤材料上的微粒污染物。由于过滤材料的深度，这些过滤器被称为深度过滤器(与表面过滤器相对)。深度过滤器通常通过筛选机理和动电颗粒俘获机理保留污染物。在动电颗粒俘获模式中，不需要过滤介质具有如此小的孔径。具有大得多的孔径的过滤介质根据需要除去悬浮的微粒污染物的能力是很吸引人的，这是由于这种过滤介质可以具有更高的流速。另外，这些过滤器具有更高的保留微粒的能力，因此减小了堵塞的可能性。
生物技术和其他工业需要高效而低成本的方法来离析感兴趣组分。还希望分离生物分子的方法使用低成本的原料。
稻壳灰是稻谷农业的副产品，大米是全球一半人口的主食。目前，不能食用的稻壳被用作燃料、肥料的原料和用于绝缘用途。当稻壳燃烧的时候，会生成与沉淀二氧化硅或热解法二氧化硅颗粒-OH非常类似的、表面上具有游离酸性羟基部分(OH或颗粒-OH)的结构化颗粒材料副产物，已证明这种副产物可用作助滤剂。美国专利第4,645,605号揭示了将稻壳灰用作过滤介质。
美国专利第4,645,567号揭示了使用各种多孔过滤介质，使污染液从这些介质中通过，从而将小粒度的污染物从液体中过滤出来。要作为过滤器，过滤介质必须能够使液体(通常是水)通过，同时阻止微粒。阻止微粒是通过显著不同的过滤机理完成的，即(a)机械应变和(b)颗粒俘获。在机械应变中，当颗粒试图通过尺寸小于该颗粒的孔的时候，通过物理捕获除去颗粒。在颗粒俘获中，颗粒与多孔过滤介质内的表面碰撞，通过短程吸引力保留在表面上。
WO 02/083270揭示了用于被动过滤(passive filtration)的过滤系统。该系统包括：具有入口和出口的外壳；位于入口和出口之间的折叠的碳过滤器，该过滤器用来过滤进入进口的蒸气；以及疏水性溶液，该溶液包含分散在所述折叠的碳过滤器周围的硅烷组合物，该组合物用来抑制水分吸附，以增大折叠的碳过滤器的吸附能力(尤其是在高相对湿度的环境下)，通过选择所述疏水性溶液，使其不会降低碳过滤器的吸附能力。
美国专利第6,524,489号揭示了包含非均质介质颗粒的高级复合介质，所述介质颗粒各自包含：(i)选自硅藻土、膨胀珍珠岩、浮石、黑曜岩、松脂岩和火山灰的功能组分；(ii)选自玻璃、天然晶体矿物和合成晶体矿物、热塑性塑料、具有热塑性的热固性塑料、稻壳灰和海绵骨针的基质组分；所述基质组分的软化点温度低于所述功能组分的软化点温度；所述功能组分与所述基质组分紧密地直接结合。可以用二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或氨基丙基三乙氧基硅烷处理所述高级复合介质的表面。
Snyder等人揭示了通过有机硅烷醇、有机二甲基胺或有机烷氧基硅烷在不发生聚合的情况下与高表面积的二氧化硅载体反应制备色谱键合相填料。(L.R.Snyder和J.J.Kirkland，Introduction to Modern Liquid Chromatography，第二版，Wiley-Interscience，N.Y.1979.272-280)。
Roy等人(J Chrom.Sci.22：84-86(1984))揭示了使用环氧丙氧基丙基甲硅烷基二氧化硅的环氧官能团制备离子交换(DEAE，羧基和磺酸基)二氧化硅；该离子交换二氧化硅被用于柱色谱，用来分离牛血清清蛋白和牛丙种球蛋白。
通常Snyder和Roy所述的这种经过处理的色谱二氧化硅过于昂贵，无法用于更大规模的常规过滤以及离析过程。
人们需要适合大规模地从样品中分离感兴趣组分的、改进的、成本较低的分离系统。这种系统使用低成本的原料，适用于大规模生产，而且不需要对样品进行预处理。
发明内容
本发明提供了用来从包含微粒和可溶性物质的样品中分离一种或多种组分，特别是感兴趣的生物分子的方法。本发明的特征是使用表面已用一种或多种硅烷经过处理的过滤介质对样品进行过滤。优选的过滤介质是二氧化硅过滤介质。该方法可以在通过过滤俘获微粒的同时将可溶性物质结合在二氧化硅过滤介质上。
本发明一种方法包括以下步骤：(a)用经过处理的二氧化硅过滤介质对样品进行过滤，(b)在俘获微粒的同时，使感兴趣的可溶性组分与二氧化硅过滤介质结合，(c)从二氧化硅过滤介质洗脱感兴趣的结合的可溶性组分。
本发明另一方法包括以下步骤：(a)用经过处理的二氧化硅过滤介质对样品进行过滤，(b)在俘获微粒的同时，使不需要的可溶性物质与二氧化硅过滤介质结合，(c)收集流出的流分，(d)从流出的流分中回收感兴趣的可溶性组分。
本发明的另一方法包括以下步骤：(a)用经过处理的二氧化硅过滤介质对样品进行过滤；(b)在除去微粒的同时，使第一种感兴趣的可溶性组分与二氧化硅过滤介质结合，(c)收集流出的流分，(d)从流出的流分中回收第二种感兴趣的可溶性组分，(e)从二氧化硅过滤介质上洗脱结合的第一种感兴趣的可溶性组分，(f)回收第一种感兴趣的可溶性组分。
在本发明一个实施方式中，所述微粒是微生物。微生物除了被经过硅烷处理的过滤介质俘获以外，还会通过与经过硅烷处理的过滤介质接触而被杀死。
本发明还涉及经过硅烷处理的过滤介质。优选的经过处理的二氧化硅过滤介质是经过硅烷处理的、带有季铵官能团或磺酸盐官能团的稻壳灰。
附图简述
图1A显示了未处理的硅藻土(FW12)、未处理的稻壳灰，HQ50(市售季铵离子交换树脂)以及经过表面处理的稻壳灰(二氧化硅过滤介质样品4和6)上的蛋白质结合，图1B显示了在这些材料上的蛋白质释放。
图2显示了使用经过表面处理的稻壳灰的蛋白质结合和蛋白质释放。图2A显示了二氧化硅过滤介质样品7和8的结果。图2B显示了样品9和10的结果。图2C显示了样品11和12的结果。
图3显示了使用经过表面处理的稻壳灰的蛋白质结合和蛋白质释放。图3A显示了样品14的结果。图3B显示了二氧化硅过滤介质样品13和15的结果。图3C显示了样品16和17的结果。图3D显示了样品18和19的结果。图3E显示了样品20的结果。
图4显示了使用经过表面处理的稻壳灰的蛋白质结合和蛋白质释放。图4A显示了二氧化硅过滤介质样品样品41和未处理的RHA的结果。图4B显示了多孔HS50的结果。
图5显示了蛋白质结合和蛋白质释放。图5A显示了二氧化硅过滤介质样品42的结果。图5B显示了样品40和未处理的RHA的结果。图5C显示了Celite 512的结果。图5D显示了样品29和未处理的RHA的结果。
图6显示了使用经过表面处理的RHA(样品9)的动态蛋白质结合和蛋白质释放。
图7A显示了未处理的稻壳灰，图7B显示了二氧化硅过滤介质样品19，它们同时进行微粒过滤和可溶性物质俘获/释放。
图8显示了二氧化硅过滤介质样品19和未处理的RHA，它们同时进行微粒过滤和可溶性物质俘获/释放。
发明详述
本发明涉及用来从样品中分离一种或多种感兴趣组分的方法。本发明的一个实施方式包括以下步骤：(a)用表面已经用一种或多种硅烷处理过的二氧化硅过滤介质过滤包含微粒和可溶性组分的样品，(b)在俘获微粒的同时，使感兴趣的可溶性生物分子与二氧化硅过滤介质结合，(c)从所述二氧化硅过滤介质上洗脱结合的、感兴趣的可溶性组分。在此实施方式中，感兴趣的分子首先与二氧化硅过滤介质相结合，然后通过洗脱回收。可任选地从微粒中回收感兴趣的不溶性组分。
本发明另一实施方式包括以下步骤：(a)用表面已经用一种或多种硅烷处理过的二氧化硅过滤介质过滤包含微粒和可溶性材料的样品，(b)在俘获微粒的同时，使不需要的可溶性材料与二氧化硅过滤介质结合，(c)收集流出的流分，(d)从流出的流分中回收感兴趣的可溶性组分。可以从所述流出的流分中进一步纯化感兴趣的可溶性组分。在此实施方式中，感兴趣的可溶性组分不与二氧化硅过滤介质结合，在流出的物料中回收。可任选地从微粒中回收感兴趣的不溶性组分。
本发明另一实施方式包括以下步骤：(a)用表面已经用一种或多种硅烷处理过的二氧化硅过滤介质过滤包含微粒和可溶性材料的样品；(b)在俘获微粒的同时，将第一种感兴趣的可溶性组分与二氧化硅过滤介质结合，(c)收集流出的流分，(d)从流出的流分回收第二种感兴趣的可溶性组分，(e)从二氧化硅过滤介质洗脱结合的第一种感兴趣的可溶性组分，(f)回收第一种感兴趣的可溶性组分。在此实施方式中，所述第一种感兴趣的组分与二氧化硅过滤介质结合，第二种感兴趣的组分不与二氧化硅过滤介质结合。可任选地从微粒回收感兴趣的不溶性组分。
本发明任选地包括另外的步骤。在过滤步骤(步骤(a))之前，首先使包含微粒和可溶性材料的样品与经过处理的二氧化硅过滤介质反应一段时间，这段时间足以使所述组分与经过处理的二氧化硅过滤介质的表面充分结合。通过任意的机械混合方法(例如搅拌、搅动、涡流等)将所述样品与经过处理的二氧化硅过滤介质混合，从而进行该反应。在所述组分与经过处理的二氧化硅过滤介质结合之后，用过滤装置处理该混合物，然后用过滤介质过滤该样品。
术语＂样品＂表示包含液体、溶液、悬浮体或乳液形式的多种组分的任意混合物。所述样品通常包含可溶性组分和微粒。优选“生物样品”，“生物样品”表示包括生物分子的生物组织和/或液体，所述生物分子是例如多肽、类脂、碳水化合物、脂蛋白、多糖、糖、脂肪酸、多核苷酸或病毒。生物样品可包括组织切片，例如用于组织学目的的冷冻切片。适于本发明的样品包括细胞溶解产物、培养基、食品(特别是乳制品)、血液、饮料(例如果汁、啤酒、酒)、包含蛋白质之类的生物分子的溶液或悬浮体。“蛋白质”是天然的、合成的或设计的肽或多肽，其包括酶，例如氧化还原酶、转移酶、异构酶、连接酶和水解酶，抗体，激素，细胞因子，生长因子和其它生物调节剂。
过滤是通过使进料流通过多孔基质来除去微粒。通过包括物理捕获的各种机理将颗粒俘获在介质上，并使其与介质结合。本发明使用各种二氧化硅介质过滤器在不同用途中除去微粒，所述不同用途包括但不限于废水处理、酿酒、果汁和饮料生产、奶制品以及生产酶之类的蛋白质的工业。
术语“微粒”表示宏观的不溶性物质或微观的微粒。宏观微粒是人眼可见的微粒，其包括但不限于沉淀物、包涵体和晶体。包涵体由细胞区室内的不溶性或不正确折叠的蛋白质组成。晶体由过饱和溶液中分子以有序的重复形式聚集而形成。沉淀物是无规聚集形成的无定形形式。宏观微粒的来源物可以是有机的或无机的；它们可以源自蛋白质与酶之间的相互作用、盐与蛋白质之间的相互作用、盐与盐之间的相互作用、蛋白质和聚合物之间的相互作用等。微观微粒是在显微镜下可见的微粒。微粒的例子包括微生物。适合通过本发明从生物样品中俘获和除去的微生物为革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、酵母菌、霉菌、病毒等。
本发明的特征是，在过滤过程中使用经过处理的二氧化硅过滤介质，在使可溶性组分结合在二氧化硅过滤介质上的同时，通过过滤从溶液中俘获微粒。本发明省去了色谱法中经常需要的用来除去微粒的预先过滤步骤。可溶性组分通过各种机理与经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质结合，这些机理是例如亲水性、疏水性、亲合性和/或静电相互作用。可用于本发明的二氧化硅过滤介质具有适于被硅烷处理的表面，还具有适于工业过滤用途的结构特征。二氧化硅过滤介质的例子包括但不限于稻壳灰、燕麦壳灰、硅藻土、珍珠岩、滑石和粘土。
稻壳灰是稻谷农业的副产品。每粒稻谷都被外壳所保护，这些外壳占收获的作物毛重的17-24重量％。稻壳由71-87％(重量/重量)的纤维素之类的有机材料和13-29％(重量/重量)的无机材料组成。无机部分中很大的一部分，87-97％(重量/重量)是二氧化硅(SiO2)。目前，不能食用的稻壳被用作燃料、肥料的原料和用于绝缘用途。当稻壳燃烧时，会生成结构化的二氧化硅材料副产物(经常大于90％)。与其它疏松的二氧化硅过滤介质相比，稻壳灰(RHA)具有更大的表面积和更多的孔-通道结构。这些特征使得RHA成为本发明优选的经过处理的过滤器基材。
硅藻土是沉积的二氧化硅沉积物，由变成化石的硅藻骨骼所构成，硅藻是一种在海洋或新鲜水环境中蓄积的单细胞藻类植物。蜂窝式二氧化硅结构赋予硅藻土有用的特征，如吸收容量和表面积、化学稳定性和低堆积密度。硅藻土包含90％的SiO2以及Al、Fe、Ca和Mg的氧化物。
珍珠岩是天然来源含硅火山岩的总称，热处理可膨胀。可制造重量小到2磅/立方英尺(32kg/m3)的膨胀的珍珠岩。由于珍珠岩是天然玻璃形式，将其归类为化学惰性，pH值约为7。珍珠岩由二氧化硅、铝、氧化钾、氧化钠、铁、氧化钙和氧化镁构成。研磨后，珍珠岩具有适用于从液体过滤粗制微观微粒的多孔结构，适用于深度过滤。
滑石是天然含水硅酸镁，3MgO·4SiO2·H2O。粘土是水合硅酸铝，Al2O3·SiO2·xH2O。上述二氧化硅过滤介质基材的混合物也可用于实现最佳过滤和成本效能。稻壳灰或硅藻土在表面硅烷处理之前任选地经历各种纯化和/或沥滤步骤。
通过将预定量的一种或多种官能化硅烷结合到表面来处理二氧化硅过滤介质。经过处理的二氧化硅过滤介质例如通过静电、亲水、疏水、亲和相互作用和/或物理包埋俘获组分。通过静电相互作用，带电的二氧化硅过滤介质结合样品中具有相反电荷的物质。通过亲水相互作用，具有强亲水性的二氧化硅过滤介质部分通过范德华相互作用吸引物质的极性基团。通过疏水相互作用，包含长烃链的二氧化硅过滤介质部分吸引物质的非极性基团。分离过程中，经过处理的二氧化硅过滤介质选择性俘获物质(需要或不需要的)，产生比未处理的二氧化硅过滤介质更好的分离特征。优选经过处理的二氧化硅过滤介质具有与未处理的二氧化硅过滤介质相类似或提高的流速。
二氧化硅过滤介质基材的形式可以是适于应用的任何形式，例如球形、纤维、纤丝、片、平板、盘、块、膜或其它。它们可制成筒、盘、板、膜、编织材料、滤网等。未处理的二氧化硅过滤介质的比表面积优选大于1m2/g；更优选大于10m2/g。优选具有较大表面积的二氧化硅过滤介质，因为其允许更多表面处理。此外，大孔介质可改善过滤速率。但是，较大孔径的材料具有相对较小的表面积。大表面积与大孔径的平衡产生有效的表面过滤处理和过滤速率。可通过诸如NMR(核磁共振和其它技术)、SEM(扫描电子显微镜)、BET(布-埃-特三氏方程式)表面积测定技术等来评价这些基材的表面特征，通过燃烧技术确定碳-氢-氮含量，这些都是本领域所公知的。
适用于二氧化硅过滤介质表面处理的硅烷可以是任何类型的有机硅烷，离子性或非离子性的。合适的硅烷的通式为(R1)xSi(R2)3-xR3，
其中，R1典型地是可水解部分(例如，烷氧基、卤素、羟基、芳氧基、氨基、羧基、氰基、氨酰基、或酰氨基、烷基酯或芳基酯)，它与二氧化硅过滤介质的活性基团反应；优选的可水解部分是烷氧基，例如甲氧基或乙氧基；
1≤X≤3，过滤颗粒与硅烷之间可形成一个以上硅氧烷键；
R2可以是处理过程中不与过滤表面反应的任何含碳部分，例如，取代或未取代的烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基或芳基烷芳基；
R3可以是任何含有机基团的部分，表面反应完成后它保持与硅原子化学结合，并且优选在过滤期间它可与感兴趣组分相互作用；例如，R3是氢、烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基、芳基烷芳基、烷氧基、卤素、羟基、芳氧基、氨基、烷基酯、芳基酯、羧基、磺酸酯、氰基、氨酰基、酰氨基、环氧、膦酸酯、异硫脲鎓(isothiouronium)、硫脲鎓、烷氨基、季铵、三烷基铵、烷基环氧、烷基脲、烷基咪唑或烷基异硫脲鎓；
其中，所述烷基、烯基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基和杂环基的氢任选地被卤素、羟基、氨基、羧基或氰基取代。
一个或多个硅烷可与含羟基多孔二氧化硅过滤介质的表面共价结合。二氧化硅过滤介质的表面积限制了硅烷结合的量。
本发明中适用于处理二氧化硅的硅烷优选具有一个或多个选自下组的部分：烷氧基、季铵、芳基、环氧、氨基、脲、甲基丙烯酸酯、咪唑、羧基、羰基、异氰基、异硫脲鎓(isothiorium)、醚、膦酸酯、磺酸酯、尿烷、脲基、硫氢基、羧酸酯和离子性物质。具有烷氧基部分的硅烷的例子有单、二、或三烷氧基硅烷。
具有季铵部分的硅烷的例子有3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基二甲基氯化铵、N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基氯化铵、或3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐。具有芳基部分的硅烷的例子有3-(三甲氧基甲硅烷基)-2-(对，间-氯甲基)-苯乙烷、2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮、((氯甲基)苯乙基)三甲氧基硅烷和苯基二甲基乙氧基硅烷。具有环氧部分的硅烷的例子有3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷和2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷。具有氨基部分的硅烷的例子有3-氨基丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺、2-(三甲氧基甲硅烷基乙基)吡啶、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯、三甲氧基甲硅烷基丙基聚乙烯亚胺和二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷。具有脲部分的硅烷的例子有N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)脲和N-1-苯乙基-N’-三乙氧基甲硅烷基丙基脲。具有甲基丙烯酸酯部分的硅烷的例子有甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯。具有硫氢基部分的硅烷的例子有3-巯基丙基三乙氧基硅烷。具有咪唑部分的硅烷的例子有N-[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]咪唑和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4，5-二氢咪唑。离子性硅烷的例子有3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基-乙二胺三醋酸三钠盐；三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐和3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯钠盐。具有羰基部分的硅烷的例子有3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐。具有异氰基部分的硅烷的例子有三(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)异氰尿酸酯和3-异氰氧基丙基三乙氧基硅烷。具有醚部分的硅烷的例子有二[(3-甲基二甲氧基甲硅烷基)丙基]-聚环氧丙烷。
具有磺酸酯部分的硅烷的例子有2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷。具有异硫脲鎓部分的硅烷的例子有三甲氧基甲硅烷基丙基异硫脲鎓氯化物。具有酰胺部分的硅烷的例子有三乙氧基甲硅烷基丙基乙基-氨基甲酸酯、N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺。具有尿烷部分的硅烷的例子有N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷和O-(炔丙氧基)-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)尿烷。
也可用一种以上的硅烷处理二氧化硅过滤介质，例如，3-氨基丙基三甲氧基硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；3-三氢甲硅烷基丙基甲基膦酸酯钠盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和(3-环氧丙氧基丙基)三甲氧基硅烷；3-三氢甲硅烷基丙基甲基膦酸酯钠盐和二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷；3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；2-(三甲氧基甲硅烷基乙基)吡啶和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮；3-巯基丙基三乙氧基硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；以及2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷和二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质具有选自下组的通式：颗粒-O-Si(R1)x(R2)3-xR3，
Figure A200580012738D00171
和
Figure A200580012738D00172
其中，R1、R2、R3和x如上所述，只要有不超过四个基团直接连接于硅原子(Si)即可；
R5、R6、R8独立地是氢、取代或未取代的烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基、醚、酯或芳基烷芳基；
R4、R7、R9是能够形成两个共价连接的取代或未取代的烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基或芳基烷芳基。
通过下面的一般反应方案，用硅烷处理具有表面硅醇的二氧化硅过滤介质：
颗粒-OH+(R1)xSi(R2)3-xR3→    颗粒-O-Si(R1)x-n(R2)3-xR3+nR1H
其中，颗粒-OH是具有表面反应位点的过滤颗粒。例如，R1是硅烷的甲氧基(CH3O-)或乙氧基(CH3CH2O-)易离去基团，它与颗粒表面的反应性羟基，或与未结合在表面上的其它反应性水解硅烷分子发生化学相互作用。1≤x≤3；n是反应的R1基团的数目，n≤x。
无水条件下，过量反应性硅烷的延时反应只能反应多孔材料上25-50％的总活性位点，这是因为固定化残基之间的空间位阻抑制了进一步反应，通往深埋的颗粒-OH基团也限制了进一步反应。在本发明中，这种空间上可到达的位点将称为“饱和覆盖度(saturation coverage)”，“饱和覆盖度”取决于特定残基的空间需要。注意，该定义适用于具有一个或多个易离去基团的反应性硅烷。在无水条件下，这些硅烷形成单层，不能形成不确定饱和度的多层。然而，在水性条件下，多官能化硅烷可以在表面上构建多层。
可通过基本上“湿法”或基本上“干法”进行二氧化硅过滤介质的表面硅烷处理。基本上湿法包括在溶剂(有机溶剂或水)中使硅烷反应到二氧化硅过滤介质上，任选地使用热量。热量或溶剂不是反应所必需；但是，热量或溶剂可改善反应速率和均匀表面覆盖度。基本上干法包括通过将硅烷与二氧化硅过滤介质直接混合，然后加热，在气相或高度搅拌的液相中将硅烷反应到二氧化硅过滤介质上。
用硅烷处理二氧化硅过滤介质的一种优选方法是将反应性硅烷逐渐加入到快速搅拌的溶剂中，使其与多孔二氧化硅过滤介质直接接触。另一种优选方法是将反应性硅烷蒸汽与二氧化硅过滤介质接触并反应，在气相中进行处理。例如，将多孔材料置于真空反应器中，真空干燥。然后，将快速反应性硅烷以蒸汽的形式进入真空室，与多孔材料接触；接触一定时间后，减压除去反应副产物。然后，释放真空，从室中取出多孔材料。
实际处理过程在1分钟到24小时的时间范围内进行。通常，在本发明中，处理优选在约30分钟到6小时内进行，以确保均匀处理助滤材料的表面。处理在0-400℃的温度范围内进行。处理优选在室温(22-28℃)到200℃的温度下进行。
本发明中使用的反应性硅烷的量取决于待反应的表面羟基的数目，以及硅烷的分子量。通常，由于潜在副反应的存在，使用相当于可达到的表面羟基的化学计量加上一些过量的反应性硅烷来处理表面羟基。若需要较厚的外表面处理，则使用更多的反应性硅烷。通常，使用0-10(优选)、0-20或1-50倍过量。然而，有时也使用1-500倍过量；在颗粒上进行更多处理。
具有可水解基团的硅烷与颗粒表面的颗粒-OH基团发生缩合，使得有机基团共价偶联于基材。例如，硅烷的烷氧基与颗粒表面的颗粒-OH基团发生化学反应。表面-硅烷相互作用快速且有效。例如，当使用具有季铵部分的硅烷时，质子化正电荷硅烷与颗粒的去质子化基团发生静电吸引，有效地促进快速和有效的反应。
优选硅烷-反应后的二氧化硅过滤介质具有可与感兴趣组分发生反应的官能化部分。官能化部分选自：季铵、环氧、氨基、脲、甲基丙烯酸酯、咪唑、磺酸酯和已知与生物分子反应的其它有机部分。此外，采用公知的方法，官能化部分可进一步反应，形成新的官能团，用于其它相互作用。制备具有官能化季铵或磺酸酯基团的硅烷-反应后的颗粒过滤介质的一般方案如下所述。
可一步法制备具有官能化季铵基团的硅烷-反应后的颗粒过滤介质。任选地，也可采用两步或三步法。例如，在两步法的第一步中，采用前述方法，使颗粒表面与氨基-官能化硅烷(R1)xSi(R2)3-xR4N(R5)2反应。下一步，使仲胺容易地与缩水甘油基三甲基氯化铵的环氧化物基团反应，这可方便地引入季铵官能团(见方案1)。
方案1：两步法合成季铵官能化助滤剂。
Figure A200580012738D00191
可以两步法制备具有官能化磺酸酯基团的硅烷-反应后的二氧化硅过滤介质。第一步，采用前述方法，使颗粒表面与环氧-官能化硅烷反应。第二步，使环氧官能团容易地与硫酸氢钠反应，产生磺酸酯-官能化二氧化硅过滤介质(见方案2)。焦亚硫酸钠(Na2S2O5)水解形成硫酸氢钠(NaHSO3)。
方案2：合成磺酸酯-官能化二氧化硅过滤介质
Figure A200580012738D00201
在分离应用中使用经过硅烷处理的颗粒，通过静电、和/或疏水、和/或亲水相互作用机制来俘获可溶性物质，同时除去微粒。经过处理的二氧化硅过滤介质的优点在于，在单一步骤中联用过滤和固相萃取而简化了分离过程。经过处理的二氧化硅过滤介质的所需品质是具有与未处理的二氧化硅过滤介质类似的流速或提高的流速(过滤性质)，以及在一次操作中通过吸附俘获可溶性物质的能力。
在本发明的一个实施方式中，特定带电荷的基团共价结合于二氧化硅颗粒表面，以静电方式俘获物质。带相反电荷的物质结合于经过处理的多孔表面。除静电吸引以外，还利用疏水或亲水配体，通过疏水或亲水相互作用来改善二氧化硅过滤介质的结合和/或释放特征。
采用本领域已知的方法如
Figure A200580012738D0020164257QIETU
分析仪，通过测定表面积、孔体积和孔径来表征经过处理的二氧化硅过滤介质。例如，可通过BET技术表征表面积。通过Barrett-Joyner-Halenda分析计算孔体积和孔直径。通过NMR谱确定具体官能团和分子结构。通过燃烧技术确定碳-氢-氮含量；由该分析信息，可计算颗粒表面的处理水平。
无需预过滤将样品如发酵液培养基施涂于经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质。在一个实施方式中，通过任何机械混合方式(例如搅动、搅拌、涡旋等)将样品与经过处理的二氧化硅过滤介质混合一段时间，以使组分充分结合于经过处理的二氧化硅过滤介质的表面。本领域技术人员将认识到，合适的结合时间取决于介质的孔的性质、靶分子或组分的大小、粘度以及其它已知的质量转移限制性原理。通常，结合发生的时间约为几分钟到几小时，但也可持续长达1-3天。然后，用过滤元件过滤混合物。在另一个实施方式中，无需将样品与过滤介质预混合，而将样品直接滤过含经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质的过滤元件。经过处理的二氧化硅过滤介质俘获微粒并结合某些可溶性组分，并使未结合的可溶性组分流过。使洗脱溶液流过过滤元件来提取结合的组分，在洗脱液中回收。有用的洗脱液包括盐溶液、高pH值(碱性)溶液、低pH值(酸性)溶液、高离液盐和其它试剂。或者，可使用普通有机溶剂或其混合物，只要它们不会对回收的感兴趣组分产生不良影响即可。合适的高盐包括NaCl、KCl、LiCl等。合适的高离液盐包括高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钾等。其它试剂包括脲和去污剂。在一些应用中，上述组分的组合也是合适的。或者，通过任何机械混合方式混合一段时间，用洗脱溶液再悬浮表面二氧化硅过滤介质(含微粒和结合的分子)，在过滤之前使结合的组分充分释放。
本发明的一个应用是，用经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质从所需产品中分离微生物。微生物污染是许多工业如酿造工业、酿酒业、果汁与饮料业、乳品业、工业酶和制药中的常见问题。申请者发现，本发明的经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质具有抗微生物活性。细菌与经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质接触后，总的活细菌计数显著降低。经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质还可俘获微生物。因此，过滤步骤可进一步除去产品中的微生物污染。
本发明还涉及具有选自以下通式的经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质：
颗粒-O-Si(R1)x(R2)3-xR3，
Figure A200580012738D00211
和
Figure A200580012738D00212
其中，R1是烷氧基、卤素、羟基、芳氧基、氨基、羧基、氰基、氨酰基、或酰氨基、烷基酯或芳基酯；
R2独立地是取代或未取代的烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基或芳基烷芳基；
R3是氢、烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基、芳基烷芳基、烷氧基、卤素、羟基、芳氧基、氨基、烷基酯、芳基酯、羧基、磺酸酯、氰基、氨酰基、酰氨基、环氧、膦酸酯、异硫脲鎓、硫脲鎓、烷基氨基、季铵、三烷基铵、烷基环氧、烷基脲、烷基咪唑或烷基异硫脲鎓；其中，所述烷基、烯基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基和杂环基的氢任选地被卤素、羟基、氨基、羧基或氰基取代；
R5、R6和R8独立地是氢、取代或未取代的烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基或芳基烷芳基；
R4、R7、R9是能够形成两个共价连接的取代或未取代的烷基、烯基、烷芳基、烷基环烷基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基、杂环基、环烷基芳基、环烯基芳基、烷基环烷基芳基、烷基环烯基芳基或芳基烷芳基基团；
其中，所述二氧化硅过滤介质是稻壳灰或燕麦壳灰。
本发明中硅烷-反应后的二氧化硅过滤介质优选具有官能化部分，其可与感兴趣的组分反应。官能化部分选自：季铵、环氧、氨基、脲、甲基丙烯酸酯、咪唑、磺酸酯以及已知与生物分子反应的其它有机部分。
下面的实施例进一步说明本发明。这些实施例仅仅是为了阐明本发明，而不能解释为限制性的。实施例1-5描述了二氧化硅过滤介质的表面处理。实施例6-14描述了使用经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质从含微粒物质和可溶性组分的样品中分离一种或多种感兴趣组分。实施例15-22描述了经过硅烷处理的二氧化硅过滤介质的抗微生物活性和过滤结果。
实施例
实施例1：在批量过程中用三烷氧基硅烷制备经过处理的稻壳灰介质(tRHA)
处理设备由2升的3-颈圆底反应烧瓶、Teflon轴机械搅拌器、温度计、冷凝器和烧瓶周围的加热套组成。反应烧瓶装有50g未磨碎的RHA二氧化硅过滤介质(表面积约为30m2/g)，和250mLIPA(异丙醇)/甲苯(1:2)溶剂混合物。不总是需要IPA，也可仅在水中进行该反应。表1显示了每个例子的反应条件。将混合物在室温下搅拌几分钟，然后将适量硅烷以缓慢的加入速率直接加入到混合物中进行表面改性，同时保持良好混合。加入计算产生多层覆盖(高水平处理)的250％的适量硅烷，或计算产生单层覆盖(低水平处理)的85％的硅烷量，硅烷的量由其纯度校正。负载浓度也如表1所示。接着，在N2保护下回流加热(约85℃)混合物，主要是为了安全且对反应结果没有其它影响，虽然加热不是必需的。搅拌回流2小时后，冷却经过处理的浆状混合物。然后，将其转移至配备有Whatman滤纸的瓷布氏(
Figure A200580012738D0023164355QIETU
)漏斗中，连接真空吸滤瓶(filter flask)。过滤经过处理的滤浆，用150mL甲苯洗涤两次，用约150mLIPA洗涤两次。然后，在通风橱中干燥样品约24小时。将经过处理的过滤介质转移至Pyrex容器中，覆盖上具有一些注射器针头钻孔的石蜡膜，然后在真空烘箱中以60℃干燥样品2-4小时。测定干燥样品的表面积、孔结构和碳-氢-氮含量。
表1：处理组成和条件的总结
在低碳、来自生产商的未磨碎(ungrounded)RHA上进行处理。
 
样品编号 硅量g 硅烷类型 处理条件 硅烷纯度％ 加入的硅烷g
123456789101112131417181920 5050505050505050505050505050100100100100 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵3-(三甲氧基甲硅烷基)-2-(对，间-氯甲基)-苯乙烷3-(三甲氧基甲硅烷基)-2-(对，间-氯甲基)-苯乙烷3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基氯化铵N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基氯化铵3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐3-氨基丙基三甲氧基硅烷3-氨基丙基三甲氧基硅烷N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷 H2O，回流H2O，室温甲苯，回流，化学计量的H2O甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流，终点时化学计量的H2O甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流 42％42％42％42％42％42％90％90％32％32％50％50％40％40％100％100％97％97％ 15.0615.0615.0615.0615.067.031.474.3313.304.997.322.496.6919.677.522.569.623.27
2122 5050 苯基二甲基乙氧基硅烷苯基二甲基乙氧基硅烷 甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流 100％100％ 1.820.76
2324252627 5050505050 甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)脲三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺二(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷N-[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]咪唑 甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流甲苯，IPA，回流 98％49％98％58％96％ 7.665.442.734.962.88
实施例2：制备不同类型的经过处理的二氧化硅过滤介质
使用其它基材，即高碳稻壳灰、不同类型的超纯硅藻土(Celpure P1000，Celpure P65)、Celite 545(标准硅藻土助滤剂)、珍珠岩和LRA II(非二氧化硅基的类脂吸附剂)。表2总结了这些样品的处理条件和组成。
表2：不同基材的组成和处理条件
 
二氧化硅样品编号 基材介质类型 硅量g 处理类型 处理条件 硅烷纯度％ 负载(×单层覆盖) 加入的硅烷g
28 AgriSilicasSTD 150 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 150％ 10.53
29 CelpureP1000 100 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 180％ 0.51
30 CelpureP1000 50 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 1070％ 1.53
31 CelpureP1000 50 Z-6032(SMAEAPTMS) 甲苯，IPA，回流 32％ 200％ 1.46
32 珍珠岩 50 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 200％ 0.24
33 珍珠岩 50 Z-6032(SMAEAPTMS) 甲苯，IPA，回流 32％ 200％ 1.21
34 Celite 545 50 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 200％ 0.40
35 Celite 545 50 Z-6032(SMAEAPTMS) 甲苯，IPA，回流 32％ 200％ 2.05
36 Celpure P65 50 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 200％ 0.61
37 Celpure P65 50 Z-6032(SMAEAPTMS) 甲苯，IPA，回流 32％ 200％ 3.13
38 LRA 11 50 AEAPTMS(A0700) 甲苯，IPA，回流 97％ 120％ 8.96
39 LRA 11 50 Z-6032(SMAEAPTMS) 甲苯，IPA，回流 32％ 120％ 45.80
Z-6032：3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐
AEAPTMS：N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷
实施例3：两步法合成亲水季铵官能化助滤剂(过滤介质样品40和42)
处理设备包括2L3-颈圆底反应烧瓶、Teflon轴机械搅拌器、温度计、冷凝器和烧瓶周围的加热套。反应烧瓶装有50g经过氨基-官能化预处理的RHA(样品17或19)二氧化硅过滤介质，和200ml IPA溶剂。将混合物在室温下搅拌几分钟，然后将适量缩水甘油基三甲基氯化铵(样品17是2.46g，样品19是2.02g)以缓慢的速率直接加入到混合物中进行表面改性，同时保持良好混合。在N2保护下回流加热反应混合物。搅拌回流4小时后，冷却经过处理的浆状混合物。然后，将其转移至配备有Whatman滤纸的瓷布氏(
Figure A200580012738D0026164636QIETU
)漏斗中，连接真空吸滤瓶。过滤经过处理的滤饼，每次用约150ml DI水洗涤四次。然后，在通风橱中干燥样品约24小时。然后，将经过处理的二氧化硅过滤介质转移至Pyrex容器中，覆盖上具有一些注射器针头钻孔的石蜡膜，然后在真空烘箱中以60℃干燥样品2-4小时。测定干燥样品的表面积、孔结构、碳-氢-氮含量、29Si NMR。
实施例4：两步法合成亲水磺酸酯-官能化助滤剂(过滤介质样品41)
处理设备由2升的3-颈圆底反应烧瓶、Teflon轴机械搅拌器、温度计、冷凝器和烧瓶周围的加热套组成。反应烧瓶装有50g经过环氧-官能化预处理的RHA二氧化硅过滤介质(样品15)，和200mlIPA:H2O(5:1)溶剂。将混合物在室温下搅拌几分钟，然后在N2保护下将反应混合物加热至70℃。从另一个漏斗在1-2小时的范围内，以缓慢的加入速率将0.55g焦亚硫酸钠、0.07g亚硫酸钠催化剂和5g水的混合物直接加入到混合物中，进行表面改性，同时保持良好混合。然后将温度升高至约80℃，直到反应完全。碘量滴定残留的NaHSO3来监测反应。搅拌回流约22小时后，冷却经过处理的浆状混合物。将其转移至配备有Whatman滤纸的瓷布氏(
Figure A200580012738D0026164636QIETU
)漏斗中，连接真空吸滤瓶。过滤经过处理的滤饼，每次用约150ml DI水洗涤四次。然后，在通风橱中干燥样品约24小时。然后，将经过处理的助滤剂转移至Pyrex容器中，覆盖上具有一些注射器针头钻孔的石蜡膜，然后在真空烘箱中以60℃干燥样品2-4小时。测定干燥样品的表面积、孔结构、碳-氢-氮含量、29Si NMR。表3总结了两步法的组成和条件。
表3：两步法的组成和处理条件。
 
样品编号 硅量g 第二步反应物 处理条件 硅烷纯度％ 加入的硅烷
40 50 缩水甘油基三甲基氯化铵 IPA，回流 75％ 2.02
41 50 Na2S2O5/Na2SO3 IPA，水，回流 100％ 0.55/0.07
42 50 缩水甘油基三甲基氯化铵 IPA，回流 75％ 2.46
经过处理的二氧化硅过滤介质的特征：BET表面积、孔体积、孔直径采用
Figure A200580012738D0026164734QIETU
 ASAP 2010分析仪测定表面积和孔隙率。在分析之前，将样品在150℃、真空下脱气，直到达到恒压。在分析步骤中，77°K下样品吸附N2气，由被吸附物的体积计算表面积。采用ASAP-2010软件，整合BET方程，获得BET参数。由等温线的吸附部分，计算表面积范围为0.05≤P/Po≤0.3。采用Barrett-Joyner-Halenda分析计算孔体积和孔直径。
NMR
采用Varian VT CPMAS探头和7mm电动机，在Unity Plus 400MHz谱仪上，通过29Si固相NMR谱识别特定官能团和分子结构。
碳-氢-氮(CHN)
在Robertson Microlit实验室中，通过燃烧技术测定CHN含量。由该分析信息，计算表面处理水平。
表4总结了经过处理的二氧化硅样品的特征数据
表4：经过处理的二氧化硅样品的特征数据总结
Figure A200580012738D00281
实施例5：二氧化硅过滤器的组成和处理条件及其特征
表5A-5C总结了稻壳灰的其它组成和处理条件及其特征
表5A
Figure A200580012738D00291
Figure A200580012738D00301
表5B
 
样品 二氧化硅 硅烷类型 处理条件 硅烷纯度 加入的硅烷g ％C 配体密度
编号 g ％ g
54 500 三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐 甲苯，回流，H2O 45.0 72.46 1.86 4.79
55 500 N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷 甲苯，回流，H2O 95.0 59.68 2.34 4.39
56 500 二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷 甲苯，回流，H2O 57.6 22.55 0.93 1.26
57 500 ((氯甲基)苯乙基)三甲氧基硅烷 甲苯，回流，H2O 90.0 8.70 1.05 1.55
58 500 N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺 甲苯，回流，H2O 50.0 31.64 1.12 2.1
59 500 3-巯基丙基三乙氧基硅烷 甲苯，回流，H2O 95.0 9.95 0.81 3.59
60 500 N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺 甲苯，回流，H2O 100.0 12.16 1.16 0.21
61 500 3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐 甲苯，回流，H2O 95.0 12.73 0.76 1.46
62 500 三(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)异氰尿酸酯 甲苯，回流，H2O 95.0 34.18 1.28 2.13
63 500 2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮 甲苯，回流，H2O 95.0 23.23 1.61 1.74
64 500 脲基丙基三甲氧基硅烷 甲苯，回流，H2O 100.0 11.72 0.86 2.03
65 500 3-异氰氧基丙基三乙氧基硅烷 甲苯，回流，H2O 95.0 6.90 0.81 5.31
66 500 N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯 甲苯，回流，H2O 100.0 6.08 0.87 3.26
67 500 二[(3-甲基二甲氧基甲硅烷基)丙基]-聚环氧丙烷 甲苯，回流，H2O 100.0 18.92 1.72 14
表5C
Figure A200580012738D00311
Figure A200580012738D00321
Figure A200580012738D00331
Figure A200580012738D00341
根据初始稻壳灰上残留的碳校正为0.43％C的配体密度。混合的硅烷样品配体密度基于第一硅烷。
实施例6：用于蛋白质结合与释放的、经过表面处理的稻壳灰
目的
测定使用经过表面处理的稻壳灰(RHA)的蛋白质结合与释放。蛋白质溶液不含微粒，来源于藤黄微球菌发酵。
表6总结了过滤介质样品及其表面处理。
表6
 
样品名称 处理
6 经过3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵处理的RHA
4 经过3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基十八烷基-二甲基氯化铵处理的RHA
来自生产商的未磨碎的RHA 未处理
FW12 市售硅藻土(Eager Picher)
HQ50 市售季铵离子交换树脂(PerSeptive BioSystems)
方法
1.称取2g的各个样品于50毫升的锥形试管中。
2.加入25mL 25mM Tris-HCL，pH8.4缓冲液。
3.翻转过夜，混合样品与缓冲液。
4.将各个湿润样品转移至15mL锥形试管中，然后在2500g下离心5分钟，倾滗出上清液。使用所得样品进行下述结合试验。
5.蛋白质试验溶液的描述与制备
来源：采用以下步骤回收的不含藤黄微球菌微粒的浓缩发酵液：
·用200ppm溶菌酶(来自鸡蛋白)细胞溶解发酵液。
·用聚阳离子聚合物絮凝溶解的发酵液，并过滤以除去微粒。
·超滤脱水，浓缩微粒发酵液(Prep/ScaleTM TFF，Millipore)
6.用24份25mM Tris-HCl pH8.4缓冲液调节上述溶液。
7.将5mL蛋白质试验溶液加入到各个含有经过表面处理的稻壳灰的试管中。
8.翻转混合试管90分钟。
9.将混合的试管在2500g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的组分被称为“流出液或FT”。
10.将5mL 25mM Tris-HCl pH8.4缓冲液加入到各试管中，翻转混合45分钟。
11.将试管在2500g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的组分被称为“洗液”。
12.加入5mL洗脱缓冲液(含2M NaCl的25mM Tris-HCl pH8.4)，混合30分钟。
13.各试管中加入0.5mL 0.5M的NaOH。
14.将试管翻转混合90分钟。
15.将试管在2500g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的组分被称为“洗脱液”。
16.通过SDS-PAGE凝胶电泳(根据美国专利5,578,180描述的NOVEXelectrophoresis GmbH，德国的NuPAGE电泳系统的方法)，测定所有组分。
观察结果
图1A(未结合组分的结合与分析)
通过分析流出液和洗脱液测定未结合的样品，表示洗脱过程中释放的所有或一部分未结合样品。
·FW 12(市售硅藻土)不结合进样液(feed)中的任何蛋白质(道#3与道#2进行比较)。所有谱带的强度稍微降低是由于用于预润湿试验样品的溶液的稀释所致。
·未处理的RHA选择性结合大于6kd小于14.4kd的蛋白质谱带(道#4与道#2进行比较)。所有谱带的强度稍微降低是由于用于预润湿试验样品的溶液的稀释所致。
·HQ50(市售季铵离子交换树脂)结合测试溶液中的大多数蛋白质，除了14.4kd以下的之外(道#5与道#2进行比较)
·经过处理的RHA样品4选择性结合97kd区域附近及以上、55.4和36.5kd之间、21kd附近和14.4kd的蛋白质。注意，与在HQ50的情况下一样，不俘获14.4kd以下的谱带。总的蛋白质谱带强度比未处理的稻壳灰和FW 12要低，表明经过处理的RHA的结合较多。
·经过处理的RHA样品6显示与样品4类似的蛋白质结合选择性，但具有较低的结合容量。注意，与在HQ50的情况下一样，不俘获14.4kd以下的谱带。总的蛋白质谱带强度比未处理的稻壳灰和FW12要低。
图1B(结合组分的释放与分析)
·FW12洗脱液包含痕量蛋白质，很可能来自液体的物理包埋/携带(道#2)。
·结合于未处理的RHA的小于14.4且大于6kd的蛋白质谱带被释放(道#3)。
·释放所有被HQ50俘获的蛋白质(道#4)。
·样品4的洗脱液包含116kd以上、55Kd附近及以下以及6kd附近的蛋白质谱带。36.5kd以上的谱带保持结合(道#5)。
·样品6的洗脱液主要包含116kd以上和55kd附近的谱带。其它结合物保持结合或是含量太低以致于无法通过分析检测到(道#6)。
未处理的硅藻土不具有蛋白质结合能力。未处理的稻壳灰显示一定的蛋白质结合能力。两种经过处理的稻壳灰，样品4和6显示蛋白质结合能力。
实施例7：用于蛋白质结合和释放的、经过表面处理的稻壳灰
目的
使用其它经过表面处理的稻壳灰测定蛋白质结合与释放。蛋白质溶液不含微粒，来源于藤黄微球菌发酵。
表7总结了过滤介质样品及其表面处理。
表7
 
样品名称 处理
7 经过3-(三甲氧基甲硅烷基)-2-(对，间-氯甲基)-苯基乙烷处理
8 经过3-(三甲氧基甲硅烷基)-2-(对，间-氯甲基)-苯基乙烷处理
9 经过3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐处理
10 经过3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐处理
11 经过N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基氯化铵处理
12 经过N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-三甲基氯化铵处理
方法
与实施例6所述相同。
观察结果
样品7的蛋白质结合与释放(图2A)
Figure A200580012738D0037190944QIETU
选择性结合所有MW低于55kd的谱带，除了21.5kd附近的谱带之外(道2与道3进行比较)。
Figure A200580012738D0037191013QIETU
洗液具有与流出液类似的特征。
洗脱液具有55kd附近非常浅的谱带，但其它谱带不多。其它谱带牢固结合，所用条件下不被洗脱。
样品8的蛋白质结合与释放(图2A)
与上述样品7的观察结果相似。
样品9的蛋白质结合与释放(图2B)
几乎所有蛋白质都结合，除14kd以下的谱带之外(道1与道2进行比较)
Figure A200580012738D0037191055QIETU
洗液部分中未检测到蛋白质谱带。
Figure A200580012738D0037191058QIETU
洗脱液部分主要包含55kd附近的谱带，其它谱带保持结合。这说明，55kd附近谱带的选择性释放导致蛋白质纯度>谱带强度的90+％.
样品10的蛋白质结合与释放(图2B)
与上述样品9的观察结果类似。
样品11的蛋白质结合与释放(图2C)
Figure A200580012738D00382
除一些低MW谱带之外，几乎所有的谱带都结合。这显示选择性蛋白质结合(道1与道3进行比较)。
Figure A200580012738D00383
洗液部分中未检测到蛋白质谱带。
Figure A200580012738D00384
在所用条件下，大多数结合的谱带被洗脱(道5)。
Figure A200580012738D00385
与其它经过表面处理的稻壳灰相比，具有相对较高的结合容量。
样品12的蛋白质结合与释放(图2C)
Figure A200580012738D00386
与上述样品9的观察结果类似。
结论：
经过表面处理的稻壳灰观察到独特的蛋白质结合与释放。观察到选择性结合(样品7和样品8)。选择性释放(样品9和样品10)产生>90％蛋白质纯度部分。
实施例8：用于蛋白质结合与释放的、经过表面处理的稻壳灰
目的
使用其它经过表面处理的稻壳灰(RHA)测定蛋白质结合与释放。实验设计基于离子交换。蛋白质溶液不含微粒，来源于藤黄微球菌发酵。
表8总结了过滤介质样品及其表面处理。
表8
 
经过处理的稻壳灰标识 表面处理
14 经过3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐处理
13 经过3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐处理
17 经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理
18 经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理
19 经过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理
20 经过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理的表面
方法
1.称取2g的各经过表面处理的稻壳灰于50mL锥形试管中，加入40mL平衡缓冲液(25mM Tris-HCl pH8.4)。翻转混合试管30分钟。
2.将试管在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。
3.蛋白质试验溶液的来源：如实施例1所述，通过用10ppm的蛋白酶部分消化，制备不含藤黄微球菌微粒的浓缩发酵液。
4.用24份25mM Tris-HCl pH8.4缓冲液调节上述溶液。
5.将20mL蛋白质试验溶液加入到各个制备的经过表面处理的稻壳灰上。
6.翻转混合样品30分钟。
7.将样品在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的部分被称为“流出液或FT”。
8.将20mL 25mM Tris-HCl pH8.4缓冲液加入到样品中，翻转混合15分钟。
9.将样品在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的部分被称为“洗液”。
10.将20mL洗脱缓冲液(含1M NaCl的25mM Tris-HCl pH8.4)加入到各个样品中，翻转混合样品30分钟。
11.将样品在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的部分称为“洗脱液#1”。
12.用10mL相同的洗脱缓冲液+50mM NaOH重复步骤9和10。收集的部分被称为“洗脱液#2”。
13.通过SDS-PAGE凝胶电泳分析所有部分。
观察结果
样品14的蛋白质结合与释放(图3A)
Figure A200580012738D00391
流出部分具有较低的蛋白质谱带强度，表示样品14具有较好的结合容量。(道#6与道#1进行比较)
14.4kd以下的谱带保留在流出液中，表明选择性结合。
Figure A200580012738D00393
结合的蛋白质被1M NaCl部分洗脱。
Figure A200580012738D00394
将NaOH加入到含1M NaCl的缓冲液中可进一步洗脱结合的蛋白质。
样品13的蛋白质结合与释放(图3B)
Figure A200580012738D00401
所有加入的蛋白质都结合(道#3与道#2进行比较)。
Figure A200580012738D00402
只有少量结合的蛋白质被1M NaCl洗脱(道#5)，说明结合不能离子交换。
Figure A200580012738D00403
在1M NaCl洗脱缓冲液中加入苛性碱可成功洗脱结合的蛋白质。
Figure A200580012738D00404
行为类似于样品14
样品17的蛋白质结合与释放(图3C)
Figure A200580012738D00405
如道#7的流出部分所示，发生较好的结合。
Figure A200580012738D00406
选择性地不结合14kd以下的蛋白质。
Figure A200580012738D00407
进行洗脱需要高NaCl/NaOH。
样品18的蛋白质结合与释放(图3C)
Figure A200580012738D00408
如道#1的流出部分所示，发生较好的结合。
选择性地不结合14kd以下的蛋白质。
Figure A200580012738D004010
进行洗脱需要高NaCl/NaOH。
Figure A200580012738D004011
结果类似于样品17的结果。
样品19的蛋白质结合与释放(图3D)
较好的结合，如具有低蛋白质谱带的道#7的流出部分所示。
Figure A200580012738D004013
选择性地不结合14kd以下的谱带。
Figure A200580012738D004014
大多数结合的蛋白质在1M NaCl条件下洗脱。
Figure A200580012738D004015
将NaOH加入到含1M NaCl的缓冲液中可进一步洗脱55kd附近的谱带。
样品20的蛋白质结合与释放(图3E)
Figure A200580012738D004016
较好的结合，如流出部分的低蛋白质谱带所示(道#3)。
Figure A200580012738D004017
洗涤过程中的一些泄漏(道#4)。
Figure A200580012738D004018
选择性地不结合14kd以下的谱带(道#3)。
Figure A200580012738D004019
大多数结合的蛋白质在1M NaCl条件下洗脱(道#5)。
Figure A200580012738D004020
结果类似于样品19的结果。
结论
对于上述测定的经过表面处理的稻壳灰样品来说，在适合基于阴离子交换的结合条件下，高盐和/或高pH值的释放条件下测定样品，观察到三种一般结合/释放行为：
较好的结合，用NaCl/NaOH洗脱：
样品14(经过3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐处理)
样品13(经过3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐处理)
样品17(经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理)
样品18(经过3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理)
较好的结合，用NaCl洗脱：
样品19(经过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理)
样品20(经过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理)
设计结合/释放试验来测定阴离子交换行为。观察结果与RHA表面改性一致。
样品14和样品13的反应与离子交换和疏水特征的组合相一致。
样品17和样品18还显示混合行为。
在结合和释放方面，样品19和样品20都具有类似于阴离子交换行为的典型特征。
实施例9：用于蛋白质结合和释放(阳离子交换)的、经过表面处理的稻壳灰
目的
使用经过表面处理的稻壳灰测试蛋白质结合与释放。蛋白质溶液不含微粒，来源于黑曲霉素发酵。
表9总结了样品名称及其表面处理。
表9
 
经过处理的稻壳灰标识 表面
41 第一步经过3-炔丙氧基丙基三甲氧基硅烷处理，第二步经过Na2S2O5处理
来自生产商的未磨碎RHA 未处理
多孔HS50 市售-SH阳离子交换树脂(PerSeptive BioSystems，Farmington，MA)
方法
1.将2g的各个经过表面处理的稻壳灰置于50mL锥形试管中，加入40mL平衡缓冲液(100mM醋酸钠，pH4.0)。翻转混合试管30分钟。
2.将试管在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。
3.蛋白质试验溶液的描述与制备：
a.来源：采用以下步骤回收的不含黑曲霉素微粒的浓缩发酵液：
i.过滤发酵液以除去细胞。
ii.超滤(脱水(Prep/ScaleTM TFF，Millipore)不含细胞的发酵液以脱水。
b.用14份100mM醋酸钠，pH4.0缓冲液调节上述溶液。
4.将20mL蛋白质试验溶液加入到各个制备的经过表面处理的稻壳灰上。
5.翻转混合样品70分钟。
6.将样品在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的部分被称为“流出液或FT”。
7.将20mL 100mM醋酸钠pH4.0缓冲液加入到各样品中，翻转混合样品15分钟。
8.将样品在2500×g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的部分被称为“洗液#1”。
9.重复步骤7和8，收集的部分被称为“洗液#2”。
10.加入20mL洗脱缓冲液(含1M NaCl的100mM醋酸钠pH4.0缓冲液)，翻转混合样品60分钟。
11.将样品在2500g下离心5分钟，倾滗出上清液。收集的部分被称为“洗脱液#1”。
12.用10mL相同的洗脱缓冲液+50mM NaOH重复步骤9和10。收集的部分被称为“洗脱液#2”。
13.通过SDS-PAGE凝胶电泳分析所有部分。
观察结果
样品41的蛋白质结合与释放(图4A)
Figure A200580012738D00431
选择性结合97kd附近和31kd以下的谱带。
Figure A200580012738D00432
“洗液#1和#2”中分别检测到相对较低到低至为零的蛋白质谱带(分别参见道#3和道#4)，提示结合是特异的/强的。
Figure A200580012738D00433
结合的蛋白质在含1M NaCl的缓冲液中洗脱。
未处理RHA的蛋白质结合与释放(图3A)
Figure A200580012738D00434
流出液中不存在97kd附近和31kd以下的谱带。但是，在洗脱液#1或洗脱液#2中都没能洗脱出蛋白质。
多孔HS50的蛋白质结合与释放(图4B)
Figure A200580012738D00435
选择性结合97kd附近和31kd以下的谱带。
Figure A200580012738D00436
“洗出液#1和#2”中分别检测到相对较低到低至为零的蛋白质谱带(分别参见道#3和道#4)，提示结合是特异的/强的。
Figure A200580012738D00437
结合的蛋白质在含1M NaCl的缓冲液中洗脱。
结论
经过表面处理的稻壳灰样品41具有非常类似于阳性对照的结合和释放特征。
实施例10：用于蛋白质结合和释放(离子交换)的、经过表面处理的二氧化硅过滤介质
目的
使用经过表面处理的稻壳灰测试蛋白质结合与释放。实验设计基于离子交换。蛋白质溶液不含微粒，来源于藤黄微球菌发酵。
表10总结了样品名称及其表面处理
表10
 
样品名称 描述
样品42 第一步3-氨基丙基三氧基硅烷处理，第二步缩水甘油基三甲基氯化铵处理
样品40 第一步N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理，第二步缩水甘油基三甲基氯化铵处理
样品34 经过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理的Celite545
样品29 经过N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷处理的CelpureP1000(市售硅藻土)
AgriSilcasRHA 未处理
Celite512 未处理的市售硅藻土(World Minerals)
方法
除样品29、样品30和CelPure P100外的所有样品与实施例8相同，样品29、样品30和CelPure P100具有以下变化：
蛋白质试验溶液稀释100倍(与25倍相比)
重复步骤4和5，收集的洗液部分被称为“洗液#2”。
观察结果
在所用试验条件下，蛋白质试验溶液的量是过量的。结果，所有流出部分具有与进样试验溶液相似的蛋白质谱带样式。尚未尝试进行对待测各个二氧化硅过滤介质样品的蛋白结合能力的定量描述。以下观察结果仅仅是基于洗脱部分。
样品42(图5A)
大多数结合蛋白质在1M NaCl条件下洗脱(道#5)。
样品40(图5B)
大多数结合蛋白质在1M NaCl条件下洗脱(道#5)。
样品34(图5C)
1M NaCl条件下没能洗脱显著量的蛋白质。
然后在高pH值条件下洗脱了少量蛋白质。
样品29(图5D)
洗脱部分都包含蛋白质，这些部分的组成相似(道#5是1M NaCl洗脱，道#6是高pH值洗脱)。
未处理的AgriSilica RHA(图5B)
洗脱部分包含蛋白质，尤其是MW低于14.4kd的蛋白质。
Celite 512(图5C)
1M条件下洗脱的部分包含97kd附近、55kd附近及以下，尤其是14.4kd和6kd之间的蛋白质(道#10)。
结论
样品40和42(经过表面处理的稻壳灰)以及样品29和34(经过表面处理的硅藻土)显示超过对应的未处理类似物的蛋白质结合能力。
实施例11：用于动态蛋白质结合与释放(离子交换)的、经过表面处理的稻壳灰
目的
使用经过表面处理的稻壳灰样品9测定动态蛋白质结合与释放。实验设计基于离子交换。蛋白质溶液不含微粒，来源于藤黄微球菌发酵。
方法
1.将6g样品9置于50mL锥形试管中。
2.加入50mL平衡缓冲液(25mM Tris-HCl pH8.4)，翻转混合样品30分钟。
3.将样品在2500g下离心5分钟，倾滗出上清液。
4.加入30mL平衡缓冲液，翻转样品充分混合。
5.将样品倒入重力流动柱中。
6.将经过表面处理的稻壳灰沉降和填充至10mL体积。
7.将预滤器置于填充床上。
8.加入20mL平衡缓冲液。
9.加入25mL蛋白质试验溶液(以与实施例6相同的方法制备)。
10.将流出部分收集在15mL锥形试管中。
11.加入30mL平衡缓冲液，将“洗液”收集在15ml锥形试管中。
12.相继采用以下步骤选择和收集多个洗脱液，如表11所示：
a.加入含0.2M NaCl的平衡缓冲液。
b.加入含2M NaCl的平衡缓冲液。
c.加入0.1M NaOH。
13.通过SDS-PAGE凝胶电泳分析所有部分。
观察结果(图6)
Figure A200580012738D00461
负载的溶液量高于容量，因而FT部分中有明显穿透(道3、4和5)。
Figure A200580012738D00462
经过表面处理的稻壳灰样品9具有优良流动性。重力流动可方便地实现所有上述步骤。
Figure A200580012738D00463
图6显示10mL载量下，进样溶液突破10mL填充的样品9。
Figure A200580012738D00464
试验的结合条件下，样品9选择性结合96kd附近谱带、55kd附近谱带、55kd下面的两条谱带、14.4kd与6kd附近及它们之间谱带的蛋白质。
Figure A200580012738D00465
三次洗脱步骤后观察到以下结果：
0.2M条件下，洗脱三条谱带(97kd附近、55kd附近和14.4kd以下)。
2M NaCl条件下，洗脱97kd附近和55kd附近的谱带。
0.1M NaOH条件下，洗脱55kd附近、31kd谱带以下和14.4kd附近的蛋白质。
表11显示了结合试验收集的部分的总结。
表11
 
部分 体积(mL)
进样 负载25mL
FT#1 10.5mL
FT#2(负载10mL进样液之后) 10mL
FT#3(负载14.5mL之后) 4.5mL
FT#4(负载25mL进样液之后) 10mL
洗液 30mL
洗脱液#1(0.2M NaCl) 10mL
洗脱液#2(2M NaCl) 10mL
 
洗脱液#3(第一0.1M NaOH部分，颜色非常深) 4.5mL
洗脱液#4(第二0.1M NaOH) 3.5mL
结论
本实施例表明，填充床色谱模式中可使用经过表面处理的稻壳灰来测定蛋白质结合与释放，经过表面处理的稻壳灰仅用作具有重力流动的助滤剂。结合与释放特征类似于批量模式的特征。本实施例还表明，使用不同的洗脱缓冲液可实现选择性洗脱。
实施例12：用于同时俘获微粒与俘获/释放可溶性物质的、经过表面处理的稻壳灰。
目的
测定经过表面处理的稻壳灰同时进行微粒过滤和蛋白质结合与释放的性质。经过表面处理的稻壳灰被称为样品19，显示其具有阴离子交换特征(见实施例8)。也平行测定未处理的稻壳灰。
缓冲液
平衡缓冲液：25mM Tris-HCl，pH8.4。
洗脱缓冲液：25mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.4；1M NaOH；1M HCl
试验溶液
根据以下方法制备被称为“进样液”的絮凝的藤黄微球菌发酵液：
Figure A200580012738D00471
收集后，用100ppm溶菌酶(鸡蛋白)细胞溶解发酵液。
Figure A200580012738D00472
用聚阳离子聚合物絮凝细胞溶解的发酵液。
Figure A200580012738D00473
试验之前用1份平衡缓冲液稀释絮凝的样品。
方法
1.经过表面处理的稻壳灰的制备：
将5g未处理的RHA各自置于两个50mL锥形试管中。
加入40mL平衡缓冲液，翻转混合试管30分钟。
2.将试管在2500×g下离心5分钟，在步骤#1中倾滗，作为未处理的稻壳灰。
3.将50mL制备的试验溶液“进样液”加入到各个制备的稻壳灰中。
4.室温下翻转混合试管30分钟。
5.采用台式离心机离心1mL少量样品(4分钟)，收集上清液(“称为台式FT”)。
6.制备0.45μm 250mL-Nalgen元件用于过滤：
元件连接于外壳(house)真空出口。
将其它制备的稻壳灰悬浮于50mL平衡缓冲液中。
将悬浮液倒入过滤元件，施加(外壳)真空以形成前期外皮(饼)。
清空滤液储槽。
再连接储槽用于过滤试验。
7.将步骤4的混合有稻壳灰的蛋白质溶液倒入制备的过滤元件中，再施加真空启动过滤。收集的滤液样品被称为“FT滤液”。
8.暂停真空，加入50mL平衡缓冲液，搅拌混合。再施加真空以启动过滤。收集的滤液样品被称为“洗液”。
9.用50mL洗脱缓冲液重复步骤8，混合15分钟后，再施加真空以启动过滤。收集的滤液样品被称为“洗脱液”。
10.用带MES运行缓冲液的4-12％ Tris-Bis SDS-PAGE凝胶电泳分析所有部分(方法见独立的Excel文件)。
11.对未处理的稻壳灰重复步骤1-10。
观察结果/讨论
1.经过表面处理的稻壳灰样品19具有比未处理的稻壳灰略薄的饼厚度。
2.来自两种稻壳灰的所有收集的部分(FT滤液、洗液和洗脱液)澄清，不含微粒。
3.经过表面处理的稻壳灰样品19具有相当于未处理的稻壳灰的微粒过滤速率：
样品19：12.8mL/分钟
未处理的RHA：14.0mL/分钟
4.样品19显示超过未处理的RHA的优良俘获和释放能力：
未处理的RHA(图7A)
Figure A200580012738D0048104710QIETU
“FT滤液”(道#4)具有与进样液(道#2)非常类似的特征。所有谱带都比进样液稍浅，这是用于调理稻壳灰的缓冲液稀释后的假象。
Figure A200580012738D0048104710QIETU
物理包埋在稻壳灰内蛋白质溶液发生转移，被称为“洗液”部分(含有非常浅的蛋白质谱带，见道#5)
Figure A200580012738D0048104710QIETU
洗脱液中只有痕量蛋白质(道#6)。
5.样品19(图7B)
Figure A200580012738D0048104710QIETU
显示结合蛋白质优良的结合与回收。
Figure A200580012738D0048104710QIETU
“FT滤液”部分具有非常低至低到为零的蛋白质(道#4)。与“FT滤液”相比，“台式FT(Bench FT)”上清液(道#3)具有少量蛋白质谱带，表明当蛋白质通过饼时被俘获。
Figure A200580012738D0048104710QIETU
洗液具有非常低至低到为零的蛋白质谱带(道#5)。
Figure A200580012738D0048104710QIETU
洗脱液具有与进样液相似的谱带样式，但强度稍浅(道#6)。
结论
经过表面处理的稻壳灰同时通过离子交换俘获感兴趣的可溶性蛋白质和从进样蛋白质溶液分离微粒。然后，可用高盐缓冲液洗脱，从经过表面处理的稻壳灰提取俘获的蛋白质。
结果表明，可使用经过表面处理的稻壳灰以将含微粒的蛋白质溶液分成三种流分：
包埋在经过表面处理的稻壳灰前期外皮中的微粒和主体进样液，
与经过表面处理的稻壳灰结合的非蛋白质组分，和
与经过表面处理的稻壳灰结合并从其洗脱的蛋白质组分。
实施例13：用于同时俘获微粒和俘获/释放可溶性物质的、经过表面处理的稻壳灰
目的
采用相同的经过表面处理的稻壳灰(样品19)和未处理的稻壳灰，用黑曲霉素发酵液重复实施例12。
试验溶液
用4份DI水稀释黑曲霉素发酵液，并用NaOH将pH值调节至8.06。
方法
与实施例12相同。试验溶液体积为100mL。
观察结果/讨论
经过表面处理的稻壳灰样品19具有与未处理的稻壳灰相当的微粒过滤速率。
来自两种稻壳灰的所有收集的部分(FT滤液、洗液和洗脱液)澄清，不含微粒。
在试验条件下，所用试验溶液的量超过结合容量。结果，样品19和未处理的RHA的流出液部分(“台式FT”和“滤液FT”)都与进样溶液没有明显不同。见图8，对于未处理的RHA，将道#2、3和4与道#1进行比较，对于样品19，将道#7、8和9与道#1进行比较。
以下观察结果证实，样品19具有超过未处理的RHA的蛋白质结合容量(见图8)：
未处理的RHA洗液(道#5)包含比样品19(道#10)更多的蛋白质。样品19的洗脱液部分(道#11)显示比未处理的RHA的洗脱液部分(道#6)更高的蛋白质谱带强度。
结论
本实施例表明，经过表面处理的稻壳灰可同时通过离子交换俘获感兴趣的可溶性蛋白质和从来源于黑曲霉素的进样蛋白质溶液分离微粒。然后，用高盐缓冲液洗脱，可从经过表面处理的稻壳灰提取俘获的蛋白质。
结果表明，可使用经过表面处理的稻壳灰以将含微粒的蛋白质溶液分成三种流分：
包埋在经过表面处理的稻壳灰前期外皮中的微粒和主体进样液，
与经过表面处理的稻壳灰结合的非蛋白质组分，和
与经过表面处理的稻壳灰结合并从其洗脱的蛋白质组分。
实施例14：蛋白质结合试验
材料
MilliQ H2O
蛋白质溶液(经过过滤的过氧化氢酶DFC)
50mL Oak Ridge试管
Sorval RC 5B Plus离心机与Sorval SA600转子
BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce)
相容的蛋白质试验制剂试剂组(Pierce)
经过预先稀释的蛋白质试验标准，牛血清白蛋白组分V组(Pierce)
5μm注射器式滤器(Sartoris，Minisart，#17594)
方法
1.各将1g经过硅烷处理的稻壳灰样品#54-67加入到50mL Oak Ridge试管中。
2.各试管中加入20mL经过MiIIiQ处理的水。
3.室温下，以8rpm头到头翻转试管10分钟，混合各试管内的物料。
4.15℃下，将各试管在16,000rpm下离心15分钟。
5.用塑料移液管小心移取上清液。
6.用24份经过MilliQ处理的水稀释1份蛋白质溶液(进样液)。
7.各试管中加入10mL进样液(得到10％w/v固体)。
8.将各试管在室温下培养2小时，以8rpm头到头翻转。
9.15℃下，将各试管在16,000rpm下离心30分钟。
10.将各上清液过滤通过0.45μm注射器式滤器。
11.采用微量滴定板方法，由BCA分析测定进样液和过滤后上清液(步骤10)中的蛋白质浓度。结果如表12所示。
表12
 
蛋白质浓度μg/ml
原始160.66
样品编号 硅烷类型
未处理的RHA 98.75
54 三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐 120.09
55 N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷 136.10
56 二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷 112.02
57 ((氯甲基)苯乙基)三甲氧基硅烷 103.21
58 N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺 81.02
59 3-巯基丙基三乙氧基硅烷 73.43
60 N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺 98.83
61 3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐 73.49
62 三(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)异氰尿酸酯 81.41
63 2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)二苯酮 49.57
64 脲基丙基三甲氧基硅烷 100.04
65 3-异氰氧基丙基三乙氧基硅烷 76.12
66 N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯 59.32
67 二[(3-甲基二甲氧基甲硅烷基)丙基]-聚环氧丙烷 110.24
结果
将进样物质与样品编号54-67混合，离心，过滤后，进样物质的蛋白质浓度降低。结果表明，经过硅烷处理的二氧化硅样品编号54-67及未处理的RHA都结合了进样蛋白质溶液中的蛋白质。
实施例15：抗微生物活性试验(枯草杆菌)
试验微生物：枯草杆菌
待测过滤介质：过滤介质样品43、44、4和FW12(未处理硅藻土)
方法：
将枯草杆菌发酵液在无菌PBS中稀释至约104CFU/mL(使用1 OD≈5*108CFU/mL来估计发酵液中的CFU/mL)
使用0.5g过滤介质/5mL液体(10％固体)
1.将经过稀释的发酵液样品的系列稀释物(在无菌0.9％w/v NaCl中制备)置于LA板上，确定使用的实际CFU/mL。将板在34℃下培养过夜。
2.在30℃，200rpm条件下，将过滤介质与经过稀释的细菌样品(或PBS对照)在125mL无菌带挡板烧瓶中混合2.5小时。
3.将处理后的样品(2)的液体部分置于LA板(每个样品5块板，一块板作为对照)上，34℃培养过夜。
4.对板进行细菌计数。
结果：
结果如表13所示。通过将细菌与过滤介质样品4和44混合，CFU降低，表明过滤介质样品4和44具有抗微生物活性，通过接触可杀伤细菌。
表13
 
样品 CFU/mL
经过稀释的发酵液-初始 6.53*103±2.47*103
样品43+细菌-混合 1.04*104±1.50*103
样品44+细菌-混合 1.30*102±3.00*101
样品4+细菌-混合 TFTC
FW12+细菌-混合 5.90*104±8.00*103
经过稀释的发酵液样品-混合 1.05*103±5.00*101
备注与缩写：
PBS：用磷酸盐缓冲的盐水(防止细胞由于渗透压差而发生细胞溶解chock)
CFU：菌落形成单位(活细胞的度量)
TFTC：太少以致于不能计数
CFU/mL记录为：均值±差异(板的数目)[差异指均值与离开均值最远的观察值之间的差异]。
只对有20-300个菌落的板进行计数。
实施例16：抗微生物活性试验(枯草杆菌)
试验微生物：枯草杆菌
待测过滤介质：过滤介质样品1、4、6、44和45
方法：
将枯草杆菌发酵液在无菌PBS中稀释至约104CFU/mL
使用0.5g过滤介质/5mL液体(10％固体)
1.将经过稀释的发酵液样品的系列稀释物(在无菌0.9％w/v NaCl中制备)置于LA板上，确定使用的实际CFU/mL。将板在34℃下培养过夜。
2.将过滤介质与经过稀释的细菌样品(15mL液体)在250mL无菌带挡板烧瓶中混合。每种过滤介质使用2个烧瓶。
(对于以下过滤介质来说，其中一个烧瓶装有PBS而不是细菌样品：样品1、6和45)
3.在30℃，250rpm条件下混合上述样品2小时。
4.将经过处理的样品(液体部分)置于LA板(每个样品4或5块板)上。将板在34℃下培养过夜。
5.对板进行细菌计数。
结果：
结果如表14所示。通过将细菌与过滤介质样品1、4、6、44和45混合，CFU显著降低。
表14
实施例17：抗微生物活性和过滤试验(短乳杆菌)
试验微生物：短乳杆菌
待测过滤介质：样品4、43、45和FW12。
使用0.5g过滤介质/5mL培养基(10％固体)。
方法：
1.分两步将短乳杆菌过夜培养基稀释至约105CFU/mL(基于1 OD600≈2.7*108CFU/mL)-第一步稀释在无菌短乳杆菌MRS发酵液中进行，第二步在无菌PBS中进行。
2.制备培养基的系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)(第二稀释物)。
3.将经过稀释的样品接种于短乳杆菌MRS发酵液培养板上，确定实际初始CFU/mL。
4.室温下，在轨道振荡器(约60rpm)上，将过滤介质与经过稀释的细菌样品(10mL液体)在
Figure A200580012738D0054170412QIETU
密封的125mL无菌带挡板烧瓶中混合2小时15分钟。
5.系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)由经过处理样品制成，将其接种于短乳杆菌MRS发酵液板上。
6.将选定的样品/样品4、43和45的稀释物滤过5μm滤器。
7.将滤过样品接种于短乳杆菌发酵液板上，在30℃烛罐中培养2天。
8.对板进行计数。
结果：
结果如表15所示。通过将样品4、43和45与细菌混合，CFU降低。将混合物过滤通过5μm滤器可进一步降低CFU。
表15
 
样品 CFU/mL
短乳杆菌培养基-初始 1.05*105±2.50*103
短乳杆菌培养基-混合 1.23*105±2.50*103
样品4(混合) 3.22*104±4.77*103
样品43(混合) 3.43*104±5.67*103
样品45(混合) 5.55*102±4.50*101
FW12(DE) 8.60*104±4.75*103
滤过样品4 TFTC
滤过样品43 TFTC
滤过样品45 TFTC
实施例18：抗微生物活性试验(大肠杆菌)
试验微生物：大肠杆菌(MG1655)
待测过滤介质：FW12、样品43、1、4、6、44和45。
方法：
0.5g过滤介质/5mL进样液(Feed)(＝10％固体)。
1.分两步将大肠杆菌培养基(尚未在静止期)稀释至约105CFU/mL(基于1OD600≈5*108CFU/mL)-第一步在无菌LB介质中进行，第二步在无菌PBS中进行(即进样液)。
2.制备进样液的系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)。
3.将100μL经过稀释的进样液样品接种于LA板上，以确定实际初始CFU/mL。
4.在25℃，200rpm(3/4英寸冲程)条件下，在125mL无菌带挡板烧瓶中将过滤介质与10mL进样液混合2小时。
5.制备混合后样品的系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)，各100μl接种于LA板上，30℃下培养过夜。
6.对板进行计数。
结果：
结果如表16所示。
表16
 
样品 CFU/mL
MG1655-初始 6.80*104±4.00*103
MG1655-混合 5.35*105±2.50*104
硅藻土 2.28*105±1.72*105
样品43 9.05*103±5.50*102
样品1 1.28*103±2.45*102
样品4 1.73*104±2.03*103
样品6 TFTC
样品44 2.70*103±1.23*102
样品45 5.20*103±2.00*102
实施例19：抗微生物活性和过滤试验(短乳杆菌)
试验微生物：短乳杆菌典型株(ATCC#14869)
待测过滤介质：样品43、4和44
方法：
0.5g过滤介质/5mL进样液(＝10％固体)
1.分两步将短乳杆菌培养基稀释至约105 CFU/mL(基于1 OD600≈2.7*108CFU/mL)-第一步稀释在无菌短乳杆菌MRS发酵液中进行，第二步在无菌PBS中进行(即进样液)。
2.制备进样液的系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)。
3.将100μl经过稀释的样品接种于短乳杆菌MRS发酵液板上，以确定实际初始CFU/mL。
4.在25℃，250rpm(1/2英寸冲程)条件下，在15mL无菌锥形试管中将过滤介质与5mL进样液混合2小时。
5.制备混合后样品的系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)，将其接种于短乳杆菌MRS发酵液板上(各100μL)。
6.所有样品过滤通过5μm注射器式滤器。
7.制备滤过后样品的系列稀释物(在0.9％w/v NaCl中)，将其接种于短乳杆菌MRS发酵液板上)。
8.将板在30℃烛罐中培养2天。
9.对板进行计数。
结果：
结果如表17所示。通过将样品4、43和44与细菌混合，CFU降低。将混合物过滤通过5μm滤器可进一步降低CFU。
表17
 
样品 CFU/mL CFU/mL(滤过)
ATCC#14869-初始 2.83*104±4.67*103 --
ATCC#14869-混合 4.00*104±2.00*103 1.27*104±5.80*102
样品43 4.55*103±3.50*102 2.40*103±2.00*102
样品4 1.95*102±5.00*100 TFTC
样品44 8.10*102±1.40*102 5.50*101±5.00*100
实施例20：抗微生物活性试验(短乳杆菌)
试验微生物：短乳杆菌
待测过滤介质：样品48、50、51和52
方法：
1.将短乳杆菌(革兰氏阳性)培养基划线到MRS琼脂上，26℃下厌氧培养直到充分生长。
2.将来自MRS板的菌落稀释在0.1％胨中，目标为5×104CFU/mL，制备工作接种物。
3.在30mL玻璃试管中，将0.5g过滤介质加入到10mL接种物中(5％)。
4.密封玻璃试管，混合(每分钟8次翻转)的同时，在室温下培养30分钟。
5.在0.9％ NaCl中制备1:10系列稀释物，接种到MRS琼脂上，采用倾注平板培养法扩增细菌群。
6.将板在26℃下厌氧培养(GasPak)，直到生长到足以计数。
7.对具有20-200个菌落的板进行计数。结果如表18所示。
实施例12：抗微生物活性试验(醋酸杆菌(革兰氏阴性))
试验微生物：醋酸杆菌(革兰氏阴性)
待测过滤介质：样品48、50、51和52。
方法：
1.将醋酸杆菌(革兰氏阴性)培养基划线到MRS琼脂上，27℃下厌氧培养直到充分生长。
2.将1mL琼脂板菌落环加入到99mL MRS发酵液中并在27℃下培养，制备培养基储备液。
3.将MRS储备培养基稀释到用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)或0.1％胨中，制备工作接种物。
4.在30mL玻璃试管中，将0.5g过滤介质加入到10mL接种物中。
5.密封玻璃试管，混合(每分钟8次翻转)的同时，在室温下培养30分钟。
6.在0.1％胨中制备1:10系列稀释物，接种到MRS琼脂上，采用倾注平板培养法扩增细菌群。
7.将板在27℃下厌氧培养，直到生长到足以计数。
8.对具有20-200个菌落的板进行计数。结果如表18所示。
实施例22：抗微生物活性试验(糖化酵母(酵母))
试验微生物：糖化酵母(酵母)
待测过滤介质：样品48、50和51。
方法：
1.将糖化酵母(酵母)培养基划线到YM琼脂上，30℃下厌氧培养直到充分生长。
2.将来自YM板的菌落稀释在用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中，目标3×104CFU/mL，制备工作接种物。
3.在30mL玻璃试管中，将0.5g过滤介质加入到10mL接种物中。
4.密封玻璃试管，混合(每分钟8次翻转)的同时，在室温下培养30分钟。
5.在0.9％NaCl中制备1:10系列稀释物，接种到MRS琼脂上，采用倾注平板培养法扩增细菌群。
6.将板在30℃下厌氧培养(GasPak)，直到生长到足以计数。
7.对具有20-200个菌落的板进行计数。结果如表18所示。
表18
 
样品 短乳杆菌，革兰氏阳性(+) 醋酸杆菌，革兰氏阴性(-) 糖化酵母，酵母
编号 处理 二氧化硅类型 降低百分率 降低百分率 降低百分率
48 3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基-硅烷盐酸盐 RiceSil100 100％ 18％ 41％
51 3-三羟基甲硅烷基丙基-甲基膦酸酯，钠盐 RiceSil100 20％ 10％ 33％
50 N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基-硅烷缩水甘油基三甲基氯化铵 RiceSil100 90％ 20％ 3％
52 N-十八烷基二甲基(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)氯化铵 RiceSil100 100％ 90％
虽然参考上述优选实施方式描述了本发明，应理解在不背离本发明的范围情况下可进行各种改进。

Claims (32)

1.一种从样品中分离一种或多种感兴趣组分的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含微粒和可溶性物质的样品通过二氧化硅过滤介质过滤，所述二氧化硅过滤介质的表面活性基团已与一种或多种硅烷反应，
(b)同时俘获微粒和使感兴趣的可溶性组分与二氧化硅过滤介质结合，以及
(c)从二氧化硅过滤介质洗脱感兴趣的结合的可溶性组分。
2.一种从样品中分离一种或多种感兴趣组分的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含微粒和可溶性物质的样品通过二氧化硅过滤介质过滤，所述二氧化硅过滤介质的表面活性基团已与一种或多种硅烷反应，
(b)同时俘获微粒和使不需要的可溶性物质与二氧化硅过滤介质结合，
(c)收集流过的流分，以及
(d)从流过的流分中回收感兴趣的可溶性组分。
3.一种从样品中分离感兴趣的可溶性组分的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含微粒和可溶性物质的样品通过二氧化硅过滤介质过滤，所述二氧化硅过滤介质的表面活性基团已与一种或多种硅烷反应，
(b)同时俘获微粒和使第一种感兴趣的可溶性组分与二氧化硅过滤介质结合，收集流过的流分，
(c)收集流过的流分，
(d)从流过的流分中回收第二种感兴趣的可溶性组分，
(e)从二氧化硅过滤介质上洗脱结合的第一种感兴趣的可溶性组分，
(f)回收第一种感兴趣的可溶性组分。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，还包括纯化流过的流分中的感兴趣的可溶性组分的步骤。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述微粒通过物理包埋和/或结合于二氧化硅过滤介质而被俘获。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述微粒是微生物、沉淀、包涵体或结晶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微生物是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、酵母、霉菌或病毒。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在过滤步骤之前，将所述样品与所述二氧化硅过滤介质预混合。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述可溶性组分通过静电、疏水或亲水相互作用与二氧化硅过滤介质结合。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述可溶性组分是多肽、脂类、碳水化合物、脂蛋白、多糖、糖、脂肪酸或多核苷酸。
11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述表面活性基团已通过干法或湿法与一种或多种硅烷反应。
12.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述二氧化硅过滤介质是大孔二氧化硅。
13.如权利要求12所述的方法，所述二氧化硅过滤介质是经过纯化或未纯化的稻壳灰、燕麦壳灰或硅藻土。
14.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述硅烷包含一个或多个选自下组的可水解部分：烷氧基、卤素、羟基、芳氧基、氨基、羧基、氰基、氨酰基、酰氨基、烷基酯、芳基酯，它们已与二氧化硅过滤介质的活性基团反应。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述硅烷还具有选自下组的官能化部分：季铵、芳基、环氧、氨基、酰胺、硫氢基、脲、异氰基、尿烷、醚、甲基丙烯酸酯、咪唑、羰基、异硫脲鎓、磺酸酯和膦酸酯。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有芳基部分的硅烷是2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮或((氯甲基)苯乙基)三甲氧基硅烷。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有氨基部分的硅烷是2-(三甲氧基甲硅烷基乙基)吡啶、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯或三甲氧基甲硅烷基丙基聚乙烯亚胺。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有脲部分的硅烷是N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有硫氢基部分的硅烷是3-巯基丙基三乙氧基硅烷。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有羰基部分的硅烷是3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有异氰基部分的硅烷是三(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)异氰尿酸酯和3-异氰氧基丙基三乙氧基硅烷。
22.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有醚部分的硅烷是二[(3-甲基二甲氧基甲硅烷基)丙基]-聚环氧丙烷。
23.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有环氧部分的硅烷是2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷。
24.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有咪唑部分的硅烷是N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4，5-二氢咪唑。
25.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有磺酸酯部分的硅烷是2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷。
26.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有异硫脲鎓部分的硅烷是三甲氧基甲硅烷基丙基异硫脲鎓氯化物。
27.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有酰胺部分的硅烷是三乙氧基甲硅烷基丙基乙基-氨基甲酸酯、N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺或N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺。
28.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述具有尿烷部分的硅烷是N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷或O-(炔丙氧基)-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)尿烷。
29.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述硅烷是选自下组的离子性硅烷：3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基-乙二胺三醋酸三钠盐；三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐和3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯钠盐。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种硅烷选自：3-氨基丙基三甲氧基硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；3-三氢甲硅烷基丙基甲基膦酸酯钠盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和(3-环氧丙氧基丙基)三甲氧基硅烷；3-三氢甲硅烷基丙基甲基膦酸酯钠盐和二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷；3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；2-(三甲氧基甲硅烷基乙基)吡啶和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮；3-巯基丙基三乙氧基硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；以及2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷和二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
31.一种经过硅烷处理的稻壳灰或燕麦壳灰，其特征在于，所述稻壳灰或燕麦壳灰的表面活性基团已与一种或多种选自下组的硅烷反应：2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮、((氯甲基)苯乙基)三甲氧基硅烷、2-(三甲氧基甲硅烷基乙基)吡啶、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯、三甲氧基甲硅烷基丙基聚乙烯亚胺、N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐、三(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)异氰尿酸酯或3-异氰氧基丙基三乙氧基硅烷、二[(3-甲基二甲氧基甲硅烷基)丙基]-聚环氧丙烷、2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、N-[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]咪唑或N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4，5-二氢咪唑、2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷、三甲氧基甲硅烷基丙基异硫脲鎓氯化物、三乙氧基甲硅烷基丙基乙基-氨基甲酸酯、N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺或N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺、N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷或O-(炔丙氧基)-N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)尿烷、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基-乙二胺三醋酸三钠盐；三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐以及3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯钠盐。
32.一种经过硅烷处理的稻壳灰或燕麦壳灰，其特征在于，所述稻壳灰或燕麦壳灰的表面活性基团已与一种或多种选自下组的硅烷反应：3-氨基丙基三甲氧基硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；3-三氢甲硅烷基丙基甲基膦酸酯钠盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和(3-环氧丙氧基丙基)三甲氧基硅烷；3-三氢甲硅烷基丙基甲基膦酸酯钠盐和二-(2-羟基乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷；3-(N-苯乙烯基甲基-2-氨基乙基氨基)-丙基三甲氧基硅烷盐酸盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；2-(三甲氧基甲硅烷基乙基)吡啶和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-葡糖酰胺；N-三甲氧基甲硅烷基丙基-N，N，N-Cl，三甲基氯化铵和2-羟基-4-(3-三乙氧基甲硅烷基丙氧基)-二苯酮；3-巯基丙基三乙氧基硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；三甲氧基甲硅烷基丙基-乙二胺三醋酸三钠盐和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷和N-(三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷尿烷；以及2-(4-氯代磺酰基苯基)-乙基三氯硅烷和二-(2-羟乙基)-3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
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