CN110029105A - 一种提取微生物dna的试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种提取微生物DNA的试剂盒及其方法，其中提取微生物DNA的试剂盒包括裂解液和平衡液，裂解液包括5‑氯‑2‑甲基‑4‑异噻唑啉‑3‑酮、2‑甲基‑4‑异噻唑啉‑3‑酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2‑(N‑吗啉代)乙磺酸、溴酚红、二甲苯青FF，平衡液包括3‑(2‑氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1‑(4‑磺酸苯基)‑4‑(4‑磺酸苯基偶氮)‑5‑吡唑啉酮‑3‑羧酸三钠、三羟甲基氨基甲烷。本发明提供的一种提取微生物DNA的试剂盒及其方法，该方法在室温条件下即可完成操作，提取快速，且该方法提取的DNA不含有RNA的干扰、通量高；而试剂盒中的裂解液及平衡液可高效抑制微生物的生长，这对于处理和运输含有感染性来源的样本有极大的优势。

Description

一种提取微生物DNA的试剂盒及其方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种提取微生物DNA的试剂盒及其方法。
背景技术
环境微生物总DNA的纯化为本领域所熟知，并且在生态学、诊断及药学研究中有极为广泛的应用。随着分子生物学及生态学研究的不断进步，从环境样本中纯化的DNA可直接用于微生物基因组研究、微生物多样性的分析，进而用于动植物疾病的发生发展研究。在这些应用中，首先需要纯化DNA，随后进行聚合酶链式扩增反应或DNA序列测定，从而揭示样本中微生物多样性变化，最终用于微生物多样性研究。
但是，环境微生物样本来源多样，干扰物复杂是无法避免的情况。现有技术方法通常包含直接法与间接法进行DNA提取。直接法采用直接裂解样本中微生物细胞的方法，这种方法获得的主要是DNA粗提液，可根据后续试验应用直接使用或进行进一步纯化使用，但是该类方法需要高温处理，通常需要温度控制仪器辅助才能进行；而间接法需要通过机械破碎样本、样本匀浆、不同缓冲溶液进行细胞壁和细胞膜的裂解、最终通过乙醇沉淀或羟基/羧基材料吸附纯化得到DNA，但是该方法需要更多的专业仪器，并且操作步骤繁复，耗时较多，不适合进行高通量DNA样本的提取。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种提取微生物DNA的试剂盒及其方法，该方法在室温条件下即可完成操作，提取快速，且该方法提取的DNA不含有RNA的干扰、通量高；而试剂盒中的裂解液及平衡液可高效抑制微生物的生长，这对于处理和运输含有感染性来源的样本有极大的优势。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种提取微生物DNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液和平衡液，所述裂解液包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2-(N-吗啉代)乙磺酸、溴酚红、二甲苯青FF，所述平衡液包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、三羟甲基氨基甲烷。
进一步，所述裂解液包括0.001％～12％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％～10％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、100～200mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.1～0.5％的溴酚红、0.01～0.5％的二甲苯青FF。
进一步，所述裂解液包括0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF。
进一步，所述平衡液包括0.01～15％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、50～200mM的三羟甲基氨基甲烷。
进一步，所述平衡液包括0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷。
进一步，所述裂解液的pH为5.8～6.4，优选为6.0，所述平衡液的pH为8.6～10，优选为9.0。
此外本发明还公开了一种提取微生物DNA的方法，包括以下步骤：
S1：将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，高速涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；
S2：向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液。
进一步，所述方法还包括将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液。
其中，生物样本可来自于人体、动物、植物、藻类、土壤、空气、水体或石油。
进一步的，人体或动物的生物样本来源包括但不限于皮肤、口腔、消化道内容物、粪便、体液、尿道、阴道、内脏、腹腔。
进一步的，体液包括但不限于血液、脑脊髓液、胃液、胆汁、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。
本发明的有益效果：
本发明提供的一种提取环境微生物DNA的方法，该方法在室温条件下即可完成操作，提取快速，且该方法提取的DNA不含有RNA的干扰、通量高；经过纯化获得的DNA可直接用于下游分子生物学试验，这对于没有昂贵试验设施设备的试验室进行微生物监测具有极大的优势；与此同时，该方法可直接观测反应液颜色判定是否可进行后续试验，对于样品快速处理提供了可视化直观操作的可能性，本发明提供的提取微生物DNA的试剂盒，其中裂解液及平衡液可高效抑制微生物的生长，这对于处理和运输含有感染性来源的样本有极大的优势。
附图说明
图1为本发明实施例一、实施例四、实施例五所提取的微生物DNA的扩增16S rRNA基因的琼脂糖凝胶电泳图；
泳道M：Trans2K plus DNA marker；泳道C1:通过实施例一获得DNA样本的PCR产物结果；泳道C2:通过实施例四获得DNA样本的PCR产物结果；泳道P2:通过实施例五获得DNA样本的PCR产物结果；
图2为本发明实施例一、实施例四、实施例五中所获得的微生物群落结构分析结果；
其中，C1:通过实施例一获得DNA样本的PCR产物；C2:通过实施例四获得DNA样本的PCR产物；P2:通过实施例五获得DNA样本的PCR产物。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
本发明公开了一种提取微生物DNA的试剂盒，包括裂解液和平衡液，还提供了一种提取微生物DNA的方法，方法简单，提取快速，且提取得到的DNA不含有RNA的干扰、通量高，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
实施例一
提取微生物DNA的试剂盒包括：
裂解液：0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
平衡液：0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
从小鼠粪便中提取微生物DNA的方法：
S1:将0.05g粪便样本与0.1ml裂解液充分混匀，高速涡旋振荡后室温静置1分钟,得到混合溶液；
S2:向S1步骤得到的混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，取上层裂解液备用。
实施例二
提取微生物DNA的试剂盒包括：
裂解液：0.001％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、5％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、200mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.1％的溴酚红、0.5％的二甲苯青FF。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
平衡液：0.01％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、200mM的三羟甲基氨基甲烷。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
从小鼠粪便中提取微生物DNA的方法与实施例一相同。
实施例三
裂解液：12％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、10％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、100mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.01％的二甲苯青FF。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
平衡液：15％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、50mM的三羟甲基氨基甲烷。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
从小鼠粪便中提取微生物DNA的方法与实施例一相同。
实施例四
提取微生物DNA的试剂盒包括：
裂解液：0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
平衡液：0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷。在配置时，将所有试剂按照比例溶解于蒸馏水中，混合均匀即可。
从小鼠粪便中提取微生物DNA的方法：
S1:将0.05g粪便样本与0.1ml裂解液充分混匀，高速涡旋振荡后室温静置1分钟,得到混合溶液；
S2:向S1步骤得到的混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到出提液。
S3:将S2步骤所得粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液备用。
实施例五
使用QIAamp PowerFecal DNA Kit从小鼠粪便中提取微生物DNA
与实施例一相同，取0.05g粪便样本，按如下流程进行DNA提取
1、在DryBead Tube中加入0.25g粪便样本，750μl PowerBead Solution和60μlSolution C1，充分混匀后65℃孵育10min，拧紧管盖后涡旋振荡10min。2、13000xg离心1min后吸取400-500μl上清液至2ml收集管中，加入250μl Solution C2，低速涡旋或颠倒混匀后于2-8℃静置5min(低温静置步骤可省略)。
3、13000xg离心1min后吸取600μl上清液至2ml收集管中，加入200μl SolutionC3，低速涡旋或颠倒混匀后于2-8℃静置5min(低温静置步骤可省略)。
4、13000xg离心1min后吸取750μl上清液至2ml收集管中，加入1200μl SolutionC4并颠倒充分混匀(Solution C4使用前需充分溶解混匀)。
5、在MB Spin Column中加入步骤4中的混合液675μl，10000xg离心1min，弃流穿液。重复该步骤至所有收集管中混合液过柱。
6、在MB Spin Column中加入500μl Solution C5，10000xg离心1min后弃流穿液。
7、10000xg离心1min后在MB Spin Column(置于新的2ml收集管中)中央加入50-100μl Solution C6，室温孵育1min后10000xg离心30s。流穿液即为DNA溶液。
实施例六
将实施例一、实施例四、实施例五所提取的微生物DNA粗提液进行16S rRNA基因的扩增
使用16S rRNA基因扩增引物进行V4区扩增，扩增体系见表1，PCR反应条件为，98℃10s，55℃10s，68℃30s；30个循环。扩增结果如图1所示，其中实施例1～3均得到了目标扩增子。
其中，使用的扩增引物为：
U515F：5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3’
U806R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’
表1 PCR扩增体系
将实施例1～3中获得的16S rRNA基因V4区扩增子片段进行高通量测序，通过数据分析，检测不同DNA提取方法获得的微生物群落结构分析结果。结果如图2所示，本发明所述提取方法可快速获得微生物DNA，其获得的微生物DNA完整性和结构与高品质试剂盒一致，且重复性较高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，做出若干改进和润饰，这些改进和润饰仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (8)

1.一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液和平衡液，所述裂解液包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、RNaseA、聚乙烯吡咯烷酮、2-(N-吗啉代)乙磺酸、溴酚红、二甲苯青FF，所述平衡液包括3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、三羟甲基氨基甲烷。
2.根据权利要求1所述的一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括0.001％～12％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％～10％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mM RNaseA、0.5％的聚乙烯吡咯烷酮、100～200mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.1～0.5％的溴酚红、0.01～0.5％的二甲苯青FF。
3.根据权利要求2所述的一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括0.002％的5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.001％的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、0.01mMRNaseA、0.5％聚乙烯吡咯烷酮、150mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5％的溴酚红、0.25％的二甲苯青FF。
4.根据权利要求2所述的一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述平衡液包括0.01～15％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、50～200mM的三羟甲基氨基甲烷。
5.根据权利要求4所述的一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述平衡液包括0.1％的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，0.25％的1-(4-磺酸苯基)-4-(4-磺酸苯基偶氮)-5-吡唑啉酮-3-羧酸三钠、100mM的三羟甲基氨基甲烷。
6.根据权利要求1～5任意一项权力要求所述的一种提取微生物DNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的pH为5.8～6.4，所述平衡液的pH为8.6～10。
7.一种提取微生物DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将0.05g～0.1g生物样本与0.1ml裂解液充分混匀，高速涡旋振荡后室温静置1分钟，得到混合溶液；
S2：向所述混合溶液中加入0.2ml平衡液，充分混匀后室温静置10分钟，得到粗提液。
8.根据权利要求7所述的一种提取微生物DNA的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述粗提液于15000xg离心力条件下离心1分钟，取上清液。
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