CN102725407A - 分离核酸的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用棉从固体或液体样本中分离天然和人工核酸（如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和肽核酸(PNA)）的方法。棉以如下方式填充：含有核酸的溶液通过它并且溶液中的核酸在最适于结合的介质中与棉结合。核酸与棉的结合以如下方式进行：结合的核酸能够经受住水性液体的多次洗涤，并且在如下的水性缓冲液中被洗脱掉：用该水性缓冲液洗脱的核酸能够直接用于使用PCR的扩增或者用于任何其他的生物化学或分子生物学需要。

Description

分离核酸的方法及其试剂盒
技术领域
本公开涉及核酸的分离和纯化。更具体而言，提供了一种使用棉或其衍生物分离和纯化核酸的方法及试剂盒。
背景技术
核酸提取方法(protocol)可以大致分为基于二氧化硅的方法和非基于二氧化硅的方法。现有的二氧化硅和非二氧化硅的方法不能进行水洗以除去非核酸成分，并且需要其中含有一定百分比的醇的水洗液。在洗脱的核酸溶液中存在醇会抑制聚合酶链反应(PCR)，因此这两种方法通常都要求高速旋转或其它方法以除去残余的醇，和用室温或高温水性缓冲液(aqueous buffer)进行核酸洗脱。在一些情况下，这两种方法都需要高盐浓度，同时使用聚乙二醇或水性醇（aqueous alcohol）洗涤。高盐浓度和水性醇的使用会对核酸的洗脱造成限制，如在核酸洗脱前严格去除这些成分或者使用离心分离等。因此现有的基于二氧化硅或非基于二氧化硅的方法没有一个能够用于快速诊断(point of care(POC)(床旁分析))，因为离心分离会产生气溶胶。如下给出文献中报道的一些非基于二氧化硅的方法：
US 7264927该文件描述了纤维素或纤维素纸的使用，涉及使用聚亚烷基二醇和高盐浓度以进行结合，并最终在缓冲液或去离子水中洗脱核酸。
US 6084091描述了使用纤维素粉(如马铃薯淀粉)用于核酸分离的方法。
US 5804684描述了使用滤纸用于核酸提取的方法，其中将滤纸置于如塑料滴头的装置中，同时用软薄纸或一团棉作为过滤器或屏障以支撑滤纸。
所有上述工艺要么使用市售可得的硅胶柱进行最终的核酸分离，要么需要更长的样品处理时间(高于30分钟)或者涉及在基质的洗涤过程中采用高盐浓度或涉及使用离心分离等。这些基于纤维素的核酸提取方法没有一个采用100％水性缓冲液或水洗涤核酸，而是一般含有一定比例的醇或含多羟基的化合物。
发明内容
因此，本公开涉及一种从样品中分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：(a)向含有核酸的样品中加入裂解缓冲液以得到裂解溶液，或者(b)向样品中加入裂解缓冲液和结合缓冲液以得到裂解溶液，(c)向步骤(a)的溶液中加入结合缓冲液以将核酸结合到基质或直接将步骤(b)的溶液结合到基质，以及(d)洗涤并洗脱与基质结合的核酸以分离并纯化核酸。本公开还涉及一种从样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括基质和缓冲液。
附图说明
结合附图，从以下的描述和所附的权利要求，本发明的特征将变得的更为明显。应该理解的是，通过采用这些附图，本公开将描述的更加具体和详尽，但这些附图仅是描绘了根据本公开的几个实施例，因此其不能被认为是对保护范围的限制：
图1：棉装载在[a]注射器、[b]注射器针、[c]附于注射器上的塑料模具[d]螺帽塑料瓶、[e]玻璃试管、[f]螺帽玻璃瓶中。
图2：棉装载在[a]一次性塑料滴管、[b]模塑巴斯德塑料吸液管、[c]玻璃巴斯德塑料吸液管、[d]有橡胶头的塑料滴管、[e]棉拭子、[f]模塑塑料吸液管中。
图3：棉装载在[a]埃彭道夫管(微量离心管)、[b]螺帽玻璃管、[c]模塑塑料1mL滴头、[d]带橡胶帽的一次性玻璃刻度吸液管、[e]粘胶拭子、[f]带塑料和橡胶头的玻璃吸液管中。
图4：通过不同方法纯化的DNA样品用PCR进行扩增。泳道1：分子量标记物；泳道2：装于1mL吸液管滴头的粘胶；泳道3：市售粘胶拭子；泳道4：装于1mL吸液管滴头的棉；泳道5：市售硅胶柱；泳道6：用市售棉拭子纯化的DNA；泳道7：未扩增的DNA；泳道8：空白水。
图5：通过不同方法纯化的DNA样品用PCR进行扩增。泳道1：装于1mL吸液管滴头的棉；泳道2：空白水；泳道3：装于2mL注射器的棉；泳道4：市售硅胶柱；泳道5：分子量标记物。
图6：通过不同方法纯化的DNA样品用PCR进行扩增。泳道1：分子量标记物；泳道2：市售二氧化硅方法；泳道3：装于1mL吸液管滴头的棉；泳道4：装于吸液管滴头的Whatman 1号滤纸；泳道5：FTA卡方法。
图7：通过不同方法纯化的30ct RNA样品用RT-PCR进行扩增。泳道1：分子量标记物；泳道2：药棉；泳道3：高压蒸汽处理棉；泳道4：氢氧化钠水洗棉；泳道5：盐酸水洗棉；泳道6：吸收棉（absorbing cotton）；泳道7：Qiagen硅胶柱；泳道8：FTA卡。
图8：用于自动化核酸提取的用棉填装的药筒的元件。
具体实施方式
发明详述
在下文中，将参照作为本发明一部分的附图，进行详细说明。在说明书、附图和权利要求书中详细描述的示例性实施方式并不意欲构成对本发明的限制。在没有偏离本发明在此提出的技术方案的精神或范围的情况下，可以利用其他的实施方式，并且可以做出其他的改变。容易理解的是，如通常在此所述以及附图中所图释的，本公开的各个方面可以以各种各样的变化方式进行结合，所有这些变化都是明确可预期的并且构成本发明的一部分。
本公开涉及一种从样本中分离核酸的方法，所述方法包括步骤：
(a)将裂解缓冲液加入到含有核酸的样本中以得到裂解溶液；或者
(b)将裂解缓冲液连同结合缓冲液一起加入到样本中以得到裂解溶液；
(c)将结合缓冲液加入到步骤(a)的溶液中以使核酸与基质结合，或者使步骤(b)的溶液与基质直接结合；和
(d)洗涤和洗脱与基质结合的核酸以分离和纯化核酸。
在本公开的一个实施方式中，所述核酸选自包括DNA、RNA和PNA的组中。
在本公开的另一个实施方式中，所述样本为生物或非生物样本。
在本公开的又一个实施方式中，所述生物样本选自包括血液、痰液、血清、唾液或组织提取液的组中，以及所述非生物样本选自包括化学合成的PNA的组中。
在本公开的再一个实施方式中，所述裂解缓冲液选自包括硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA、Tris、洗涤剂、多元醇、含有IA族阳离子的单价盐或含有IIA族阳离子的二价盐、消化蛋白质的酶、非必需的尿素、或其任何组合的组中。
在本公开的再一个实施方式中，所述EDTA的浓度在约10mM~约300mM的范围内，优选为约100mM。
在本公开的又一个实施方式中，所述硫氰酸胍或所述盐酸胍的浓度在约0.1M~约7M的范围内。
在本公开的又一个实施方式中，所述尿素的浓度在约0.01M~约7M的范围内。
在本公开的又一个实施方式中，所述Tris的浓度在约0.01mM~约100mM的范围内，优选为约20mM。
在本公开的又一个实施方式中，所述多元醇的浓度在约0.01%~约30%(v/v)的范围内。
在本公开的又一个实施方式中，所述洗涤剂选自包括月桂硫酸钠、十二烷基硫酸钠、TritonX-100、吐温20和NP-40或其任何组合的组中，以及其中，所述消化蛋白质的酶为蛋白酶K。
在本公开的又一个实施方式中，所述结合缓冲液为非必需地带有多元醇或非多元醇的水。
在本公开的又一个实施方式中，所述多元醇包括选自聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇中的水溶性多元醇化合物。
在本公开的又一个实施方式中，所述非多元醇包括由甲醇、乙醇、丙醇构成的醇；或任何具有酸、胺、醇、酚、酰胺或酯的官能团作为官能团之一的水溶性液体；或其任何组合。
在本公开的又一个实施方式中，分别使用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液进行所述洗涤和洗脱。
在本公开的又一个实施方式中，所述洗涤包括使用包含约1%~约99%(v/v)、优选约30%~约70%(v/v)且最佳约50%(v/v)的水性醇的洗涤缓冲液进行第一洗涤，然后使用包含100%的水的洗涤缓冲液进行多次洗涤。
在本公开的又一个实施方式中，所述水性醇选自包括乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇和丙二醇的组中。
在本公开的又一个实施方式中，所述水选自包括去离子水、无DNA酶水、无RNA酶水、MilliQ水、过滤水、自来水和地下水或其任何组合的组中。
在本公开的又一个实施方式中，所述洗涤缓冲液可以非必需地包含选自包括MgCl2、CaCl2、NaCl和KCl的组中的盐或pH在约5~约12的范围内的选自包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺和哌啶的组中的缓冲剂。
在本公开的又一个实施方式中，所述洗脱缓冲液包含温度在约45°C~约99°C范围内的温水和pH在约8~约11的范围内的缓冲剂或盐。
在本公开的又一个实施方式中，所述水选自包括去离子水、无DNA酶水、无RNA酶水、MilliQ水、过滤水、自来水、地下水或其任何组合的组中。
在本公开的又一个实施方式中，所述缓冲剂选自包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶或其任何组合的组中，所述缓冲剂的pH在约5~约12的范围内，或者所述缓冲剂的pKa在约7~约10的范围内。
在本公开的又一个实施方式中，所述盐选自包括MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl或其任何组合的组中，浓度在约0.01mM~约100mM的范围内，优选在约5mM~约50mM的范围内。
在本公开的又一个实施方式中，所述基质选自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何组合的组中。
在本公开的又一个实施方式中，所述棉选自包括天然棉、药棉、临床级棉、商品棉、棉纱、水洗棉、酸或碱洗棉、高压蒸汽处理棉、pH在约1~约14范围内的缓冲液处理棉、盐溶液处理棉、有机溶剂处理棉、压缩棉和加工棉的组中。
本公开进一步涉及一种用于从样本中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括基质和缓冲液。
在本公开的一个实施方式中，所述基质选自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何组合的组中。
在本公开的另一个实施方式中，所述棉选自包括天然棉、药棉、临床级棉、商品棉、棉纱、水洗棉、酸或碱洗棉、高压蒸汽处理棉、pH在约1~约14范围内的缓冲液处理棉、盐溶液处理棉、有机溶剂处理棉、压缩棉和加工棉的组中。
在本公开的再一个实施方式中，所述缓冲液选自包括如上所述的裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的组中。
在本公开的又一个实施方式中，所述样本包括生物或非生物样本。
在本公开的又一个实施方式中，所述生物样本选自包括血液、痰液、血清、唾液或组织提取液的组中，以及所述非生物样本选自包括化学合成的PNA的组中。
本公开涉及一种使用棉构建核酸提取系统的方法。所述棉以如下方式被装入：在核酸提取过程中提及的全部溶液都将与棉相互作用。
在另一个实施方式中，下面将提供对本公开中使用的各种材料的具体说明：
棉、棉衍生物、包含棉的材料和棉类似材料：由棉树的棉籽周围的棉桃得到蓬松的棉。就核酸提取而言，棉是作为基质的优选材料。棉的形式可为天然棉、药棉、临床级棉、商品棉、棉纱、水洗棉、酸或碱洗棉、高压蒸汽处理棉、缓冲液(pH 1-14)处理棉、盐溶液处理棉、有机溶剂处理棉、压缩棉和加工棉等，都是适合的。任何棉织物或不同形式的棉或具有棉共混物的合成聚合物或含棉材料均可用于核酸提取。表现为与棉相似的纤维的如羊毛、丝、开士米等的材料也被认为是本公开的部分。有机农业或使用农药和杀虫剂制造的棉也被认为是本公开的部分。横越不同地理生产的棉将在组成、结构、颜色和品质上略有不同，并且横越世界所有地区生长的棉被认为是本公开的部分。任何来源于棉的产品或在其制造过程中使用棉的材料被认为是本公开的部分，并且能够用于核酸提取。
裂解缓冲液：所述裂解缓冲液包含高浓度的EDTA以使核酸能够与棉结合，并且也用于处理不同种类的样本(血液、痰液、血清、唾液、组织提取液等)。盐组分的变化是可以的，并且EDTA的使用是作为实例给出的，不应认为构成对本公开的内容的限制。通常，任何高浓度的带负电荷的分子都能够排斥溶液中的核酸并且增强与棉的结合。所述裂解缓冲液包括硫氰酸胍或盐酸胍、EDTA、Tris、洗涤剂、非必需的尿素、多元醇、含有IA族阳离子的单价盐和/或含有IIA族阳离子的二价盐、和蛋白酶K或任何消化蛋白质的酶。硫氰酸胍或盐酸胍的浓度可为0.1~7M间的任一浓度。在一些应用中可以用盐酸胍或尿素代替硫氰酸胍，其浓度也可在0.1~7M之间变化。尿素用于使蛋白质变性，而且它将补足胍盐的功能并且浓度可在0~7M之间变化。通常，大多数文献报道的用于血液的裂解方法包含1-20mM的EDTA。我们的裂解缓冲液能够包含显著不同的EDTA用量，优选10-300mM，更优选约100mM。对于如RNA和PNA的其他核酸而言，可以调整EDTA浓度，但是总体上，我们发现，更高的EDTA浓度有助于改进PCR和RT-PCR的循环次数(Ct)和信号强度。显著不同的EDTA浓度有助于捕获血红蛋白(对于血液)中存在的铁，抑制DNA酶和RNA酶的活性，以及产生其中核酸能够与棉结合的高负性氛围。其重要方面在于，该实施方式是在碱性条件下完成DNA与基质结合的第一个实例。重要的是，溶液的结合pH对DNA/RNA与棉的结合具有重要作用，因此，对于结合而言，优选pH为约8-10，但是也可以使用pH为约7.1-12的溶液。通常以更高浓度使用氯化镁使RNA酶失活，因此，在DNA裂解方法中，不使用或最低限度地使用氯化镁(在20mM以内)。此外，使用EDTA也使RNA酶失活，并且使用MgCl2不必是必需的，其对任何核酸应用而言是可选择的。对于裂解，Tris是缓冲液的选择，并且我们发现，可以使用0-100mM，而且通常约20mM是最佳的。应当注意的是，在我们的裂解缓冲液中，Tris的作用是用来帮助裂解，而且可以使用任何合适的缓冲液代替。在结合缓冲液中使用多元醇用于改进裂开和变性的蛋白质的溶解性。多元醇在结合缓冲液中的百分比可为0-30%(v/v)。在一些应用中，不加入单独的结合缓冲液，而在裂解之后核酸可以直接结合到基质上。所有这些缓冲液通常均在去离子水中制成，而对于RNA应用，可以非必需地用DEPC和高压灭菌处理所述水。对于血液、痰液、唾液、精液等，在加入上述裂解缓冲液之前，可以先完成蛋白酶K裂解，而且，非必需地，可以和裂解缓冲液一起完成蛋白酶K裂解。我们发现，蛋白酶K处理在上述裂解缓冲液中是有效的，因此，对于任一种含有核酸的液体样本而言，这种处理既可在加入裂解缓冲液之前进行，又可连同裂解缓冲液一起进行。在裂解缓冲液中使用的洗涤剂可以选自包括SLS(月桂硫酸钠)、SDS、Triton X-100、吐温20或本领域已知的任何其他的常用离子、非离子洗涤剂。
结合缓冲液：在裂解后加入结合缓冲液以开始核酸与棉的结合，我们发现，结合缓冲液在组成和pH方面非常灵活。结合缓冲液如此灵活，以至于仅仅加入水就足以稀释裂解缓冲液中的盐的浓度，并且观察到了核酸与棉的良好结合。在裂解过程中或者在加入结合缓冲液之后，可以加入棉以进行相互作用以从给定样本中提取核酸。对于实践目的，结合缓冲液组合物的pH可为4-12间的任一pH，优选为7-10。对如血液、痰液或唾液的复杂样本而言，结合缓冲液可以含有一定百分比的如PEG、甘油、PPG、乙二醇、丙二醇等的水溶性多元醇化合物。PEG和PPG的分子量可为200-200,000，而且对于全部实践目的，其将为1000-20,000。多元醇化合物在结合溶液中的百分比可为最高至50%(v/v)，但是对于全部实践应用，其将为1-30%(v/v)。多元醇化合物用于确保裂解成分的完全相容性，并且，如果蛋白酶K裂解是完全的，那么多元醇百分比可以降低至1%。本领域中已知的缓冲剂包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶等，在pH5-12的范围内，优选在7-10的范围内，可以用来制备结合缓冲液，并且缓冲剂的存在不是强制性的，而是取决于样本类型、样本体积、温度、裂解缓冲液组成，可以使用它。如果使用缓冲盐，其浓度可在1-200mM，优选在1-100mM，且最优选在5-50mM之间变化。上述浓度是结合溶液的浓度，并且在加入到裂解缓冲液之后，浓度将改变，其取决于裂解缓冲液的组成。此外，上述限定的pH为结合缓冲液制成时的pH，并且在加入到裂解缓冲液中时，混合溶液(裂解缓冲液+结合缓冲液)的pH会改变。尽管如甲醇、乙醇和丙醇的醇不是多元醇，但是它们也能够用于制备结合缓冲液。通常，也可以使用任何具有酸、胺、醇、酚、酰胺或酯的官能团作为官能团之一的水溶性液体。
洗涤缓冲液：洗涤缓冲液是一种溶液，其将有选择地洗掉棉中的非核酸成分。如果临床样本是血液，在结合之后，棉将变成棕色，并且为了除去颜色，我们发现洗涤缓冲液(称为洗涤缓冲液1)中存在一定百分比的乙醇有助于除去颜色。特别是，使用包含约1-99%(v/v)、优选约30-70%(v/v)且更优选50%(v/v)乙醇的缓冲液或水进行第一洗涤。如需要，可以进行多次含水乙醇洗涤以除去非核酸成分，并且其可以根据样本而定。甲醇、正丙醇、异丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇、丙二醇或任何其他水溶性醇可以代替洗涤溶液中的乙醇。可以使用洗涤缓冲液2，其中存在单价或二价阳离子，连同洗涤缓冲液1一起使用作为其组成。洗涤缓冲液1和2还可以具有相同组成并且包含水、醇和单价或二价阳离子。使用洗涤缓冲液1和2洗涤棉的次数可为0-10次，并且理想地为1-3次。随后的洗涤通常用去离子水，并且洗涤次数可为1-10，优选2-5，且更优选3-5。在洗涤步骤中使用的去离子水可以用无DNA酶和RNA酶的水，或MilliQ水或过滤水或自来水或地下水代替。我们观察到最初用含水醇洗涤趋向除去大多数非核酸成分，然后接着多次水(100%水)洗涤除去残留的醇。水洗涤确保获得的核酸是不含或最小限度含有PCR抑制剂的PCR可立即使用的。所述洗涤缓冲液可以非必需地包含盐（如MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl）或缓冲剂（如pH 5-12范围内的N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶等）。缓冲剂或盐或他们的组合的浓度可为1-1000mM，优选为20-200mM，且更优选为约100mM。
洗脱缓冲液：任何温热的(45-99°C)水性缓冲剂溶液都可以从棉中洗脱核酸。我们发现洗脱pH是关键性的，但是优选pH在8-11的范围内，而且为了完全回收核酸，应当在45-99°C的温度下进行洗脱。在洗脱步骤中缓冲液制备中使用的去离子水可以用无DNA酶和RNA酶的水，或MilliQ水，或过滤水，或自来水，或地下水代替。本领域已知的缓冲剂包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶等，pH在5-12的范围内，可以用于洗脱，但是，最优选的是具有7-10范围内的pKa的缓冲剂。每当棉用于洗脱结合的核酸时，洗脱缓冲液应当是温热的，而且对于实践考虑，应在45-99°C的范围内。这与大多数文献报道的方法形成鲜明对比，其中，使用去离子水在温热条件下进行洗脱，但是结合于棉的核酸不能用温热水完全洗脱，缓冲液或盐的存在是关键性的。盐可为MgCl2、CaCl2、NaCl、KCl等，浓度为0-100mM，优选为5-50mM。缓冲剂可以选自缓冲液组（即N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶）中。
核酸的回收：使用当前系统，核酸回收依赖于所使用的裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液及其组合。依赖于这种组合，核酸回收可与任何基于二氧化硅的核酸提取系统媲美。还观察到，使用低滴定度的样本，我们的基于棉的核酸提取方法的效率有时优于二氧化硅。
棉的数量：棉的数量取决于临床样本的体积，并且我们发现，对于1-300μl范围内的样本，5-30mg棉是足够的。对于毫升级别的样本体积，50mg以上的棉是必要的。总体上1毫克至10克的棉足以从任何临床、环境或现场样本中提取核酸。
每个测定的价格：因为在本发明的方法中使用的棉是在任何药店或零售店中可商购的药棉(可被高压蒸汽处理或进行纯化)，每个核酸提取的价格是最小的并且是迄今文献中报道的最便宜的方法之一。此外，考虑到排除了核酸洗脱液中存在的偶然的PCR抑制剂，POC使用的简单性和适应性、容易自动操作等使该方法更加出众，每次提取的费用很可能是附加的收获。
溶液的成分和处理的安全性：基于棉的核酸提取系统利用大多数水性来源的缓冲液，使用这种缓冲液，本领域技术人员可以安全有效地处理废物。棉可被填充到药筒中，并且所有的裂解、结合、洗涤溶液都可被置于该药筒用于快速诊断（POC）用途，这样医务工作者或分析员无需处理废物并且所述药筒是配套齐全的。
提取的核酸的使用：使用该实施方式中所述的棉方法提取的核酸可以直接用在PCR或RT-PCR中。所述的棉方法的其他的应用为用于从临床样本中回收核酸用于存档、贮藏、进一步的生化或分子生物学使用等。本领域技术人员将不时发现，提取的核酸可用于任何的生化或分子生物学应用。
以适用于核酸提取的形式使用棉：该实施方式是为了以最少的装备要求（如离心或其他的旋转装备）使用棉以‘PCR可立即使用的形式’提取核酸。根据样本的数量、样本的性质和样本的来源，棉可以任何适于核酸提取的形式填充。优选地，在溶液或乳液中获得核酸，根据所述的裂解、结合、洗涤和洗脱系统对其进行处理。因此，棉填充是核酸提取的关键部分，并且棉能够与含有核酸的溶液接触的任何性质被认为是本公开的部分。图1-3显示了棉可被填充的一些方式，但是其不应以任何方式构成对本发明的限制。简言之，棉以棉接触含有核酸的溶液或者棉接触液体的这样的方式被填充，并且其时本公开的部分。
在另一个实施方式中，棉可被填充到改性塑料1mL吸管端、改性塑料2mL吸管端、15mL falcon管、50mL falcon管、1.5mL eppendorf管、2mL eppendorf管、5mL硼硅玻璃试管、4mL螺旋帽塑料瓶、3mL塑料Pasteur吸量管、玻璃Pasteur吸量管、具有橡胶球的玻璃Pasteur吸量管、具有橡胶球的塑料Pasteur吸量管、具有球形橡胶和塑料模具的玻璃吸量管、具有塑料盖的2mL玻璃管形瓶、一次性高压灭菌的10mL塑料注射器、连接至5mL注射器的塑料模具、连接至50mL注射器的一次性单元等。所述棉还可制成棉头拭子，并且所述棉头拭子可为人造的或机器造的。图3[e]显示了由纤维胶和任何棉混聚合物(1~100%)或着化学或物理改性的棉(1~100%)制成的棉头拭子，其被认为是本公开的一部分。
使用棉储存临床样本：所述棉可直接暴露于样本并且为吸收剂，所述棉将以安全的形式稳定和储存样本。所述安全的形式被定义为这样一种装置，在该装置中所加入的样本的核酸内含物不会被显著降解。结合可以以可逆的形式，其中，使用这个实施方式中描述的核酸提取方法可以提取所述核酸。棉可被非必需地和稳定剂一起被嵌入，这样将提高样本和样本组分的稳定性。非必需地，棉可和酶或化学药品或在这个方法中报道的裂解缓冲液或含有蛋白酶K的裂解缓冲液、或连同稳定缓冲剂的盐一起的蛋白酶K一起被嵌入。所述棉可为EDTA处理过的、叠氮化钠处理过的、碱处理过的、酸处理过的、裂解缓冲液处理过的、蜂蜜处理过的、任何抗菌剂处理过的、任何抗微生物剂处理过的、任何抗病毒化合物处理过的，或者用EDTA和叠氮化钠、抗菌剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗凝血剂、本领域中已知的临床样本的稳定剂、蜂蜜或其任何组合进行处理。加入到棉中存储的样本的体积可为任何体积，但是对于所有的实践目的，其可为1μl~20mL，并且所用的棉的数量可为任何用量，而且对于所有的实践目的，其可为1mg~10克。在收集样本时，其可在裂解缓冲液浸渍过的棉上进行，而且也被认为是本发明公开的一部分。
用于核酸提取的棉填充系统的使用方法：如图1-3所举例说明的，使用报道的在这个实施方式中描述的核酸提取方法，在设备中填充棉。棉与在这个实施方式中描述的裂解、结合、洗涤和洗脱系统进行相互作用的途径可为加热、摇动、涡旋、搅拌、不断移动、吸液、或使固体和液体进行相互作用的其他方式。本质上，含有核酸的液体将与棉纤维发生接触。
在另一个实施方式中，本方法是文献中报道的最简单的和最灵活的核酸提取方法之一。几乎所有文献方法都需要离心以旋下内含物，或需要磁体来以完整状态固定磁性颗粒，或同时需要二者，而在这个实施方式中报道的方法彻底排除了对离心机或磁体的需要。现有的核酸方法在样本的体积上有限制，或者对于更大体积的样本，需要多次处理。这个方法可以使用单个一次性提取系统在几乎相同时间内处理事实上任何数量的样本(就实践目的而言，1μl~20mL)。本方法制造的核酸可以立即用于进一步表征和下游处理(如PCR、序列测定或印迹)。这个系统的简单性使其同样地适用于快速诊断(POC)或建好的实验室，这是第一次在文献中这样报道。
在这个实施方式中描述的棉的方法具有突出的特点，如排除了离心机的使用，最低限度的使用者对使用者的变化，可与二氧化硅方法媲美的效率，与任何现有的核酸方法相比容易使用，能够处理任何数量的样本，出色的核酸回收，能够捡取低滴定度的样本，容易自动化操作，同时适合于已建好的医院设施和快速诊断装备，以及核酸回收和质量的高一致性。
在另一个实施方式中，在本公开所描述的方法以PCR或逆转录酶-PCR (RT-PCR)或序列测定或印迹可立即使用的形式用如棉的纤维状材料从几乎任何生物来源的临床或分析样本中提取核酸。该过程包括裂解、核酸与棉的结合、用水溶液洗涤结合了核酸的棉以及在含有如KCl的盐的缓冲液中洗脱核酸。在二氧化硅或非二氧化硅方法中的典型裂解缓冲液包含如EDTA (螯合剂)的四或二碱离子，其与血液中的铁结合。在该报道的方法中，为了创造所有核酸选择性地与棉结合的环境，加入高浓度的EDTA (10-300mM)。通常，将裂解缓冲液的pH调节至6以确保结合于基质(二氧化硅或非二氧化硅)，在这种情况下，大多数蛋白质和其他成分是中性的或带正电荷的，然而核酸仍然带负电荷并且与基质相互作用。在当前系统中，结合pH应当为碱性(pH 8-11)，并且过量的带负电荷的EDTA(10-300mM)本身担当缓冲剂并且使pH到8左右。我们的方法是第一种核酸被裂解并且能够在碱性pH下与基质结合的方法。结合缓冲液可为水，任何pH在3-11范围内的水性缓冲液，或含有聚乙二醇(PEG，1-30%)或甘油(1-30%)或聚丙二醇(PPG，1-30%)或乙二醇(1-50%)或丙二醇(1-50%)或任何水溶性醇或上述物质的组合的水。结合缓冲液目的是确保稀释裂解缓冲盐，在富含EDTA的氛围中增强核酸的结合以及稳定裂解颗粒。所报道的方法可以容忍宽范围的具有不同pH值的结合缓冲液，这也是文献中第一次提出结合缓冲液pH或组成是如此灵活。较长的样本处理时间、对样本体积的限制和核酸定量的不可行性是FTA卡片的相关缺点，而在这个实施方式中报道的使用棉的核酸提取方法不存在这样的缺点。最后，所有报道的文献的方法都在室温下或者偶尔在升高的温度下在水性缓冲液或水中进行洗脱，而我们的核酸洗涤在室温下用水进行以及洗脱在升高的温度(50-99°C)下进行。使用在这个实施方式中限定的方法和基质，热的去离子水将不会洗脱全部的结合核酸，必须存在缓冲剂或盐或它们的组合。这也与大多数文献报道的方法形成鲜明对比，其可在热的去离子水中从基质中洗脱结合核酸(二氧化硅或非二氧化硅的方法都允许热水洗脱核酸)。洗脱缓冲液可为pH 8-10间的任一pH，说明洗脱pH是灵活的，并且为了有效地从棉中洗脱结合核酸，一些浓度的盐(如KCl)是优选的。
在另一个实施方式中，下述方法中，棉和其他的基于棉的纤维状材料用于在特殊的裂解、结合、洗涤和对于从棉中洗脱核酸是独特的洗脱条件下定量提取核酸。在一个方面，本公开提供了一种使用棉从任何环境、临床、细菌、真菌和动物来源的样本中提取核酸的快速核酸分离系统。所述样本可为细胞裂解物、体液、植物、组织、以及细菌细胞和细胞裂解物。棉和纤维胶分别是天然或人工获得的纤维状材料，我们发现，棉和纤维胶在特定条件下结合核酸。通过DNA和RNA，举例说明核酸结合和核酸在棉上的选择性保留以及核酸在特定洗脱条件下的释放的过程。
在另一个实施方式中，在典型的从如血液的临床样本中提取DNA的过程中，使用含有硫氰酸胍、EDTA、如Tris的缓冲剂、如triton X-100的洗涤剂、非必需的尿素、、多元醇、含有IA族阳离子的单价盐和/或含有IIA族阳离子的二价盐、和如蛋白酶K的蛋白质裂解酶。硫氰酸胍的浓度可为0.1~7M间的任一浓度。在一些应用中可以使用盐酸胍代替硫氰酸胍，并且其浓度也可在1~6M间变化。尿素用于使蛋白质变性，而且它将补足胍盐的功能并且浓度可在0~7M间变化。通常，大多数文献报道的用于血液的裂解方法包含20mM范围的EDTA。为了使核酸有效地结合于棉，我们的裂解缓冲液可以具有显著更高用量的EDTA，浓度为10-300mM，优选约100mM。对于如RNA和PNA的其他核酸而言，可以调整EDTA浓度，但是总体上，我们发现，更高浓度的EDTA有助于改进PCR和RT-PCR的循环次数(Ct)和信号强度。显著更高浓度的EDTA有助于捕获血红蛋白(对于血液)中存在的铁，抑制任何DNA酶的活性，以及产生其中核酸能够与棉结合的高负性氛围。本发明的重要方面在于，在缓冲液中加入显著更高浓度的EDTA使缓冲液的pH为碱性，并且据我们所知，该实施方式是第一个在碱性条件下进行DNA与基质的结合的实例。重要的是，溶液的结合pH必须是碱性的以使核酸能够与棉结合，这是因为在非常酸性的pH下，EDTA可能会从裂解缓冲液中沉淀出来，因此，对于结合而言，pH在8以上是优选的。通常，高浓度使用氯化镁以使RNA酶失活，因此，在核酸裂解方法中，可以使用它。Tris是裂解缓冲剂的选择，并且我们发现，可以使用0-100mM，而且通常约20mM是最佳的。在裂解或结合缓冲液中使用多元醇目的是增加蛋白酶K的活性并改善裂解蛋白质的溶解性。多元醇在裂解缓冲液中的百分比可为0-30%(v/v)。所有这些缓冲液均在去离子水中制成，并且对于RNA应用，所述水可以用DEPC进行处理并高压灭菌。对于血液、痰液、唾液等，蛋白酶K裂解可以在加入上述裂解缓冲液之前完成，而对于尿、汗等可以和裂解缓冲液一起进行。我们发现，蛋白酶K处理在上述裂解缓冲液中是有效的，因此，对于任一种含有核酸的临床样本而言，这种处理可在加入裂解缓冲液之前进行，或可连同裂解缓冲液一起进行。
在另一个实施方式中，在裂解后加入结合缓冲液以开始核酸与棉的结合，我们发现，结合缓冲液在组成方面非常灵活。结合缓冲液如此灵活，以至于仅仅加入水就足以稀释裂解缓冲液中的盐的浓度，并且观察到了核酸与棉的良好结合。在裂解过程中或者在加入结合缓冲液之后，可以加入棉以发送相互作用。结合缓冲液组合物的pH可为5-12之间的任一pH，优选为7-10。对如血液、痰液或唾液的复杂样本而言，结合缓冲液可以含有一定百分比的如PEG、甘油、PPG、乙二醇、丙二醇等的多元醇化合物。我们发现，如乙醇或含水乙醇的传统使用的结合溶液(对于基于二氧化硅的核酸洗脱)降低了核酸对面的结合亲和力，即，我们发现，在结合步骤过程中乙醇的存在降低了核酸结合于棉的效率。
在另一个实施方式中，洗涤缓冲液是一种选择性地洗去棉中的非核酸成分的溶液。如果临床样本是血液，在结合之后，棉颜色将变成棕色，并且为了除去颜色，我们发现洗涤缓冲液(称为洗涤缓冲液1)中的一定百分比的乙醇有助于除去颜色。特别是，使用包含约1-99%(v/v)、优选约30-70%(v/v)且更优选50%(v/v)乙醇的缓冲液或水进行第一洗涤。甲醇、正丙醇、异丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇、丙二醇或任何其他水溶性醇都可以代替该洗涤溶液中的乙醇。可以使用洗涤缓冲液2，其中存在单价或二价阳离子，连同洗涤缓冲液1一起使用作为其组成。洗涤缓冲液1和2还可以具有相同组成并且包含水、醇和单价或二价阳离子。使用洗涤缓冲液洗涤棉的次数可为0-10次，并且理想地为1-3次。随后的洗涤通常用去离子水，并且洗涤次数可为1-10，优选2-5，且更优选3-5。在洗涤步骤中使用的去离子水可以用无DNA酶和RNA酶的水，或MilliQ水或过滤水或自来水或地下水代替。
在另一个实施方式中，可以使用任何水性缓冲液从棉中洗脱核酸。在洗脱缓冲液中，所述缓冲剂的浓度需要为1~200mM，优选为5-50mM，更优选为30-70mM。本领域中已知的缓冲剂包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、乙醇胺、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶等，pH在5-12的范围内，优选在7-10的范围内，更优选在8-10的范围内，将在热条件下用于洗脱棉中的核酸。从棉中洗脱核酸需要在50~100℃、优选在70-95℃、更优选在约85℃的提高的温度下进行。
在另一个实施方式中，纯化的核酸可为10-100%纯，并且通常将是PCR可立即使用的。核酸的纯度取决于裂解、结合、洗涤和洗脱缓冲液与纯化基质(棉或棉衍生物或棉混材料)的最佳组合。我们发现，在这些缓冲液组合中，FTA卡片或纤维素结合颗粒，或纤维素滤纸不是有效的，说明对于与核酸的相互作用而言，棉与其他形式的纤维素是不同的。在相关方法中，本公开提供了一种使用下列通用方法使用棉或棉衍生物或棉混材料作为固体基质从含有核酸的样本中分离核酸的方法。
a)将含有核酸的样本加入到裂解缓冲液中。所述裂解缓冲液由硫氰酸胍、EDTA、Tris、洗涤剂、非必需的尿素、多元醇、含有IA族阳离子的单价盐和/或含有IIA族阳离子的二价盐、和蛋白酶K组成。将所述核酸样本和裂解缓冲液混合并在50-95°C加热1-20分钟。
b)将结合缓冲液加入到上述溶液中，并且结合缓冲液可为水、pH 4-11的缓冲液、或含有多元醇的溶液。所述结合缓冲液的体积可为裂解缓冲液体积的0.1-10倍。
c)使上述溶液与棉进行相互作用，优选在室温下几秒或几分钟。
d)然后特定地使用由水性醇或单独由水组成的洗涤缓冲液洗涤棉(第1洗涤)。
e)随后使用水或缓冲液洗涤上述棉，直到从棉中清除残留的醇。
f)使用由如KCl的盐(含有IA族阳离子或含有IIA族阳离子的盐)和/或N-二(羟乙基)甘氨酸样缓冲剂组成的缓冲液洗脱核酸，并且洗脱的核酸通常可直接用于PCR或RT-PCR。
借助下列表格，进一步详细描述本公开，下列表格提供了本公开使用的方法和现有技术中使用的方法的比较说明。针对用于表征用于分离核酸的方法的各种方法，表格比较了一些重要方面。
表1：核酸分离中涉及的重要方面的对比说明
Figure BDA00001866453100151
实施例
参考以下实施例，进一步阐述本发明的技术。然而所述实施例不构成对本发明范围的限制。
一般方法：优选在室温下将含有核酸的溶液与棉接触，并且用一系列包含水性醇和水的洗涤液从棉上洗脱掉非核酸成分。在升高的温度下用含盐的水性缓冲液从棉上洗脱核酸。洗脱的核酸将直接进一步处理或用于PCR。以下给出的例子中，棉装于研究实验室常用的1mL吸管中。但本领域技术人员能够认识到棉可以装于有机会使液体与棉接触的任何形式中。基本上，具有出口和入口，并在其中可以装载棉的任何装置都被认为是本发明的一部分。
实施例1：从血液中提取DNA
a)将50μl血液加入75μL裂解缓冲液（30μl的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有8mg棉的1mL塑料滴管(棉滴管，如图2[a]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)用洗涤缓冲液1(50%乙醇)和洗涤缓冲液2(含有100mM的MgCl2的50％乙醇)各2mL洗涤棉滴管。
e)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)。
f)95℃下在100μL洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例2：从血液中提取DNA
a)将100μl血液加入150μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将300μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的1mL塑料吸液管滴头(棉滴头，如图3[c]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)用1mL洗涤缓冲液1(50%乙醇)和2mL洗涤缓冲液2(含有100mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)。
f)95℃下在200μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例3：从血液中提取DNA
a)将100μl含血液的疟原虫（恶性疟原虫）加入150μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将300μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的1mL模制吸液管滴头(棉滴头，如图3[c]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)用1mL洗涤缓冲液1(50%乙醇)洗涤棉滴头。
e)用2mL洗涤缓冲液2(含有100mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
f)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)。
g)95℃下在200μL洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例4：从血液中提取RNA
a)将50μl切昆贡亚热阳性血(Chikungunya positive blood)加入75μL裂解缓冲液（30μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的1mL吸液管滴头，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用1mL洗涤缓冲液1(含有50mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)。
f)95℃下在200μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例5：从唾液中提取DNA
a)将50μl唾液加入100μL裂解缓冲液（10μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，200mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将溶液在85℃加热2分钟。
b)将250μL的结合缓冲液（10％甘油水溶液）加入上述溶液中。
c)制备装有棉的1mL模制吸液管滴头(棉滴头，如图3[c]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有200mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)，每次洗涤中吸取该液体三次。
f)95℃下在250μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例6：从血液中提取RNA
a)将100μl切昆贡亚热阳性血加入150μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将300μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的1mL模制吸液管滴头(棉滴头，如图3[c]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用1mL洗涤缓冲液1(50％乙醇)和2mL洗涤缓冲液2(含有50mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉滴头(2X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例7：从血液中提取RNA
a)将50μl切昆贡亚热阳性血加入75μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，80mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到55℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在70℃加热2分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 8000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的2.5mL注射器(棉注射器，如图1[a]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用1mL洗涤缓冲液1(50％乙醇)和2mL洗涤缓冲液2(含有50mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉注射器(3X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例8：从痰液中提取DNA
a)将100μl痰液加入150μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下5分钟。然后将该溶液在75℃加热2分钟。
b)将300μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的5mL波纹式吸液管（bellow pipette）(棉波纹管，如图2[b]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用1mL洗涤缓冲液1(50％的乙醇)和洗涤缓冲液2(含有50mM的MgCl2的50％的乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉波纹管(3X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例9：从血清中提取DNA
a)将50μl血清加入75μL裂解缓冲液（60μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的1mL模制吸液管滴头(棉滴头，如图3[c]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用1mL洗涤缓冲液1(50％的乙醇)和2mL洗涤缓冲液2(含有50mM的MgCl2的50％的乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)。
f)95℃下在200μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例10：从血清中提取RNA
a)将100μl切昆贡亚热阳性血清加入150μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热2分钟。
b)将300μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备装有10mg棉的1mL模制吸液管滴头(棉滴头，如图3[c]所示)，以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有50mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉滴头。
e)用水洗涤棉滴头(3X 1mL)。
f)95℃下在200μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例11：从痰液中提取DNA
a)将50μl痰液加入150μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100，pH为9.5）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在85℃加热6分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备10mg棉以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有50mM的MgCl2的50％的乙醇)洗涤棉。
e)用水洗涤棉(3X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例12：从痰液中提取DNA
a)将50μl痰液加入75μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100，pH为9.5）中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下5分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备10mg棉以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有50mM的MgCl2的50％的乙醇)洗涤棉。
e)用水洗涤棉(3X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例13：从组织中提取RNA
a)将50μl狂犬病阳性组织(rabies positive tissue)加入175μL裂解缓冲液（40μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的TritonX-100，pH为9.5）中，涡旋7分钟，并将上清液转移到试管中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在75℃加热3分钟。
b)将350μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备20mg棉以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有100mM的MgCl2的50％的乙醇)洗涤棉。
e)用水洗涤棉(3X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例14：从血液中提取RNA
a)在DEPC水中制备裂解缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
b)将50μl切昆贡亚热血加入50μL的10mg/mL的蛋白酶K和250μL裂解缓冲液（5.6M的硫氰酸胍，20mM的EDTA，20mM的Tris，100mM的MgCl2，0.01％的TritonX-100）中。将试管加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在80℃加热2分钟。
c)将1mL的结合缓冲液（10%的PEG 6000）加入上述溶液中。
d)制备装有10mg棉的3mL注射器(棉注射器，如图1[a]所示)，通过前后拉注射器杆五次以与上述溶液进行相互作用。
e)通过前后拉注射器杆七次，小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有100mM的MgCl2的50％乙醇)洗涤棉注射器。
f)通过每次洗涤中随液体前后推拉注射器杆三次，用水洗涤棉注射器(3X 2mL)。
g)通过随液体前后推拉注射器杆两次，95℃下在200μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
h)以PCR直接可用的形式(PCR ready form)获得存在于血液中的核酸，总方法花费约9分钟。
实施例15：肽核酸(PNA)的提取
a)将50μl含PNA的标准溶液加入75μL裂解缓冲液（10μL的10mg/mL的蛋白酶K，5.6M的硫氰酸胍，100mM的EDTA，20mM的Tris，0.01％的Triton X-100，pH为9.5）中，涡旋7分钟，并将上清液转移至试管中。将得到的溶液加热到60℃，并置于该温度下3分钟。然后将该溶液在75℃加热3分钟。
b)将150μL的结合缓冲液（含有0.1g/mL PEG 6000的水）加入上述溶液中。
c)制备10mg棉以与上述溶液进行相互作用。
d)小心地用3mL洗涤缓冲液1(含有100mM的MgCl2的50％的乙醇)洗涤棉。
e)然后用水洗涤棉(3X 1mL)。
f)95℃下在100μl洗脱缓冲液(10mM的N-二(羟乙基)甘氨酸，10mM的KCl，pH为9.8)中洗脱核酸。
实施例16：PCR的扩增
对通过本公开的方法纯化的DNA/RNA样品进行PCR扩增，随后进行凝胶电泳。结果如图4、5、6和7中所示。图4提供了使用纤维胶、商业粘胶拭子(commercial viscoseswab)、装在1mL吸液管滴头中的棉、商业硅胶柱和棉拭子分离并纯化的DNA样品的对比带。与此相似地，图5提供了通过不同方法，即装在1mL吸液管滴头中的棉、装在2mL注射器中的棉、商业硅胶柱和分子量标记物，分离并纯化的DNA样品的对比带。
另外，图6提供了通过不同方法，即分子量标记物、商业二氧化硅方法、装在1mL吸液管滴头中的棉、装在吸液管滴头中的Whatman 1号滤纸和FTA卡方法，纯化的DNA样品的对比带。
进而，图7提供了通过RT-PCR扩增的30ct的RNA样品的对比带，其采用不同的方法纯化。所述方法采用不同来源的棉基质，即药棉、高压蒸汽处理棉、氢氧化钠水洗棉、盐酸水洗棉和吸收棉。
虽然本发明在此已经公开了多个方面和实施方式，但是其它方面和实施方式对本领域技术人员而言是显而易见的。在此公开的多个方面和实施方式用于说明目的，并不对在随后的权利要求中表明的实际范围和实质构成限制。

Claims (31)

1.一种从样本中分离核酸的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)将裂解缓冲液加入到含有核酸的样本中以得到裂解溶液；或者
(b)将裂解缓冲液连同结合缓冲液一起加入到样本中以得到裂解溶液；
(c)将结合缓冲液加入到步骤(a)的溶液中以使核酸与基质结合，或者使步骤(b)的溶液与基质直接结合；和
(d)洗涤和洗脱与基质结合的核酸以分离和纯化核酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸选自包括DNA、RNA和PNA的组中。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述样本为生物或非生物样本。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述生物样本选自包括血液、痰液、血清、唾液或组织提取液的组中，以及所述非生物样本选自包括化学合成的PNA的组中。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述裂解缓冲液选自包括硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA、Tris、洗涤剂、多元醇、含有IA族阳离子的单价盐或含有IIA族阳离子的二价盐、消化蛋白质的酶、非必需的尿素、或其任何组合的组中。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述EDTA的浓度在约10mM~约300mM的范围内，优选为约100mM。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述硫氰酸胍或所述盐酸胍的浓度在约0.1M~约7M的范围内。
8.如权利要求5所述的方法，其中，所述尿素的浓度在约0.01M~约7M的范围内。
9.如权利要求5所述的方法，其中，所述Tris的浓度在约0.01mM~约100mM的范围内，优选为约20mM。
10.如权利要求5所述的方法，其中，所述多元醇的浓度在约0.01%~约30%(v/v)的范围内。
11.如权利要求5所述的方法，其中，所述洗涤剂选自包括月桂硫酸钠、十二烷基硫酸钠、Triton X-100、NP-40、吐温20或其任何组合的组中，以及其中，所述消化蛋白质的酶为蛋白酶K。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述结合缓冲液为水，非必需地含有多元醇或非多元醇。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述多元醇包括选自聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇中的水溶性多元醇化合物。
14.如权利要求12所述的方法，其中，所述非多元醇包括由甲醇、乙醇、丙醇构成的醇；或任何具有酸、胺、醇、酚、酰胺或酯的官能团作为官能团之一的水溶性液体；或其任何组合。
15.如权利要求1所述的方法，其中，所述洗涤和洗脱分别使用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液进行。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述洗涤包括使用包含约1%~约99%(v/v)、优选约30%~约70%(v/v)且最佳约50%(v/v)的水性醇的洗涤缓冲液进行第一洗涤，然后使用包含100%的水的洗涤缓冲液进行多次洗涤。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述水性醇选自包括乙醇、甲醇、正丙醇、异丙醇、甘油、PEG、PPG、乙二醇和丙二醇的组中。
18.如权利要求16所述的方法，其中，所述水选自包括去离子水、无DNA酶水、无RNA酶水、MilliQ水、过滤水、自来水、地下水或其任何组合的组中。
19.如权利要求15和16所述的方法，其中，所述洗涤缓冲液可以非必需地包含选自包括MgCl2、CaCl2、NaCl和KCl的组中的盐或pH在约5~约12的范围内的选自包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺和哌啶的组中的缓冲剂。
20.如权利要求15所述的方法，其中，所述洗脱缓冲液包含温度在约45°C~约99°C范围内的温水，同时含有pH在约8~约11的范围内的缓冲剂或盐。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述水选自包括去离子水、无DNA酶水、无RNA酶水、MilliQ水、过滤水、自来水、地下水或其任何组合的组中。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述缓冲剂选自包括N-二(羟乙基)甘氨酸、曲辛、Tris、HEPES、CHAPS、磷酸盐、醋酸盐、MES、吡啶、哌嗪、Bis-tris、PIPES、ACES、BES、TES、硼酸盐、TAPS、CHES、CAPS、乙醇胺、哌啶及其任何组合的组中，所述缓冲剂的pH在约5~约12的范围内，或者所述缓冲剂的pKa在约7~约10的范围内。
23.如权利要求20所述的方法，其中，所述盐选自包括MgCl2、CaCl2、NaCl和KCl或其任何组合的组中，浓度在约0.01mM~约100mM的范围内，优选在约5mM~约50mM的范围内。
24.如权利要求1所述的方法，其中，所述基质选自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何组合的组中。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述棉选自包括天然棉、药棉、临床级棉、商品棉、棉纱、水洗棉、酸或碱洗棉、高压蒸汽处理棉、pH在约1~约14范围内的缓冲液处理棉、盐溶液处理棉、有机溶剂处理棉、压缩棉和加工棉的组中。
26.一种用于从样本中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括基质和缓冲液。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述基质选自包括棉、棉衍生物、具有棉共混物的合成聚合物或其任何组合的组中。
28.如权利要求27所述的试剂盒，其中，所述棉选自包括天然棉、药棉、临床级棉、商品棉、棉纱、水洗棉、酸或碱洗棉、高压蒸汽处理棉、pH在约1~约14范围内的缓冲液处理棉、盐溶液处理棉、有机溶剂处理棉、压缩棉和加工棉的组中。
29.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述缓冲液选自包括如权利要求5~11中所述的裂解缓冲液、如权利要求12~14中所述的结合缓冲液、如权利要求15和19中所述的洗涤缓冲液以及如权利要求15和20~23中所述的洗脱缓冲液的组中。
30.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述样本包括生物或非生物样本。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述生物样本选自包括血液、痰液、血清、唾液或组织提取液的组中，以及所述非生物样本选自包括化学合成的PNA的组中。
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