RU2628695C1 - Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления - Google Patents

Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
RU2628695C1
RU2628695C1 RU2016123395A RU2016123395A RU2628695C1 RU 2628695 C1 RU2628695 C1 RU 2628695C1 RU 2016123395 A RU2016123395 A RU 2016123395A RU 2016123395 A RU2016123395 A RU 2016123395A RU 2628695 C1 RU2628695 C1 RU 2628695C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
rna
dna
solution
carrier
nucleic acids
Prior art date
Application number
RU2016123395A
Other languages
English (en)
Inventor
Ольга Николаевна Жигалева
Василий Михайлович Шестюк
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Биологическая среда"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Биологическая среда" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Биологическая среда"
Priority to RU2016123395A priority Critical patent/RU2628695C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2628695C1 publication Critical patent/RU2628695C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ выявления РНК и ДНК из сухих биологических образцов и набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов. Вышеуказанный способ включает в себя освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот. Осаждение ДНК и РНК осуществляется раствором, содержащим изопропанол и C6H10O5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в отношении 40:0,5 соответственно. Изобретение расширяет арсенал средств выделения нуклеиновых кислот. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл, 3 пр.

Description

Группа изобретений относится к области медицины и биотехнологии, и может быть использовано для одновременного выделения РНК и ДНК из биологических образцов, хранившихся в высушенном формате на бумажном носителе при диагностике вирусных, бактериальных патогенов, дрожжей, микозов.
В настоящее время существует множество методов экстракции нуклеиновых кислот (НК) из разнообразного клинического материала, основанных на различных принципах. В частности для подготовки проб к ПНР анализу, чаще всего используются для выделения НК сорбционные методы, экспресс-методики на основе температурного лизиса и методы на основе спиртового осаждения. Однако каждый из этих подходов обладает как достоинствами, так и недостатками. Следовательно, необходимость в усовершенствовании методов по выделению нуклеиновых кислот с учетом имеющихся недостатков и в соответствии с типом анализируемого материала не потеряла своей актуальности.
Выделение ДНК и РНК из биологических образцов является важным этапом молекулярно-генетического исследования. От качества его исполнения зависит успех всех последующих этапов исследования и конечный результат. Поэтому особое значение приобретает правильный выбор метода выделения ДНК, так как его неправильное проведение могут привести либо к получению загрязненной ДНК, непригодной для исследования, либо вообще к потере ДНК. Особенно это относится к выделению нуклеиновых кислот из сухих биообразцов.
В настоящее время для выделения НК из сухих образцов применяются методы, которые уже на первом этапе используют либо лизирующие реагенты, либо буферные растворы. Однако, чувствительность при такой обработке биообразца не всегда бывает достаточной для исследования с целью диагностики вирусных, бактериальных патогенов, дрожжей и микозов.
Таким образом, известен способ выделения НК из различных сухих биологических образцов и набор для его осуществления «ДНК-сорб-В», содержащий лизирующий раствор, раствор для отмывки 1, раствор для отмывки 2, сорбент универсальный и ТЕ-буфер для элюции ДНК. Для выделения в промаркированные пробирки вносят подготовленные нарезки и 500 мкл лизирующего раствора. Встряхивают на вортексе и добавляют 12,5 мкл Протеиназы К и инкубируют в течение 3 часов при температуре 56°С (или в течение ночи при температуре 37°С) при периодическом перемешивании. После чего осторожно переносят раствор в чистую пробирку, оставляя предмет-носитель на дне, центрифугируют 2 минуты при максимальных оборотах (13-16000 об/мин) на микроцентрифуге. Использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новые пробирки. Далее из надосадочной жидкости проводят выделение ДНК. Вносят по 25 мкл ресуспендированного сорбента и центрифугируют для осаждения, с последующим отмываем раствором 1, затем осаждают сорбент центрифугированием и вновь проводят отмывку раствором 2, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования сорбента и после многократного центрифугирования подсушивают пробирки в термостат 65°С на 5-10 минут для подсушивания сорбента. И в пробирки добавляют по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК (Ветринская А.А., Кузовлева Е.Б. Использование комплекта реагентов «ДНК-СОРБ-В» для выделения ДНК из различных объектов биологического происхождения в криминалистических целях., 2010, Вестник КазНПУ, найдено 19.05.2016 в Интернет: http://articlekz.com/article/10446). Однако использование указанного набора и выполнения способа является сложным, затратным и длительным по времени.
Наиболее близким техническим решением к заявленному, является способ и набор для выделения нуклеиновых кислот, в частности ДНК из сухих пятен крови и набор реагентов для осуществления способа «РИБО-преп» путем экстракции ДНК из одного сухого пятна крови. В пробирку, содержащую бумагу с сухими пятнами крови, и с контрольными образцами, добавляют по 700 мкл раствора дляяяйзиса. Затем закрывают пробирки и аккуратно перемешивают содержимое пробирки на вортексе. Далее переставляют пробирки в термостат и прогревают при 65°С в течение 30 минут. Во время инкубации пробирки встряхивают на вортексе каждые 8-10 минут. После чего их вновь центрифугируют на микроцентрифуге в течение 1 минуты при 10 тыс.об/мин. Добавляют в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки, плотно закрывают крышки и осторожно промывают осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, а элюцию осуществляют с помощью 50 мкл РНК-буфера и центрифугирования (Инструкция по применению набора реагентов для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL», приказ Росздравнадзора от 12.10.2012, №1897-Пр112). Однако данный способ и набор также не обладают высокой степенью очистки ДНК, имеют ограниченную область использования и длительность процедуры выделения.
Технический результат заявленных способа и набора заключается в том, что при их использовании повышается выход нуклеиновых кислот - ДНК и РНК из сухих биологических образцов, полноценное их выделение, за счет высокой степени лизиса клеточных оболочек, освобождения от цельных эритроцитов при относительной простоте исполнения. Все это позволяет получить целостный исследуемый образец, подходящий для диагностических исследований.
Технический результат достигается тем, что создан способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, включающий освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот, при этом освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют с помощью дистиллированной воды с рН 5,5-6,0, а лизис биообразца проводят раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 с последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°С, а осаждение ДНК и РНК осуществляют раствором, содержащим изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в соотношении 40:0,5 соответственно.
Причем выделение РНК и ДНК проводят одновременно.
В предпочтительном варианте освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют путем добавления в него дистиллированной воды с рН 5,5-6,0 и периодического перемешивая на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут.
В предпочтительном варианте для осаждения бумажного носителя биообразец центрифугируют в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин.
В предпочтительном варианте для отмывки осадка используют раствор, содержащий в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле.
В предпочтительном варианте элюцию нуклеиновых кислот, проводят с помощью буфера, содержащего в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0.
В предпочтительном варианте лизирующий раствор обеспечивает полноценный лизис оболочечных и безоболочечных вирусов, а так же всех видов бактерий, паразитов, микозов и повышает выход НК из бактерий, имеющих плотную клеточную оболочку.
В предпочтительном варианте лизирующий раствор позволяет проводить полноценное выделение НК из крови, освобождая образец от цельных эритроцитов.
Кроме того технический результат достигается тем, что создан набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов путем освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, где набор содержит следующие компоненты: раствор для освобождения биологического образца от носителя, содержащий дистиллированную воду с рН 5,5-6,0; раствор для лизиса оболочек клеток, содержащий 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, 1 н HCl; раствор для осаждения нуклеиновых кислот, содержащий гликоген формулой С6Н10О5 и изопропиловый спирт; раствор для промывки биологического образца, содержащий ацетат аммония и 75% этанол; буфер для элюции нуклеиновых кислот, содержащий трис HCl с рН 8,0 и EDTA с рН 8,0.
Осуществление группы изобретений.
В описании подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящей группы изобретений, и оно не ограничивается приведенными ниже предпочтительными вариантами осуществления, и его можно без ограничений модифицировать в объеме настоящего изобретения.
Выделение РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, проводят одновременно с помощью набора реагентов, а именно раствора для освобождения биологического образца от носителя, содержащего дистиллированную воду с рН 5,5-6,0; раствора для лизиса оболочек клеток, содержащего 8 М гуанидинтиоционата, 6,5 М NaCl, 1 н HCl; раствора для осаждения нуклеиновых кислот, содержащего гликоген формулой С6Н10О5 и изопропиловый спирт; раствора для промывки биологического образца, содержащего ацетат аммония и 75% этанол и буфера для элюции нуклеиновых кислот, содержащего трис HCl с рН 8,0 и EDTA с рН 8,0. Для этого проводят освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму. В частности, например, в день исследования бумажные носители образцов распаковывают из защитной карты, разрезают вдоль по всей длине полоске, опускают в пробирку на 0,5 см и разрезают через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя биологических образцов поместились в 1,5 мл пробирке. В пробирки добавляют 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0, периодически перемешивают на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут. За это время сухой биологический образец растворяется и смывается с носителя. По истечению этого времени биологический образец центрифугируют в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин., с целью осаждения бумажного балласта. Образовавшуюся жидкость переносят в чистую пробирку, из которой проводят выделение РНК и ДНК набором реагентов. То есть проводят лизис клеточных оболочек раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 и последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°С. Затем в эту пробирку с биологическим образцом добавляют осаждающий раствор, содержащий изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в соотношении 40:0,5 соответственно. После чего содержимое тщательно перемешивают и центрифугируют в течение 7 минут при 14 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость сливают из пробирки, а осадок промывают отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле, ручным перемешиванием содержимого пробирки в течении 30 секунд и центрифугированием в течение 30 секунд при 14 тыс.об/мин. Осадок растворяют в элюирующем буфере, содержащим в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0. Полученные ДНК и РНК используют в ПЦР. Используемые способ и набор обеспечивают полноценный лизис оболочечных и безоболочечных вирусов, а так же всех видов бактерий, паразитов, микозов, полноценное выделение НК из крови, освобождая образец от цельных эритроцитов, и повышают выход НК из бактерий, имеющих плотную клеточную оболочку. Все это позволяет упростить процедуру выделения ДНК и РНК, что дает возможность повысить достоверность и чувствительность дальнейшего исследования.
Примеры реализации способа выделения ДНК и РНК из сухих биологических образцов с помощью заявленного набора реагентов.
Пример 1
Биологический материал отбирался от пациентов в виде крови и урогенитальных мазков. Затем в объеме 130 мкл наносился на бумажный носитель в полоски, высушивали в течении 1,5 часов при комнатной температуре. После высыхания биологического материала бумажный носитель упаковывали в защитную карту и хранили в бытовом холодильнике до исследования. В день исследования бумажные носители образцов распаковывали из защитной карты, разрезали вдоль по всей длине полоске, опускали в пробирку на 0,5 см и разрезали через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя образцов поместились в 1,5 мл пробирке. После чего в пробирки с биологическим образцом на носителе добавляли 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0,. При этом периодически перемешивали на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут. За это время сухой образец растворяется и смывается с носителя. По истечении этого времени осуществляли центрифугирование биологического образца в течении 30 секунд при 10 тыс. об/мин, с целью осаждения бумажного балласта. Образовавшуюся жидкость переносили в чистую пробирку, из которой проводили выделение нуклеиновой кислоты набором реагентов:
- Лизирующим раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к смеси 1 н HCl до становления рН 6,4;
- Раствором осаждающим, содержащим изопропанол и С6Н10О5 в конечной концентрации 27 мг/мл, из расчета на 40 мл изопропанола - 200 мкл гликогена.
- Отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ Ацетат аммония в 75% этаноле.
- Элюирующим буфером, содержащим в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0.
То есть проводили лизис клеточных оболочек раствором, содержащим в конечной концентрацией М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 и последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°С. Затем в эту пробирку с биологическим образцом добавляли осаждающий раствор, содержащий изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятых в соотношении 40:0,5 соответственно. После чего содержимое тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 7 минут при 14 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали из пробирки, а осадок промывали отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле, с ручным перемешиванием содержимого пробирки в течение 30 секунд и центрифугировали в течение 30 секунд при 14 тыс.об/мин. Осадок растворяли в элюирующем буфере, содержащем в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0. Полученные нуклеиновые кислоты использовали в ПЦР. В работу были приняты как отрицательные пробы, так и положительные, с целью проверки контаминации в процессе исследований. Пробы взяты из рутинного потока лабораторных исследований жидких образов, с коммерческим набором, производства ООО «НаноДиагностики». В итоге отрицательные пробы остались отрицательными, а положительные - положительными.
Результаты выделение ДНК бактерий из сухих образцов показаны в таблице 1.
Figure 00000001
Figure 00000002
Из таблицы видно, что такой способ получения нуклеиновых кислот из сухих образов позволяет их идентифицировать. Пример 2
Исследовали сухие биологические материалы крови и урогенитальных мазков человека, нанесенные на бумажные носители. Выделение нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) проводили с помощью набора реагентов:
- Раствора для освобождения биологического образца от носителя, содержащий дистиллированную воду с рН 5,5-6,0
- Лизирующего раствора, содержащего в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, а 1 н HCl добавляют до становления рН 6,4;
- Осаждающего раствора, содержащего изопропанол и С6Н10О5 в конечной концентрации 27 мг/мл, из расчета на 40 мл изопропанола - 200 мкл гликогена.
- Отмывочного раствора, содержащего в конечной концентрации 10 мМ Ацетат аммония в 75% этаноле.
- Элюирующего буфера, содержащего в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0
Бумажные носители образцов распаковывали из защитной карты, разрезали вдоль по всей длине полоске, опускали в пробирку на 0,5 см и разрезали через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя образцов поместились в 1,5 мл пробирке. В пробирки добавляли 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0, периодически перемешивали на вортексе в течение 10 минут по 30 секунд. За это время сухой образец растворяется и смывается с носителя. По истечению этого времени откручивали пробирки в течение 30 секунд при 10 тыс.об/мин. Далее образовавшуюся жидкость переносили в чистую пробирку. Добавляли 500 мкл лизирующего раствора, содержащего в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, а 1 н HCl добавляют до становления рН 6,4, перемешивали на вортексе и инкубировали при 65°С в течение 10 минут, при 60°С в течение 10 минут, при 60°С в течение 5 минут, при 65°С в течение 5 минут, далее в этот биологический образец добавляли осаждающий раствор из расчета на 40 мл изопропанола брали 200 мкл гликогена, тщательно перемешивали пробирки, и центрифугировали 7 минут при 14 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали из пробирки, а осадок промывали отмывочным раствором, содержащим в конечной концентрации 10 мМ Ацетата аммония в 75% этаноле с перемешиванием ручным способом пробирки с осадком в течение 30 секунд. После чего центрифугировали 30 секунд при 14 тыс. об/мин. Осадок растворяли в элюирующем буфере, содержащем в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8. Выделенную нуклеиновую кислоту использовали в ПЦР. Результаты представлены в таблице 2.
Figure 00000003
Figure 00000004
Как видно из таблицы 2, применение режима инкубации 65°С в течение 10 минут на стадии проведения лизиса биологического образца позволяет выявлять все положительные пробы без потерь.
Пример 3
При проведении исследований сухих биологических образцов крови от пациентов с применением описанного способа перевода сухих образцов в жидкую форму происходит осмотический лизис эритроцитов. Вода поступает внутрь эритроцитов, они набухают и лопаются. Цельные эритроциты выступают как ингибиторы процесса выделения нуклеиновых кислот. Следовательно, освобождение от цельных эритроцитов биологического образца позволяет улучшить качество процесса выделения нуклеиновых кислот. Заявленная нами методика и набор реактивов обеспечивают полноценный лизис бактериальных плотных клеточных стенок. В данном примере показано использование стандартных молярностей лизирующих растворов - 1) в конечной концентрации 5 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с 1 н HCl добавленным до рН 6,4; 2) в конечной концентрации 6,5 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с 1 н HCl добавленным до рН 6,4; 3) в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с 1 н HCl добавленным до рН 6,4.
Бумажные носители образцов распаковывали из защитной карты, разрезали вдоль по всей длине полоске, опускали в пробирку на 0,5 см и разрезали через каждые 0,5 см, так, чтобы все части полоски-носителя образцов поместились в 1,5 мл пробирке. В пробирки добавляли 300 мкл дистиллированной воды рН 5,5-6,0, периодически перемешивали на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут. За это время сухой образец растворяется и смывается с носителя. По истечению этого времени откручивали пробирки в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин. с целью осаждения бумажного балласта. Образовавшуюся жидкость переносили в чистую пробирку, из которой проводили выделение нуклеиновой кислоты с применением лизирующего буфера разной концентрации гуанидинтиоционата. Все остальные стадии проводили как в примере 1. Сухие образцы проверялись в потоке проводимых диагностических исследований. Результаты по сухим образцам сравнивали с результатами, полученными из жидких образов, и они разнились. Результаты по положительным и отрицательным пробам с применением 8 М гуанидинтиоционата в лидирующем буфере соотносились с результатами из сухих образцов. Отрицательные пробы были выявлены как отрицательные, что говорит о чистоте проводимых исследований, исключающих контаминацию. Результаты представлены в таблицах 3 и 4.
Figure 00000005
Figure 00000006
Из таблицы 3 видно, что проведение процедуры выделения ДНК бактерий, имеющих различный слой клеточной стенки с конечной концентрацией 6,5 М гуанидинтиоционата (верхняя часть таблицы) и с 5 М гуанидинтиоционата (нижняя часть таблицы) в лизирующем буфере не позволяет получать идентичные результаты. Результаты показывают, что лизирование клеточной стенки бактерий проходит плохо, что влияет на выход из клеток искомой ДНК. Данные показывают, что выявления лактобактерий происходит без потерь, так как эти бактерии имеют тонскую клеточную стенку. При выявлении бактерий Уриеаплазм и Гарднерелл наблюдаются тенденция к потери образцов. Видно отсутствие Ст-флуоресцентного сигнала.
Figure 00000007
Figure 00000008
Из таблицы 4 видно, что выделение ДНК бактерий, имеющих различный слой клеточной стенки с конечной концентрацией 6,5 М гуанидинтиоционата (верхняя часть таблицы) в лизирующем буфере проходит плохо, получаются ложноотрицательные результаты. А использование 8 М гуанидинтиоционата (нижняя часть таблицы) в лизирующем буфере позволяет выявлять полноценно искомую ДНК, а это значит, что лизирование клеточной стенки различных бактерий проходит успешно. При выявлении ДНК бактерий с 6 М гуанидинтиоционата Уриеаплазм и Гарднерелл, имеющих в своем физиологическом составе плотную клеточную стенку, наблюдаются тенденция к потере проб, так как Ст-флуоресцентный сигнал отсутствует. А с использованием 8 М гуанидинтиоционата в лизирующем буфере происходит 100% выявления ДНК бактерий из всех сухих образов мазков, соотносимых с выявлением их из жидких проб.
Результаты выявления РНК вирусов представлены в таблице 5.
Figure 00000009
Как видно из таблицы 5 РНК выделяется из сухих образов с применением методики лизиса с инкубацией при 65°С в течение 10 минут с 8 М гуанидинтиоционата в лизирующем буфере. РНК вируса гепатита С при диагностике определяли из крови. Нами были проверены образцы сухой крови от нескольких пациентов с ранее поставленным диагнозом при этом РНК данного вируса было обнаружено у всех пациентов с вирусом этого возбудителя. Ст, представленные цифрами, описанными в таблице, показывают, что РНК вирус обнаруживается на ранних циклах, что говорит о хорошем процессе выделения РНК из сухих образов. Так же нами проверены носоглоточные смывы на обнаружения РНК коронавируса. Показатели Ст говорят о том, что РНК коронавируса выходит в тех же пределах, что и выделяемая ДНК из урогенитальных смывов.
Таким образом, заявленные способ и набор обеспечивают в полной мере повышение выхода нуклеиновых кислот - ДНК и РНК из сухих биологических образцов. Они просты в использовании и сокращают длительность проведения процедуры полноценного выделения нуклеиновых кислот, за счет высокой степени лизиса клеточных оболочек, освобождения от цельных эритроцитов и в конечном итоге позволяют получить целостный исследуемый образец, подходящий для диагностических исследований с высокой чувствительностью.

Claims (14)

1. Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, включающий освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот, отличающийся тем, что освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют с помощью дистиллированной воды с рН 5,5-6,0, а лизис биообразца проводят раствором, содержащим в конечной концентрации 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, с добавлением к этой смеси 1 н HCl до рН 6,4 с последующей его инкубацией в течение 10 минут при температуре 65°C, а осаждение ДНК и РНК осуществляют раствором, содержащим изопропанол и С6Н10О5 в исходной концентрации 27 мг/мл, взятые в соотношении 40:0,5 соответственно.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение РНК и ДНК проводят одновременно.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму осуществляют путем добавления в него дистиллированной воды с рН 5,5-6,0 и периодического перемешивая на вортексе по 30 секунд в течение 10 минут.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что для осаждения бумажного носителя биообразец центрифугируют в течение 30 секунд при 10 тыс. об/мин.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что для отмывки осадка используют раствор, содержащий в конечной концентрации 10 мМ ацетата аммония в 75% этаноле.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что элюцию нуклеиновых кислот проводят с помощью буфера, содержащего в конечной концентрации 10 мМ трис-HCl рН 8,0 и 1 мМ EDTA рН 8,0.
7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что лизирующий раствор обеспечивает полноценный лизис оболочечных и безоболочечных вирусов, а также всех видов бактерий, паразитов, микозов и повышает выход НК из бактерий, имеющих плотную клеточную оболочку.
8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что лизирующий раствор позволяет проводить полноценное выделение НК из крови, освобождая образец от цельных эритроцитов.
9. Набор для выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов путем освобождение биологического образца от носителя и перевод его в жидкую форму, лизис клеточных оболочек, осаждение, отмывку осадка и элюцию из него нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, где набор содержит следующие компоненты:
1) раствор для освобождения биологического образца от носителя, содержащий дистиллированную воду с рН 5,5-6,0;
2) раствор для лизиса оболочек клеток, содержащий 8 М гуанидинтиоционата, 6,5М NaCl, 1 н HCl;
3) раствор для осаждения нуклеиновых кислот, содержащий гликоген формулой С6Н10О5 и изопропиловый спирт;
4) раствор для промывки биологического образца, содержащий ацетат аммония и 75% этанол;
5) буфер для элюции нуклеиновых кислот, содержащий трис HCl с рН 8,0 и EDTA с рН 8,0.
RU2016123395A 2016-06-14 2016-06-14 Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления RU2628695C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016123395A RU2628695C1 (ru) 2016-06-14 2016-06-14 Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016123395A RU2628695C1 (ru) 2016-06-14 2016-06-14 Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2628695C1 true RU2628695C1 (ru) 2017-08-21

Family

ID=59744782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016123395A RU2628695C1 (ru) 2016-06-14 2016-06-14 Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2628695C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011083429A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Bigtec Private Limited A method for isolation of nucleic acids and a kit thereof
RU2014124569A (ru) * 2014-06-17 2015-12-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет Способ выделения нуклеиновых кислот

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011083429A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Bigtec Private Limited A method for isolation of nucleic acids and a kit thereof
RU2014124569A (ru) * 2014-06-17 2015-12-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный аграрный университет Способ выделения нуклеиновых кислот

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S. MCLLROY, К. PORTER, R. J. SEVIOUR, D. TILLET "SIMPLE AND SAFE METHOD FOR SIMULTANEOUS ISPLATION OF MICROBIAL RNA AND DNA FROM PROBLEMATIC POPULATIONS". Environ Microbiol. 2008, November; 74(21):6806-6807. *
Г.Ф. ИГИСИНОВА, С.Н. ДУСИПОВ, А.Б. БУРАБАЕВА, Ж.Ж. МЫРЗАБАЕВА. "СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ ПО ИССЛЕДУЕМЫМ ВЕЩЕСТВЕННЫМ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАМ", Региональный вестник Востока, естественные науки и медицина, 3(71), 2016, с.103-120. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108410951B (zh) 一种新的核酸提取试剂及其应用
JP6688883B2 (ja) 生物学的サンプルから生体分子を精製しおよび検査するためのデバイスのコンポーネント、デバイス、および方法
US6746841B1 (en) FTA- coated media for use as a molecular diagnostic tool
Sur et al. Immiscible phase nucleic acid purification eliminates PCR inhibitors with a single pass of paramagnetic particles through a hydrophobic liquid
JP2004509648A (ja) 非病原性又は病原性インフルエンザａサブタイプｈ５ウイルス検出キット
CA2895945A1 (en) Target capture system
CN108026570A (zh) 从血液样品中纯化核酸的组合物和方法
CN105018590A (zh) 蛋白配体和基因同时检测试剂盒及应用
CN109913445B (zh) 一步洗涤磁珠法血液dna提取试剂盒
CN110628762A (zh) 一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用
WO2000062023A1 (en) Fta-coated media for use as a molecular diagnostic tool
KR20150127917A (ko) 자성입자를 이용한 핵산의 추출 및 증폭 방법
CN104388592A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒s基因rt-lamp检测试剂盒及检测方法
RU2628695C1 (ru) Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления
CN102002539B (zh) 一种猪细小病毒检测试剂盒及其应用
CN109207472B (zh) Dna病毒核酸提取试剂盒及其使用方法
CN103695419A (zh) 一种病毒核酸提取试剂
Thatcher Nucleic acid isolation
CN111363748B (zh) 一种核酸适配体及其构建方法和其在检测中华鳖彩虹病毒中的应用
CN111363749B (zh) 一种用于检测中华鳖虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
RU2584346C2 (ru) Способ выделения нуклеиновых кислот
US20220090166A1 (en) Preparation methods and apparatus adapted to filter small nucleic acids from biological samples
CN107988210A (zh) 一种快速提取血液和口腔拭子基因组dna的方法
CN109628640B (zh) 一种快速检测鲤春病毒血症病毒的rpa-lfd引物、方法和试剂盒
CN113337641A (zh) 猪圆环病毒2型lamp检测引物组及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180615