CN107988210A - 一种快速提取血液和口腔拭子基因组dna的方法 - Google Patents

一种快速提取血液和口腔拭子基因组dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速提取血液和口腔拭子基因组DNA的方法。该方法提供了一种可快速处理口腔拭子和血液样本且无需纯化的方法，尤其适用于ARMS‑PCR体系，可快速得到准确的检测结果。本发明省略复杂的核酸提取和纯化过程，操作简单，快速安全，成本低廉，扩增和判定一步完成，无需后期处理。

Description

一种快速提取血液和口腔拭子基因组DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种快速提取血液和口腔拭子基因组DNA的方法。
背景技术
近年来，随着荧光PCR技术的不断成熟。该技术在科研及检验领域得到了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。在进行遗传背景分析过程中，血液、唾液和口腔拭子成为重要的生物分析样本。但是，由于血液、唾液和口腔拭子中存在有很多PCR反应抑制物，例如血液中含有血红素，蛋白质，脂肪，抗凝剂等，唾液和口腔拭子含有蛋白质，脂肪，抗凝剂等，使得用血液、唾液和口腔拭子直接进行荧光PCR反应变得尤为困难。因此，现在临床上往往先要从血液、唾液和口腔拭子样本中纯化出DNA，才能进行样本的DNA扩增。提取血液、唾液和口腔拭子基因组的方法种类非常多，传统酚氯仿抽提法，高盐盐析法，硅胶模离心柱吸附法，磁珠法，等等。经典的血液核酸提取方法包括几个过程。1.通过低渗液涨破红细胞，将血红素物质释放出来，然后离心，清洗去除血红素。2.通过裂解液裂解白细胞，释放核酸物质。3.通过离心柱或纳米磁珠特异性吸附核酸物质，去除其他杂质。4.通过漂洗液洗掉挂在离心柱或纳米磁珠表面的化学试剂残留和蛋白残留。5.加入洗脱液将核酸从离心柱或纳米磁珠上洗脱下来。同样唾液和口腔拭子中核酸提取方法与血液的提取方法相似包括以下4个过程：1.通过裂解液裂解口腔脱落细胞，释放核酸物质。2.通过离心柱或纳米磁珠特异性吸附核酸物质，去除其他杂质。3.通过漂洗液洗掉挂在离心柱或纳米磁珠表面的化学试剂残留和蛋白残留。4.加入洗脱液将核酸从离心柱或纳米磁珠上洗脱下来。传统的提取方法由于核酸提取纯化过程耗时长，成本较高，步骤繁多，增加了基因污染的风险。因此需要一种血液、唾液和口腔拭子样本经过简单处理就可以作为模板进行荧光PCR扩增检测方法，满足科研和医学领域快速检测的要求。
发明内容
本发明提供了一种快速提取血液和口腔拭子基因组DNA的方法。该发明通过快速简单处理口腔拭子和血液样本，且无需纯化可直接用于荧光PCR扩增的DNA。10分钟内即可得到应用于ARMS-PCR反应体系的模板DNA。同时优化ARMS-PCR荧光体系，在反应液中加入防污染UDG酶以及提高Taq酶稳定性的的BSA，从而实现血液和口腔拭子基因组快速荧光PCR扩增检测。该方法快速简单，成本低廉，检测灵敏，且用该方法提取的基因组与商品化试剂盒提取的基因组的检测结果相近。本发明的特征在于：应用本发明的血液基因组DNA提取方法在10分钟内提取血液基因组可用于荧光PCR扩增检测，主要步骤如下。
（1）将采血管颠倒混匀后，吸取100μL血液或者吸取100μL口腔拭子样本保存液至1.5ml离心管，加入200μL的核酸释放剂，涡旋混匀，然后5000g离心30s，弃上清，获得细胞沉淀。
（2）将步骤（1）中得到的血液细胞沉淀中再加入200μL核酸释放剂，涡旋振荡1min，至沉淀完全散开，然后5000g离心30s，弃上清。（口腔拭子样本则无需进行此步骤）。
（3）向步骤（2）所获得的沉淀中加入50μL核酸释放剂，涡旋振荡1～2min；室温放置5min，12000g离心30s，取上清液即为提取的基因组DNA；所述的核酸释放剂组成为20mM～80mM的氢氧化钠溶液、0.1M～0.8M氯化铵、0.005M～0.2M碳酸氢钾、0.005M～0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠、0.1%～2.5%十二烷基硫酸钠、0.1%～3%甲酰胺；所述荧光PCR反应液组成为ROX、TaqMan探针、引物、dNTP、dUTP、UDG、BSA、聚合酶及缓冲液。
附图说明
图1为实例1检测的8份血液样本平行实验的荧光扩增曲线图。
图2～图5为实施例1提供的四份血液样本的三次平行实验的荧光扩增曲线图。
图6为实施例2对比实例1提供的对8份血液样本平行实验的荧光扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种可用于荧光PCR扩增的快速提取全血基因组的方法中的荧光PCR扩增反应液包括浓度或含量和组分如表1。
将所述的荧光PCR扩增反应液对血液样本中的管家基因GAPDH进行荧光PCR扩增，方法如下：将采血管颠倒混匀后，吸取100μL血液至1.5ml离心管，加入200μL的核酸释放剂（20mM～80mM的氢氧化钠溶液、0.1M～0.8M氯化铵、0.005M～0.2M碳酸氢钾、0.005M～0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠、0.1%～2.5%十二烷基硫酸钠、0.1%～3%甲酰胺），涡旋混匀，然后5000g离心30s，弃上清，获得细胞沉淀；然后再加入200μL核酸释放剂，涡旋1min至沉淀完全散开，5000g离心30s，弃上清；向细胞沉淀中加入50μL核酸释放剂，涡旋振荡1min，室温放置5min，12000g离心30s，取上清液即为提取的血液基因组DNA；取上清液3μL，加入到配制好的荧光PCR反应液，于ABI7500荧光PCR仪中进行扩增。所述的荧光PCR扩增程序如下。
第一步骤：50℃，2min，循环1次。
第二步骤：95℃，5min，循环1次。
第三步骤：95℃15s，55℃30s（收集荧光），循环40次。
结果分析：平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。用本发明处理了10份来源不同的人血液样本，然后用人管家基因GAPDH引物进行荧光PCR扩增检测，结果如图1所示，所有反应孔背景信号好、Ct值都在19～25之间，荧光扩增曲线呈典型的S型，说明本发明实例1提供的血液样本快速提取法用于荧光PCR扩增的方法具有较好的可行性。将四份不同来源不同的人血液样本进行荧光PCR扩增检测，每份样本平行三次，结果分别如图2、图3、图4、图5所示，由图可见，每个样本的平行实验，其曲线的Ct值很接近且≤25。说明本发明实例提供的血液样本快速提取法用于荧光PCR扩增的方法有可靠的重复性以及较好的均一性。
实施例2
与市场现有的血液基因组提取试剂盒产品对比。
本发明的具体步骤如下：将采血管颠倒混匀后，吸取100μL血液至1.5ml离心管，加入200μL的核酸释放剂（20mM～80mM的氢氧化钠溶液、0.1M～0.8M氯化铵、0.005M～0.2M碳酸氢钾、0.005M～0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠、0.1%～2.5%十二烷基硫酸钠、0.1%～3%甲酰胺），涡旋混匀，然后5000g离心30s，弃上清，获得细胞沉淀；然后再加入200μL核酸释放剂，涡旋1min至沉淀完全散开，5000g离心30s，弃上清；向细胞沉淀中加入50μL核酸释放剂，涡旋振荡1min，室温放置5min，12000g离心30s，取上清液即为提取的血液基因组DNA；取上清液3μL，加入到配制好的荧光PCR反应液，于ABI7500荧光PCR仪中进行扩增。
选用某公司的血液基因组提取试剂盒作为方法比对，具体操作过程：将取血管颠倒混匀数次，吸取200μL血液于1.5ml离心管中，加入20μL ProteinaseK溶液，混匀。加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，在56℃放置14min（期间颠倒混合样品数次），溶液应变清亮，若未完全变清亮，延长裂解时间至完全变清亮。加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀10s，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱中加入500μL GD（已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱中加入600μL PW（已加入无水乙醇），12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中。12,000rpm（~13，400×g）离心2min。将吸附柱放置新的1.5mL离心管于超净台上开盖晾干5分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液。向吸附柱中悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液，室温放置2～5分钟，12,000rpm（~13，400×g）离心2min，将溶液收集到离心管中，测定浓度及纯度后，取3μL，加入到配制好的荧光PCR反应液，于ABI7500荧光PCR仪中进行扩增。
用本发明和对照产品对8份样本同时进行荧光PCR扩增。结果如图6，本发明所有反应孔背景信号好、Ct值都在21～25之间，荧光扩增曲线呈典型的S型，对比市场上提取试剂盒提取的基因组进行的荧光PCR扩增结果，两者之间在背景信号、Ct值、荧光扩增曲线都是十分相近的。表明本发明的快速提取全血基因组的方法，用于荧光PCR扩增检测是相对稳定的和具有可行性的。

Claims (2)

1.本发明公开了一种快速提取血液和口腔拭子基因组DNA的方法，其特征在于：（1）将采血管颠倒混匀后，吸取100μL血液或者口腔拭子样本保存液至1.5mL离心管，加入200μL的核酸释放剂，涡旋混匀，然后5000g离心30s，弃上清，获得细胞沉淀；（2）将得到的血液细胞沉淀中再加入200μL核酸释放剂，涡旋振荡1min，至沉淀完全散开，然后5000g离心30s，弃上清（口腔拭子样本则无需进行此步骤）；（3）向所获得的沉淀中加入50μL核酸释放剂，涡旋振荡1～2min；室温放置5min，12000g离心30s，取上清液即为提取的基因组DNA。
2.据权利要求1所述的一种快速提取血液和口腔拭子基因组DNA的方法，其特征在于：核酸释放剂组成为20mM～80mM的氢氧化钠溶液、0.1M～0.8M氯化铵、0.005M～0.2M碳酸氢钾、0.005M～0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠、0.1%～2.5%十二烷基硫酸钠、0.1%～3%甲酰胺。
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