CN109182600B - 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒的荧光定量PCR试剂盒。所述试剂盒包含HBV、HCV和HIV‑1的检测引物和探针，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示。本发明提供的试剂盒采用多重荧光PCR方法，能够实现DNA病毒HBV以及RNA病毒HCV和HIV‑1的同时检测，且一种病毒核酸的扩增不会对其他两种产生影响，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、检测时间短、检测成本低、操作技术要求低和不易污染等优点，对于血液中心或血站进行献血者的HBV、HCV和HIV‑1三种病毒的同时检测具有重要的意义和较高的应用价值。

Description

一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒 1型的荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量PCR试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝病毒科(Hepadnaviridea)、正嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnaviru-s)，为乙型肝炎的致病因子。HBV为有包膜的很小的DNA病毒，直径约42nm。HBV基因组DNA为部分双链的环状结构，长约3200bp。在中国流行的B和C基因型均为3215bp。据世界卫生组织报道，世界上有超过20亿人感染过乙肝病毒，其中约有3.5亿人患有慢性乙型肝炎(HBV)，乙型肝炎病毒为一种流行十分广泛的部分双链DNA病毒，是导致急慢性肝炎和肝细胞癌变的致病因子，严重危害了人类公共卫生安全。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌的主要原因，因此检测筛查是否感染HBV、感染后的治疗效果评价以及免疫水平监测具有重要意义。
丙型肝炎(hepatitis C virus，HCV)属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA病毒，由于基因型不同，从各地分离的HCV基因组长度也不一致，一般约为9400bp。HCV是一种隐匿性、传染性、持续性、进展性疾病，主要传播途径包括血液传播、性传播和母婴传播。丙型肝炎病毒感染后少数引起急性肝炎，其症状也较乙型肝炎轻。一般成人感染HCV后，约50％至80％发展成慢性丙型肝炎，其中约20％发展为肝硬化，肝硬化患者每年约有1％至4％发展为肝癌。丙型肝炎是一个重要的公共卫生问题，丙型肝炎病毒感染是引起慢性肝炎的主要原因之一。
获得性人类免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS，艾滋病)是由于感染人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)造成的。HIV感染是严重危害人类健康的全球问题，目前尚无有效的疫苗可以预防HIV的感染。HIV病毒具有高度的基因变异性，根据血清学和基因序列的差异，HIV分为HIV-1型和HIV-2型。HIV-1广泛分布于世界各地，是造成全世界HIV流行的主要病毒。
输入不健康血液或血液制品是感染艾滋病和病毒型肝炎等传染病的重要原因之一。《中国输血技术操作规程》规定，献血者必须进行酶联免疫(ELISA)方法HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的检测。而抗-HCV检测的窗口期为70天，就目前的检测方法不可避免地要出现漏检。利用PCR方法检测病毒核酸，可将窗口期缩短到13天。HBV、HCV和HIV-1及时地发现并且及早地诊断对病毒性肝炎和艾滋感染者的治疗非常重要，能够有效地降低患者的死亡率，并且提高其生存质量。利用RT-PCR方法进行献血者HBV、HCV和HIV-1的检测，可大大缩短窗口期，增加检测的灵敏度，减少漏检，使输血更趋安全。
虽然目前国内外对同步检测HBV、HCV和HIV-1的方法己有报道，但所需仪器设备先进，费用昂贵，需要训练有素的分子生物学技术人员方能完成，不适合用于大规模的献血人员的筛查。因此，亟需开发灵敏、特异、高效的HBV、HCV和HIV的检测方法，以提高检测效率，降低检测成本。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量PCR试剂盒。
本发明提供一种用于同步检测HBV、HCV和HIV-1的试剂盒，所述试剂盒包含分别检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示。
其中，用于检测HBV引物和探针序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1：上游引物TGTCTGCGGCGTTTTATCA
SEQ ID NO.2：下游引物TAGTCCAGAAGAACCAACAAGAA
SEQ ID NO.3：Taqman探针ATGAGGCATAGCAGCAGGAT。
用于检测HCV引物和探针序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.4：上游引物TGGCGTTAGTATGAGTGTCGT
SEQ ID NO.5：下游引物GACCACTATGGCTCTCCCG
SEQ ID NO.6：Taqman探针CAGCCTCCAGGMCCCC。
用于检测HIV-1引物和探针序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
SEQ ID NO.7：上游引物AGACAGCAGTACARATGGCAGT
SEQ ID NO.8：下游引物TGTCTATTATTCTYTCYCCTGC
SEQ ID NO.9：Taqman探针TACCCCCCAATCCCCC。
本发明所述探针上标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述HBV的探针的5’端用FAM荧光基团标记，3’端用MGB淬灭基团标记；
所述HCV的探针的5’端用ROX荧光基团标记，3’端用淬灭基团MGB标记；
所述HIV-1的探针的5’端用CY5荧光基团标记，3’端用MGB淬灭基团标记。
本发明所述试剂盒还包括dNTP、MgCl2、DNA聚合酶、逆转录酶、PCR反应液中的一种或多种。
本领域技术人员应该理解，本发明所述的试剂盒除了包含HBV、HCV和HIV-1的检测引物和探针，可以根据需要选择包含dNTP、MgCl2、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应液等PCR反应所需的物质中的一种或多种。
进一步地，本发明所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的引物和探针中的一种或多种；优选地，所述内参基因为人肌动蛋白β-Actin基因；更优选地，所述内参基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.10：上游引物CGAGCGCGGCTACAGCT
SEQ ID NO.11：下游引物TCCTTAATGTCACGCACGATTT
SEQ ID NO.12：Taqman探针ACCACCACGGCCGAGCGG
优选地，所述阳性对照为含有携带HBV特异性扩增基因片段的质粒的菌体和HCV、HIV-1特异性扩增基因片段的病毒样颗粒。
所述阴性对照包括但不限于PCR反应液、无菌水和生理盐水。
本发明所述的内参基因为人肌动蛋白β-Actin基因，通过检测内参基因扩增的情况，可分析待检样品RNA是否正常扩增，从而排除漏加试剂或样品、样品中含有逆转录或PCR抑制剂以及RNA逆转录等原因造成的PCR扩增异常或失败。
本发明所述的试剂盒中的各种组分可以选择单独包装或者以多种组分混合液的形式包装，如dNTP、MgCl2、PCR反应液可以制备为混合液，共同包装。
作为本发明的优选实施方式，本发明所述的试剂盒包括如下组分：PCR反应液(50mM Tris-HCl，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，2.5mM dNTP)、如SEQ ID NO.1～12所示的HBV、HCV、HIV-1和内参基因的引物和探针混合液(浓度为25μM)、酶系(0.1U/μl Hitaq热启动DNA聚合酶、2.4U/μl super M-MLV反转录酶、0.32U/μl IRNasin RNA酶抑制剂)、阳性对照和阴性对照。
表1试剂盒的组成(24T)
Figure BDA0001803215480000041
在进行检测时，优选地，本发明所述的分别检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针中上游引物、下游引物和探针的工作浓度比例为2:2:1。
具体地，所述HBV、HCV和HIV-1的检测引物和探针中上游引物的工作浓度比例为100～400nM，下游引物的工作浓度比例为100～400nM，探针的工作浓度为100～200nM。
作为本发明的优选实施方式，本发明所述的试剂盒的PCR反应体系如表1所示。
表2试剂盒的PCR反应体系
Figure BDA0001803215480000051
本发明所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)样品采集与处理；
(2)样品核酸的提取；
(3)配制PCR反应体系，并将所述样品核酸、阴性对照和阳性对照分别加入PCR管中；
(4)进行PCR反应，反应结束后分析结果。
作为本发明的优选实施方式，本发明所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)样本采集与处理
血液样品：用EDTA采血管采集血液，充分混匀。
标本保存和运输：样本可立即用于检测；如不立即检测，样本在4℃保存不超过24小时，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，反复冻融不超过5次。
(2)样本核酸的提取
本试剂盒不含提取试剂，血液样本可以使用市售的核酸提取试剂盒，如QIAGEN公司的QIAampMinElute Virus Spin Kit(货号：57704)、天根生化科技有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP315)或TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0(货号：9766)，具体提取步骤请参照相应提取试剂盒说明书。
(3)PCR反应体系的配制
PCR反应体系(20μl)包括：PCR反应液16μl，酶系2μl、引物和探针混合液2μl。
(4)加样
将已处理好的样品核酸、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有反应体系的PCR反应管中。盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区。
(5)PCR扩增
将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。
表3 PCR反应程序
Figure BDA0001803215480000061
(6)结果判读
阴性结果判定：在FAM、ROX和CY5通道扩增曲线均不成S型且Ct值为UNDET；CY3通道扩增曲线呈S型且Ct值≤36，则结果为阴性；
阳性结果判定：样本在FAM、ROX、CY5和CY3通道扩增曲线呈S型且Ct值≤36，则结果为阳性；
实验灰度区：如果样本在FAM、ROX和CY5通道扩增曲线呈S型且36＜Ct＜38，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检；复检结果若扩增曲线呈S型，则判定结果为阳性，若扩增曲线不呈S型，则判定结果为阴性。
此外，本发明提供一种用于同步检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针的混合物，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.9所示。
进一步地，本发明还提供所述引物和探针的混合物在制备HBV、HCV、HIV中的一种或多种的检测试剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供的试剂盒采用多重荧光PCR方法，能够实现DNA病毒HBV以及RNA病毒HCV和HIV-1的同时检测，且一种病毒核酸的扩增不会对其他两种产生影响，具有灵敏度高(可检测模板浓度低至101copies/μl的病毒)、特异性强(采用内参基因监控的检测体系，保证检测结果的可靠性)、重复性好、精密度高(试剂盒对中值和低值精密度标准品重复检测8次，其中，中值cv<1％，低值cv<2％)、检测时间短、检测成本低、操作技术要求低和不易污染等优点，对于血液中心或血站进行献血者同步检测HBV、HCV和HIV-1三种病毒具有重要的意义和很高的应用价值。
附图说明
图1为实施例2中试剂盒检测HBV的灵敏度的结果图。
图2为实施例2中试剂盒检测HCV的灵敏度的结果图。
图3为实施例2中试剂盒检测HIV-1的灵敏度的结果图。
图4为实施例2中试剂盒同步检测HBV、HCV和HIV-1的灵敏度的结果图。
图5为实施例3中试剂盒检测HBV病毒的精密度的结果图。
图6为实施例3中试剂盒检测HCV病毒的精密度的结果图。
图7为实施例3中试剂盒检测HIV-1病毒的精密度的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1试剂盒的制备
根据HBV、HCV和HIV-1病毒的基因组序列，分别设计检测引物和探针的序列(SEQID NO.1～SEQ ID NO.12)，分别合成HBV、HCV和HIV-1的检测引物和探针。
用于检测HBV的引物探针序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.1：上游引物：5’-TGTCTGCGGCGTTTTATCA-3’
SEQ ID NO.2：下游引物：5’-TAGTCCAGAAGAACCAACAAGAA-3’
SEQ ID NO.3：Taqman探针：5’-ATGAGGCATAGCAGCAGGAT-3’，探针5’荧光基团用FAM标记，3’淬灭基团用MGB标记。
用于检测HCV的引物探针序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.4：上游引物：5’-TGGCGTTAGTATGAGTGTCGT-3’
SEQ ID NO.5：下游引物：5’-GACCACTATGGCTCTCCCG-3’
SEQ ID NO.6：Taqman探针：5’-CAGCCTCCAGGMCCCC-3’，探针5’荧光基团用ROX标记，3’淬灭基团用MGB标记。
用于检测HIV-1的引物探针序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示：
SEQ ID NO.7：上游引物：5’-AGACAGCAGTACARATGGCAGT-3’
SEQ ID NO.8：下游引物：5’-TGTCTATTATTCTYTCYCCTGC-3’
SEQ ID NO.9：Taqman探针：5’-TACCCCCCAATCCCCC-3’，探针5’荧光基团用CY5标记，3’淬灭基团用MGB标记。
用于作为试剂盒内标的引物探针序列如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示：
SEQ ID NO.10：上游引物：5’-CGAGCGCGGCTACAGCT-3’
SEQ ID NO.11：下游引物：5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’
SEQ ID NO.12：Taqman探针：5’-ACCACCACGGCCGAGCGG-3’，探针5’荧光基团用CY3标记，3’淬灭基团用MGB标记。
上述部分序列使用了兼并引物，其中M＝A/C，W＝A/T，Y＝C/T。
作为一种实施方式，本发明提供的试剂盒包括如下试剂：PCR反应液1(50mM tris-HCl，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，2.5mMdNTP)、如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的HBV、HCV、HIV-1和内参基因的引物和探针混合物(浓度为25μM、酶系(0.1U/μl Hitaq热启动DNA聚合酶、2.4U/μl superM-MLV反转录酶、0.32U/μl RNasin RNA酶抑制剂)、阳性对照、阴性对照和说明书(试剂盒的组分如表1所示)。
实施例2试剂盒的检测灵敏度分析
按如下方法在试剂配制室中配制PCR的反应体系，PCR反应液：16μl×n，酶系：2μl×n、引物探针混合液：2μl×n。将PCR反应液按20μl/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区。用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有反应体系的PCR反应管中。盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区。将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测，PCR扩增的反应程序如表3所示。
PCR扩增的结果分析标准如下：
阴性结果判定：在FAM、ROX和CY5通道扩增曲线均不成S型且Ct值为UNDET；CY3通道扩增曲线呈S型且Ct值≤36，则结果为阴性；
阳性结果判定：样本在FAM、ROX、CY5和CY3通道扩增曲线呈S型且Ct值≤36，则结果为阳性；
实验灰度区：如果样本在FAM、ROX和CY5通道扩增曲线呈S型且36＜Ct＜38，则结果位于实验灰度区，应对样本进行复检；复检结果若扩增曲线呈S型，则判定结果为阳性，若扩增曲线不呈S型，则判定结果为阴性。
1、HBV检测的灵敏度
以HBV阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒灵敏度，将阳性对照克隆质粒10倍梯度稀释，检测范围为107-101copies/μl，具体步骤按检测方法操作。结果表明，107-101copies/μl都可以检测，在此范围内HBV可以检测，即本发明试剂盒可以检测10个拷贝的HBV含量的样本。检测结果见图1。
2、HCV检测的灵敏度
以HCV阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒灵敏度，将阳性对照病毒样颗粒10倍梯度稀释，检测范围为107-101copies/μl，具体步骤按检测方法操作。结果表明，107-101copies/μl都可以检测，在此范围内HCV可以检测，即本发明试剂盒可以检测10个拷贝的HCV含量的样本。检测结果见图2。
3、HIV-1检测的灵敏度
以HIV-1阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒灵敏度，将阳性对照和病毒样颗粒10倍梯度稀释，检测范围为107-101copies/μl，具体步骤按检测方法操作。结果表明，107-101copies/μl都可以检测，在此范围内HIV-1可以检测，即本发明试剂盒可以检测10个拷贝的HIV-1含量的样本。检测结果见图3。
4、HBV、HCV和HIV-1同步检测的灵敏度
以HBV、HCV和HIV-1阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒灵敏度，将阳性对照克隆质粒和病毒样颗粒10倍梯度稀释，检测范围为107-101copies/μl，具体步骤按检测方法操作。结果表明，107-101copies/μl都可以检测，在此范围内HBV、HCV和HIV-1可以检测，即本发明试剂盒可以同步检测10个拷贝的HBV、HCV和HIV-1含量的样本。检测结果见图4。
实施例3试剂盒的检测精密度分析
采用实施例2所述的方法，利用实施例1提供的同步检测HBV、HCV和HIV-1的荧光定量PCR试剂盒，对HBV阳性对照克隆质粒(1×106copies/μl、1×104copies/μl)作为HBV待检样本，对HCV阳性对照病毒样颗粒(1×104copies/μl、1×102copies/μl)作为HCV待检样本，对HIV-1阳性对照病毒样颗(1×104copies/μl、1×101copies/μl)作为HIV-1待检样本。用质检合格的同步检测HBV、HCV和HIV-1的荧光定量PCR试剂盒进行检测，每种8次重复检测。在ABI7500仪器进行检测。结果表明，不同核酸浓度的检测Ct值变异系数均<1％，具有较好的精密度。HBV精密度检测见图5，HCV精密度检测见图6，HIV-1精密度检测见图7。
本领域技术人员可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。
序列表
<110> 中国科学院合肥物质科学研究院
合肥中科易康达生物医学有限公司
<120> 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量PCR试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtctgcggc gttttatca 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtccagaa gaaccaacaa gaa 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaggcata gcagcaggat 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggcgttagt atgagtgtcg t 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccactatg gctctcccg 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagcctccag gmcccc 16
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agacagcagt acaratggca gt 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtctattat tctytcycct gc 22
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taccccccaa tccccc 16
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgagcgcggc tacagct 17
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccttaatgt cacgcacgat tt 22
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
accaccacgg ccgagcgg 18

Claims (10)

1.一种用于同步检测HBV、HCV和HIV-1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含分别检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.9所示，其中，检测HBV的引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；检测HCV的引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；检测HIV-1的引物序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
所述HBV的探针的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基团MGB标记；
所述HCV的探针的5’端用荧光基团ROX标记，3’端用淬灭基团MGB标记；
所述HIV-1的探针的5’端用荧光基团CY5标记，3’端用淬灭基团MGB标记。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、MgCl2、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因的引物和探针、阳性对照、阴性对照中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为人肌动蛋白β-Actin基因。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因的引物和探针的序列如SEQ ID NO.10~SEQ ID NO.12所示。
6.根据权利要求1~5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述分别检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针中上游引物、下游引物和探针的工作浓度比例为2:2:1。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述分别检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针中上游引物的工作浓度为100~400 nM，下游引物的工作浓度为100~400 nM，探针的工作浓度为100~200 nM。
8.根据权利要求1~5、7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：
（1）样品采集与处理；
（2）样品核酸的提取；
（3）配制PCR反应体系，并将样品核酸、阴性对照和阳性对照分别加入PCR管中；
（4）进行PCR反应，反应结束后分析结果。
9.一种用于同步检测HBV、HCV和HIV-1的引物和探针的混合物，其特征在于，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.9所示，其中，检测HBV的引物序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；检测HCV的引物序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；检测HIV-1的引物序列如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
所述HBV的探针的5’端用荧光基团FAM标记，3’端用淬灭基团MGB标记；
所述HCV的探针的5’端用荧光基团ROX标记，3’端用淬灭基团MGB标记；
所述HIV-1的探针的5’端用荧光基团CY5标记，3’端用淬灭基团MGB标记 。
10.权利要求9所述的引物和探针的混合物在制备HBV、HCV、HIV-1中的一种或多种的检测试剂中的应用。
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CN112746132B (zh) * 2021-01-25 2022-09-20 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 用于检测希望山病毒、穆勒舒病毒和里约塞贡多病毒的引物探针组合、试剂盒及方法
CN113234853B (zh) * 2021-04-14 2022-05-13 北京良芯生物科技发展有限公司 同时检测hiv-1、hbv、hcv、cmv的特异性引物和试剂盒
CN116162733A (zh) * 2021-11-25 2023-05-26 京东方科技集团股份有限公司 引物探针组及其应用、试剂盒及其检测方法和应用

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CN101624629B (zh) * 2009-07-24 2012-09-05 上海浩源生物科技有限公司 单管中多重靶核酸的pcr检测方法及其试剂盒
CN105695631B (zh) * 2016-03-18 2019-04-23 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒快速联检试剂盒及其制备和应用

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