CN115873993B

CN115873993B - 一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115873993B
Application number: CN202211574225.9A
Authority: CN
Inventors: 方钟燎; 张伟尉; 蒋智华
Original assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Guangxi Zhuang Autonomous Region Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-12-08
Also published as: CN114250325A; CN115873993A

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒及其应用，本发明的试剂盒包括：引物、探针、核酸释放试剂、PCR缓冲液、对照品、标准品和内标等物质。利用本试剂盒可以对乙型肝炎病毒9个基因型(A～I)进行荧光定量检测，使用本试剂盒不需要提取血清中乙型肝炎病毒核酸，整个反应在同一PCR管中完成，减少换管过程中待检标本受污染的机会，本发明还解决了部分高浓度表面活性剂对PCR扩增产生抑制的技术问题。本试剂盒的最低检出限为30IU/ml，具有灵敏、特异、准确、快速、操作简便等优势，可以大大提高对乙型肝炎病毒的检出效率。

Description

一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒及其应用

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒及其应用。

【背景技术】

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝病毒科，全世界三分之一人口(约20亿人)曾经感染过HBV，目前仍有约2.57亿慢性HBV携带者，我国至少还有9千万慢性HBV携带者。慢性HBV感染可导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌等各种肝脏疾病，每年约88万人死于与HBV感染有关的肝脏疾病。虽然大规模推广新生儿乙肝疫苗免疫接种效果显著，但仍然有约5％的免疫失败，而且，在乙肝疫苗长期免疫效果观察中已发现疫苗免疫成功、抗体滴度下降后慢性感染HBV现象。可见，慢性HBV感染仍然是全球性的公共卫生问题。

虽然HBsAg是HBV感染的重要血清标记物，但不能直接反映感染者体内病毒复制情况，不能说明感染者传染性大小，而血清HBV DNA浓度(病毒载量)具有这方面作用。病毒载量是影响母婴传播最重要的危险因素，对病毒载量≥10⁶拷贝/ml、HBsAg和HBeAg双阳性孕妇发生母婴传播风险最高，因此，产前检测HBV病毒载量才能评估这类孕妇是否需要产前抗病毒治疗，降低病毒载量、减少母婴传播风险。过去认为，HBV感染者HBeAg阴转即表示病毒不复制、无传染性，但最近研究发现，HBV基因突变(nt1896 G→A,nt 1762A→T和1764G→A)可导致HBeAg阴性，这类感染者病毒仍在复制，仍具有传染性。病毒载量大于≥10⁴拷贝/ml的慢性HBsAg无症状携带者肝癌风险增高，抗病毒治疗以降低病毒载量可降低肝癌风险，因此，这类感染者需要进行HBV病毒载量监测。很多抗肿瘤药物均可抑制人体免疫，因此，HBsAg阳性的肿瘤患者用抗肿瘤药物前，都要进行HBV病毒载量检测以评估是否需要先行抗HBV治疗，否则，抗肿瘤药物可能激发HBV大量复制、繁殖，威胁生命。可见，检测HBV病毒载量意义重大，应用广泛。

根据全基因组核苷酸序列差异≥8％原则，目前已发现HBV有9个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H、I基因型)，根据型内S基因核苷酸序列差异≥4％，每个基因型还可细分多个亚型，目前已发现55个基因亚型。

HBV病毒载量检测基本步骤是核酸提取后扩增。提取核酸的目的是去除可能影响DNA聚合酶活性和降低扩增效率的抑制物，然而，各种核酸提取方法复杂，繁琐，耗费人力、耗时、费用高、很容易导致待检标本污染。

目前已有多种国产乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR试剂盒用于临床检验、卫生检验和科研检测，但只能检测出HBV 8个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H基因型)，因此，有必要研制能同时检测出包括最近发现的第九种基因型I的试剂盒。另外，申请人在研究过程中，应用目前我国自主研发、最好的DNA聚合酶之一5G Polymerase进行血清HBV DNA直接扩增实验，发现使用该聚合酶及其配套的缓冲溶液进行血清直接扩增，效果差，结果不可靠，需要先提取病毒DNA再扩增，结果才准确，这使得该酶适用面窄，存在DNA检测技术操作复杂、有可能出现样本受到污染等缺陷，为提高该酶对HBV DNA检测的广度、提高检测灵敏度、简化实验步骤，减少对标本的污染，有必要对该酶缓冲液进行改进。

一般来说，要检测核酸，就要先释放核酸，要对细胞、组织材料等生物样本材料进行破碎处理，失活核酸酶，才能释放核酸，表面活性剂如SDS等试剂是核酸释放的经典试剂。但是，SDS对DNA聚合酶活性有一定的抑制作用，影响扩增效果，因此，在PCR反应中SDS的残留量不能过高，例如现有技术《8种快速制备细菌基因组DNA方法的效果评价》王群著一文中指出，SDS浓度过高会对PCR反应有抑制作用，查阅文献发现，现有技术报道SDS的浓度不能高于0.01％。因此，通常需要在裂解完成后提取DNA，去掉SDS再进行PCR扩增，但是此方法繁杂、繁琐，耗费人力、耗时、费用高、且容易导致待检标本污染。为此，有必要探索一种使用SDS等试剂进行核酸释放之后，又不需要进行DNA提取的简便、快捷的HBV DNA检测试剂盒。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要探索一种使用高浓度SDS进行核酸释放之后，不需要提取DNA就能直接进行扩增的HBV DNA检测试剂盒，且该试剂盒可实现对HBV9个基因型的检测(A-I)。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒，所述试剂盒包括引物对、探针、核酸释放剂和PCR缓冲液；

所述引物对的上游引物HBVWW1的序列如SEQ ID NO.1所示；下游引物HBVWW2的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述探针HBVWWPR的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述核酸释放剂由0.25mM地衣素、60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mMEDTA和体积百分比为2.3％的TritonX-100组成；

所述PCR缓冲液由5mM MgCl₂、40mM的KCl、10mM pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液、0.20M的海藻糖、体积百分比为6％的DMSO、50U/ml的DNA聚合酶和2U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶组成；

所述试剂盒还包括内标为巨细胞病毒DNA及其扩增引物对和内标探针；所述扩增引物对的上游引物CVWW1的序列如SEQ ID NO.4所示；下游引物CVWW2的序列如SEQ IDNO.5所示；所述内标探针CVWWPR的序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述乙型肝炎病毒9个基因型为A、B、C、D、E、F、G、H和/或I基因型的一种或多种。

进一步的，所述核酸释放剂还包括35mM的丰原素。

进一步的，所述DNA聚合酶为5G Polymerase。

本发明还包括一种应用所述试剂盒对乙型肝炎病毒9个基因型进行非诊断目的的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)在同一PCR反应管中加入核酸释放剂和待检血清样本，反复吹打混匀，置于普通PCR仪中进行核酸裂解、终止核酸裂解并迅速降至4℃；

(2)向步骤(1)降温后的溶液中加入PCR缓冲液、上游引物HBVWW1、下游引物HBVWW2、探针HBVWWPR和所述的内标引物对上游引物CVWW1、下游引物CVWW2、内标探针CVWWPR进行荧光定量PCR反应。

本发明具有如下有益效果：

1、本申请的试剂盒包括：引物、探针、核酸释放试剂、PCR缓冲液、对照品、标准品和内标等物质，利用本申请的试剂盒对HBV DNA进行检测，无需提取血清HBV DNA，直接用血清在同一试管内完成实验，避免了DNA提取过程可能会产生的污染，最低检出限为30IU/ml。

2、本申请的引物按简并引物方法及原则进行设计，确保了能对HBV 9个不同基因型：A、B、C、D、E、F、G、H、I进行荧光定量检测；同时，本申请的核酸释放剂经过改良后，加入了地衣素和/或丰原素，不仅能有效裂解病毒、释放核酸，而且能抵消较高浓度的SDS等表面活性剂对DNA聚合酶的抑制作用，使得在有较高浓度SDS残留的情况下，也能取得良好的扩增效果，与5G Polymerase酶公司的扩增程序相比，扩增效率显著提高，具有：灵敏度高、特异性强、扩增效率好、准确、操作简便、快速等优势，是一种可广泛应用于医疗、卫生单位的乙型肝炎病毒检测试剂盒。

【附图说明】

图1为采用本发明所述试剂盒检测浓度为10⁴～10⁷标准品的荧光定量PCR扩增曲线图；从左到右浓度依次为：4.00E+07IU/ml、4.00E+06IU/ml、4.00E+05IU/ml、4.00E+04IU/ml的血清样本；

图2为HBV DNA国家阴性参考品荧光定量PCR扩增结果图；

图3为HBV DNA国家阳性参考品荧光定量PCR扩增曲线图；

图4为HBV DNA灵敏度/定量国家参考品最低检出限曲线图；

图5为HBV DNA精密性国家参考品扩增曲线图；

图6为试剂盒对HBV 9个基因型的扩增效果图，图中，九条扩增曲线分别代表A、B、C、D、E、F、G、H、I基因型；

图7-图9为不同核酸释放剂的试剂盒与5G Polymerase酶公司检测试剂盒之间的扩增效果对比图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

本实施例为采用本发明的试剂盒检测HBV DNA国家标准品效果

具体实施过程如下：

配制试剂盒：本实施例的试剂盒包括如下成份：

①检测HBV DNA引物对和探针，其中，引物对的上游引物序列HBVWW1为：5’-TDTCTGCGGCGTTTTATCAT-3’(其中D表示A或G或T)(参见SEQ ID NO.1)；下游引物序列HBVWW2为：5’-ACASACGGGCAACATACCTTG-3’(其中S表示C或G)(参见SEQ ID NO.2)；探针HBVWWPR序列为：5’-CTCTTCATCCTGCTGCTATGCC TCATCT-3’(参见SEQ ID NO.3)，探针标记5’FAM 3’TAMRA荧光基团。

②内标引物和探针：其中，内标引物对的上游引物序列CVWW1为：5’-ACCCGGCAAGATTTCTAACGG-3’(参见SEQ ID NO.4)；下游引物序列CVWW2为：5’-CATTCTGTGGGTCTGCGACTC-3’(参见SEQ ID NO.5)；所述内标探针CVWWPR序列为：5’-TAGTCATCGACGGTGCACATCGGCC-3’(参见SEQ ID NO.6)，探针标记5’VIC3’TAMRA荧光基团。

③核酸释放剂：由0.25mM地衣素、60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mMEDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成；

④PCR缓冲液：由5mM MgCl₂、40mM KCl、10mM pH值为7.8的Tris-HCl缓冲液、0.20M海藻糖、体积百分比为6％的DMSO、50U/ml的DNA聚合酶和2U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)组成，其中，DNA聚合酶为：5G Polymerase。

具体的实验步骤如下：

(1)用HBV DNA阴性血清将HBV DNA标准品稀释成浓度为4.00E+07IU/ml、4.00E+06IU/ml、4.00E+05IU/4.00E+04IU/ml四个浓度梯度。

(2)在干净的200μl PCR反应管，加入核酸释放剂8μl和7μl步骤(1)不同浓度的血清标准品，用移液器吹打混匀，盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：

第一步：60℃，10分钟；第二步：97℃，10分钟；第三步：4℃冷却后将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，瞬时离心，小心打开管盖，每管加入35μl PCR缓冲液，缓冲液含检测HBV DNA扩增引物对和探针(其中，每条引物浓度为0.4μM，探针浓度为0.2μM)、内标扩增引物对和探针(其中，每条引物浓度为0.12μM，探针浓度为0.2μM)，用移液器吹打混匀；瞬时离心，置于荧光定量PCR仪，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现HBV DNA定量检测，扩增循环条件设置为：

第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；

第二步：DNA聚合酶活化，预变性95℃10分钟，1个循环；

第三步：变性：95℃10秒，退火、延伸及荧光采集：60℃20秒，45个循环。

得到的结果如图1所示，图1为不同浓度下HBV血清标准品的荧光定量PCR扩增曲线图，曲线中：从左到右的曲线分别对应浓度为4.00E+07IU/ml、4.00E+06IU/ml、4.00E+05IU/ml、4.00E+04IU/ml的血清样本；根据曲线可知，标准曲线相关系数R²＝0.991、扩增效率100.041，符合行业标准R²＝0.98，扩增效率在90％-110％之间。由此可见，采用实施例1的扩增方法，扩增效率良好。

实施例2：

本发明试剂盒的敏感性和特异性

实验采用的参考品如下：血清HBV DNA阴性8份及阳性9份国家参考品、1份灵敏度/定量国家参考品(HBV DNA含量为1×10³IU/mL)和1份精密性国家参考品(HBV DNA含量为6.9×10⁶IU/mL)均购自中国食品药品生物制品检定研究院。核酸释放剂和PCR缓冲液与实施例1相同。

(一)检测阴、阳性参考品符合率：

以HBV国家标准品中的8份阴性、9份阳性参考品作为待检样本，采用上述实施例1步骤进行检测(目的基因和内标的扩增引物和探针及其浓度与实施例1引物和探针及其浓度相同)，检测结果表明，8个阴性样本都没有检出信号，内标全都有信号，并且内标的重复性非常好，能够真正的起到监测假阴性的目的(具体见图2)；9个阳性样本均有明显的S型扩增曲线，均有Ct值，均可判为阳性(具体见图3)。阴、阳性符合率均为100％，可见，本发明试剂盒敏感性高、特异性强。

(二)最低检出限：

用HBV DNA阴性血清将1份灵敏度/定量国家参考品(HBV DNA含量为1×10³IU/mL)稀释至50IU/mL和30IU/mL作为待检样本，采用上述实施例1步骤进行检测(目的基因和内标扩增引物和探针及其浓度与实施例1引物和探针及其浓度相同)，每个浓度梯度完成8个重复检测。检测结果见图4，可以看出最低检出限30IU/mL 8次提取扩增均有明显的S型扩增曲线，Ct值在34～37左右，均可判定为阳性。可见，本试剂盒最低检出限为≤30IU/mL。

(三)精密性：

取精密性国家参考品(HBV DNA含量为6.9×10⁶IU/mL)，采用上述实施例1步骤进行检测，完成10个重复检测，结果取对数后求变异系数(CV)值。检测结果见图5，结果显示：本试剂盒的精密度较为理想，精密度变异系数为1.9％，符合行业标准≤5％的要求。

实施例3：

本实施例为本发明试剂盒对9个不同HBV基因型的检测结果：

用本发明所述试剂盒检测HBV 9个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H、I)标准品。检测步骤：取核酸释放剂8μl加入7μl的血清样本(标准品)，用移液器吹打混匀，盖好管盖置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：

第一步：60℃，10分钟；第二步：97℃，10分钟；第三步：4℃冷却后将经过裂解处理的PCR反应管从普通PCR仪中取出，瞬时离心，小心打开管盖，每管加入35μl PCR缓冲液，缓冲液含与实施例1相同的扩增引物和探针及其浓度，用移液器吹打混匀；瞬时离心，置于荧光定量PCR仪，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现HBV DNA定量检测，扩增循环条件设置为：

第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；

第二步：DNA聚合酶活化，预变性95℃10分钟，1个循环；

实验结果参见图6，图中的6个基因型(A～I)均被扩增出来，说明本申请的试剂盒能对HBV的9个基因型(A～I)实现荧光定量检测分析。

Ct值详见表1。结果可见，HBV 9个基因型(A～I)均有明显的S型扩增曲线及相应Ct值，均可判为阳性标本，说明本试剂盒敏感性高，可检测HBV 9个基因型。

表1本发明试剂盒检测九个基因型的检测结果

样本名称	检测结果Ct值
		HBVA基因型标准品	29.576
HBVB基因型标准品	29.774
		HBVC基因型标准品	29.753
HBVD基因型标准品	29.622
		HBVE基因型标准品	30.129
HBVF基因型标准品	29.856
		HBVG基因型标准品	30.203
HBVH基因型标准品	30.163
		HBVI基因型标准品	30.896
HBVDNA阴性血清	Undetermined
		HBVDNA阳性血清	26.043

实施例4：

本实施例研究不同核酸释放剂对血清HBVDNA的扩增效果。

细胞裂解对于核酸提取是非常重要的，经典的裂解液都包含表面活性剂(如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)，但有些表面活性剂如SDS，当它浓度超过一定阈值，就会对DNA聚合酶有明显的抑制作用，降低PCR扩增效率，因此，如果裂解时使用了高浓度的SDS，就需要在裂解反应之后提取DNA再进行扩增，而采用一步法扩增时，为了防止SDS对聚合酶的抑制作用，通常会降低SDS的浓度，这就有可能会存在DNA不能很好释放，从而导致扩增效率低，甚至扩增失败。发明人在应用一步法扩增血清HBV DNA时发现，核酸释放剂的筛选对于扩增效果尤为重要，有些表面活性剂如地衣素、丰原素等除了能破坏细胞膜提高裂解功能外，还可能具有消除SDS对DNA聚合酶的抑制作用，具体可参见如下实验：

(一)含地衣素的核酸释放剂对血清HBV DNA扩增效率的影响：

实验组1：

核酸释放剂：由0.25mM地衣素、60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。

实验组2：

核酸释放剂：由60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。(不含地衣素)。

实验组1和实验组2的PCR缓冲液与实施例1一致，均由5mM MgCl₂、40mM的KCl、10mMpH值为7.8的Tris-HCl缓冲液、0.20M的海藻糖、体积百分比为6％的DMSO、50U/ml的DNA聚合酶和2U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶组成。

对照组：

采用5G Polymerase酶公司的扩增缓冲液；

具体实验步骤：

(1)三个组引物对、探针、内标引物、探针、PCR缓冲液组分和浓度均与实施例1一致；

(2)扩增血清：三个组均采用同一份HBV DNA国家阳性参考品血清；

实验组1和实验组2的扩增前准备：

在2个干净的200μl PCR反应管中加入国家阳性参考品血清7μl，然后分别加入8μl实验组1或实验组2核酸释放剂、置于普通PCR仪中反应，具体参数如下：第一步：60℃，10分钟；第二步：97℃，10分钟；第三步：4℃冷却后完成裂解，之后再加入17.45μl PCR缓冲液、5G Polymerase 0.675μl、上游引物HBVWW1和下游引物HBVWW2各1.25μl，探针HBVWWPR 0.5μl，H₂O 13.875μl，用移液器吹打混匀，瞬时离心，备用。

对照组扩增前准备：

参考5G Polymerase酶说明书进行反应，其步骤如下：在1个干净的200μlPCR反应管，加入2x 5G qPCR Buffer GB 25μl，/>5G Polymerase 0.625μl，上游引物HBVWW1和下游引物HBVWW2各1.25μl，探针HBVWWPR 0.5μl，H₂O 14.375μl，国家阳性参考品血清7μl。用移液器吹打混匀，瞬时离心，备用。

实验组和对照组扩增程序：

将以上3组PCR反应管置于荧光定量PCR仪，应用实时荧光定量PCR检测方法，通过荧光信号的变化实现HBV DNA定量检测，扩增循环条件设置：

第一步：UNG酶反应，50℃2分钟，1个循环；

第二步：DNA聚合酶活化，预变性95℃10分钟，1个循环；

得到的结果如图7所示，从图7可见，从Ct值上来看，实验组1(Ct值＝25.051)＜对照组(Ct值＝28.746)＜实验组2(Ct值＝32.335)，说明对照组的扩增效果优于实验组2，主要原因是实验组2反应液中SDS浓度过高，抑制了DNA聚合酶，导致扩增效率差，当反应液中加入了地衣素(实验组1)之后，扩增效率得到显著提高，说明地衣素有可抵消SDS对DNA聚合酶的抑制作用，从CT值可推算，用酶公司缓冲液直接检测血清HBV DNA，所得病毒载量比含地衣素的本发明缓冲液检测所得的病毒载量少11.1倍(每3.32个CT值相差10倍)，可见，加入地衣素的核酸释放剂，能显著提高对血清HBV DNA的扩增效率。

(二)含丰原素的核酸释放剂对血清HBV DNA扩增效率的影响：

除了地衣素外，经过对多个表面活性剂的筛选，申请人还发现丰原素也有类似效果，具体如下：

实验组A：

核酸释放剂：由35mM丰原素、60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。

实验组B：

核酸释放剂：由60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。(不含丰原素)。

实验组A和实验组B的PCR缓冲液与实施例1一致，均由5mM MgCl₂、40mM的KCl、10mMpH值为7.8的Tris-HCl缓冲液、0.20M的海藻糖、体积百分比为6％的DMSO、50U/ml的DNA聚合酶和2U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶组成。

对照组：

采用5G Polymerase酶公司的扩增缓冲液；

扩增方法和步骤和(一)实验一致，得到的结果参见图8，从图8可见，从Ct值上来看，实验组A(Ct值＝25.947)＜对照组(Ct值＝29.390)＜实验组B(Ct值＝31.822)；说明对照组的扩增效果优于实验组B，主要原因是实验组B反应液中SDS浓度过高，抑制了DNA聚合酶，导致扩增效率差，当反应液中加入了丰原素(实验组A)之后，扩增效果得到显著提升，说明丰原素可抵消SDS对DNA聚合酶的抑制作用，从CT值可推算，用酶公司缓冲液直接检测血清HBV DNA，所得病毒载量比含丰原素的本发明缓冲液检测所得的病毒载量少10.4倍，可见，加入丰原素的核酸释放剂，能显著提高对血清HBV DNA的扩增效率。

(三)地衣素和丰原素联合应用对血清HBV DNA扩增效率的影响：

实验组a：

核酸释放剂：由0.25mM地衣素、35mM丰原素、60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。

实验组b：

实验组c：

由35mM丰原素、60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。

实验组d：

由60mM KCl、体积百分比为0.65％的SDS，5mM EDTA、体积百分比为2.3％的TritonX-100组成。(不含地衣素和丰原素)。

实验组a-实验组d的PCR缓冲液与实施例1一致，均由5mM MgCl₂、40mM的KCl、10mMpH值为7.8的Tris-HCl缓冲液、0.20M的海藻糖、体积百分比为6％的DMSO、50U/ml的DNA聚合酶和2U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶组成。

对照组：

采用5G Polymerase酶公司的扩增缓冲液；

扩增方法和步骤和(一)实验一致，得到的结果参见图9，从图9可见，从Ct值上来，看实验组a(Ct值＝21.471)＜实验组b(Ct值＝24.477)＜实验组c(Ct值＝25.092)＜对照组(Ct值＝28.898)＜实验组d(Ct值＝31.877)；说明对照组的扩增效果优于实验组d，主要原因是实验组D反应液中SDS浓度过高，抑制了DNA聚合酶，导致扩增效率差，当加入地衣素(实验组b)或丰原素(实验组c)后，它们的Ct值均小对照组，进一步说明不管是地衣素还是丰原素，都能提高血清HBV DNA的扩增效率，反应液中同时加入丰原素和地衣素(实验组a)后，其Ct值最低，扩增效果最好，说明地衣素和丰原素具有协同作用，由CT值可推算，对照组所得病毒载量比实验组a所得的病毒载量少22.4倍，可见，同时加入地衣素和丰原素之后，更能提高血清HBV DNA扩增效率。

综上所述，本申请的试剂盒能检测乙型肝炎病毒(HBV)9个基因型(A～I)，同时，还利用地衣素和/或丰原素抵消核酸释放剂中高浓度的SDS对DNA聚合酶的抑制作用，效果突出，不需要裂解之后提取DNA，在较高的SDS浓度下仍能达到良好的扩增效果，是一种能实现对HBV简单、高效的扩增的乙肝病毒核酸检测试剂盒。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种检测乙型肝炎病毒9个基因型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对、探针、核酸释放剂和PCR缓冲液；

所述探针HBVWWPR的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述核酸释放剂由0.25mM地衣素和/或35mM的丰原素、60mM KCl、体积百分比为0.65%的SDS，5 mM EDTA和体积百分比为2.3%的TritonX-100组成；

所述PCR缓冲液由5mM MgCl₂、40 mM的KCl、10 mM pH 值为7.8的Tris-HCl缓冲液、0.20M的海藻糖、体积百分比为6% 的DMSO、50 U/ml的DNA 聚合酶和2U/ml的尿嘧啶-N-糖基化酶组成；

所述试剂盒还包括内标为巨细胞病毒DNA及其扩增引物对和内标探针；所述扩增引物对的上游引物CVWW1的序列如SEQ ID NO.4所示；下游引物CVWW2的序列如SEQ ID NO.5所示；所述内标探针CVWWPR的序列如SEQ ID NO.6所示；

所述乙型肝炎病毒9个基因型为A、B、C、D、E、F、G、H和/或I基因型的一种或多种；

所述DNA聚合酶为TOROIVD® 5G Polymerase。

2.应用如权利要求1所述试剂盒对乙型肝炎病毒9个基因型进行非疾病诊断目的的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）在同一PCR反应管中加入核酸释放剂和待检血清样本，反复吹打混匀，置于普通PCR仪中进行核酸裂解、终止核酸裂解并迅速降至4℃；

（2）向步骤（1）降温后的溶液中加入权利要求1所述的核酸释放剂、PCR缓冲液、上游引物HBVWW1、下游引物HBVWW2、探针HBVWWPR和所述上游引物CVWW1、下游引物CVWW2、内标探针CVWWPR进行荧光定量PCR反应。