CN116121413A - B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents

B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括GBS核酸提取液、GBS扩增检测液和SAT酶液，通过优化设计更适合于B群链球菌实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针，并在检测过程中分步添加各组分进行分步反应可以实现对B群链球菌的快速、准确检测，并且灵敏度高，扩增产物RNA易降解，不会引起样本交叉污染和环境污染。

Description

B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，特别涉及特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Test，SAT)结合的B群链球菌(GroupB Streptococcus，GBS)cfb基因RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)在兰氏抗原分类中属于B群，B群目前只发现这一种细菌，所以一般也称为B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)。GBS为一种β溶血的革兰阳性球菌，成对或呈短链状排列，根据细菌的荚膜多糖不同，GBS可分为Ia、Ib、Ic、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX等。GBS是围产期和新生儿感染疾病的致病菌，引起孕产妇的绒毛膜羊膜炎，导致流产、胎膜早破及宫内感染，也可导致新生儿发生肺炎、脑膜炎、败血症等，因此中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南建议》(2018版)中明确将GBS筛查作为高危孕妇的备查项目，且最佳检测时间在35～37周。
目前，对GBS进行检测的方法主要包括：传统的细菌培养方法和实时荧光PCR检测方法。其中传统的细菌培养方法作为病原微生物检测的金标准，具有特异性高的显著优势，但却具有耗时长、费用大、培养难度高、通量低、灵敏度低等一系列缺点，很难满足临床实际需求；实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、耗时短、通量相对较高的优势，在GBS的筛查中发挥重要的作用。例如专利文献CN113249508A(以下称文献1)公开一种用于检测B族链球菌的特异性引物和探针，其以B族链球菌ScpB基因为靶基因设计得到，对B族链球菌模拟临床样本能检测出的最低拷贝数为10copies/μL。然而该文献1公开的基于PCR原理的检测方法在反应过程中需要温度的升降和循环，因此所需检测时间较长，效率较低，同时需要使用专用的荧光PCR仪，增加了检测成本；另外，PCR的反应产物为DNA，不易降解，容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
为了克服PCR方法中检测GBS耗时较长、需要专用PCR仪器等问题，张晓彤等人(等温扩增法用于孕妇B族链球菌感染筛查的研究，中国病原生物学杂质，2018年2月，第13卷第2期，P112-115；以下称文献2)建立一种可用于快速筛查孕妇B族链球菌(GBS)的等温扩增法，其根据GBS的cfb基因设计LAMP(环介导等温扩增)和RPA(重组酶聚合酶扩增)反应引物，能够在恒温条件下快速(LAMP方法在63℃下恒温45min；PRA方法在40℃下恒温15min)完成目的基因的扩增反应过程，且均不依赖于特定仪器，因此检测效率较高，且可节约检测成本。然而，上述文献2公开的两种方法(LAMP和PRA)对GBS的最低检出浓度仅能达到0.01ngDNA/μl，且反应产物仍为DNA，其不易降解，仍容易导致样本交叉污染和实验环境的污染。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：
(1)GBS核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；
(2)GBS扩增检测液：其包含第二引物、靶标检测探针和所述第一引物，其中所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
(3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中：
所述捕获探针包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其组成；
所述第一引物包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或由其组成；
所述第二引物包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成；
所述靶标检测探针包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或由其组成，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、MGB、DABCYL。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括：
(4)阳性对照：含有B群链球菌核酸的体系；和/或
(5)阴性对照：不含有B群链球菌核酸的体系。
在一些实施方式中，所述GBS核酸提取液的组分包括：1-50μΜ所述的捕获探针、和25-150pmol/mL所述的第一引物。
在一些实施方式中，所述GBS扩增检测液的组分包括：250-750pmol/mL所述的第二引物、143-857pmol/mL所述的第一引物、和143-857pmol/mL所述的靶标检测探针。
在一些实施方式中，所述SAT酶液的组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
在一些实施方式中，所述阳性对照为B群链球菌培养物或其稀释物。
本发明另一方面提供一种B群链球菌cfb基因RNA实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，其包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的捕获探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的靶标检测探针，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
本发明再一方面提供一种检测B群链球菌的非疾病诊断目的的方法，其包括以下步骤：
1)向试样中加入GBS核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入GBS扩增检测液进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；
4)根据步骤3)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
若dt≤35，则试样中含有B群链球菌；若dt>35，则试样中不含有B群链球菌。
在一些实施方式中，步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min。
在一些实施方式中，步骤3)中所述第二步反应的条件为40℃-45℃反应30-60min。
在一些实施方式中，所述试样来源包括围产期妇女生殖道及直肠分泌物、物体表面附着物、饮用水、食品、血液制品、乳制品、唾液、微生物培养物。
基于以上技术方案提供的B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中包括GBS核酸提取液、GBS扩增检测液和SAT酶液等，其中在GBS核酸提取液中可包含用于捕获检测序列的捕获探针和用于与靶标序列特异性结合的第一引物，在GBS扩增检测液中可含有第一引物、第二引物、靶标检测探针等，SAT酶液则含有反应过程中所需要的RNA聚合酶和反转录酶等。本发明根据B群链球菌cfb基因RNA优化设计获得更适合于B群链球菌检测的引物和探针，并在使用过程中通过分步添加上述反应液分步反应，可以避免不同引物、探针之间的相互干扰，体系反应较为简单，并保留实时荧光核酸恒温扩增检测技术的高特异性优点，还可以实现对B群链球菌的高灵敏度检测。本发明除用于临床医学的B群链球菌检测，还可以用于对非医学诊断用样本，例如物体表面附着物、唾液等环境样本，以及血液制品、乳制品、饮用水、食品等样本中的B群链球菌的检测，适合大范围推广使用。
与现有的检测方法相比，本发明同时具有以下优点：
(1)本发明试剂盒中引物和探针组根据B群链球菌cfb基因RNA进行优化设计获得，在检测过程中通过分步添加不同的组分进而实现更高的灵敏度检测。实施例结果表明，本发明提供的试剂盒和方法对B群链球菌检测的灵敏度可达25CFU/mL，且明显高于(至少一个数量级)上述文献2中公开的两种对GBS进行等温扩增检测的方法的灵敏度，因此本发明提供的试剂盒和方法能够满足更高灵敏度的要求。
(2)本发明采用实时荧光核酸恒温扩增检测技术对B群链球菌进行检测，其实验步骤和反应体系更加简单，易于实现自动化，且减少了操作人员感染的风险。
(3)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。
(4)本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对于上述文献1和文献2的DNA产物而言，污染易控，交叉影响小，不会引起样本交叉污染和环境污染。
(5)本发明方法只能检出未失活的B群链球菌，而不能检出失活的B群链球菌，因此相对PCR等方法能避免造成GBS筛查的假阳性。
附图说明
图1为实施例1中组1的引物和探针对系列浓度的B群链球菌阳性标准品的扩增曲线。
图2为实施例1中组2的引物和探针对系列浓度的B群链球菌阳性标准品的扩增曲线。
图3为实施例1中组3的引物和探针对系列浓度的B群链球菌阳性标准品的扩增曲线。
图4为实施例2中对B群链球菌临床拭子样本进行检测的扩增曲线。
图5为本发明提供的实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌的方法的特异性检测曲线。
图6为本发明提供的实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌的方法对未灭活的B群链球菌样本进行检测的扩增曲线。
图7为本发明提供的实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌的方法对失活的B群链球菌样本进行检测的扩增曲线。
图8为荧光PCR法对未灭活的B群链球菌样本进行检测的扩增曲线。
图9为荧光PCR法对失活的B群链球菌样本进行检测的扩增曲线。
具体实施方式
针对现有技术中存在的检测B群链球菌方法的缺陷，本发明利用核酸恒温同步放大检测的方法检测B群链球菌，并提供了用于B群链球菌检测的核酸恒温同步放大检测试剂盒及其专用引物和探针以及检测方法。
以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明提及的所有引物、探针和体外转录RNA产物用已有技术合成。
实施例1：用于实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌的专用引物和探针的设计
本发明人根据Genbank数据库已公开的B群链球菌核酸序列，从B群链球菌cfb基因RNA上其中高度保守且与其他相似病原体有较大差异的序列入手设计检测序列，按照引物和探针设计原则进行引物和探针设计，以对B群链球菌进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
该实施例共设计了多组引物和探针，其中选择以下3组引物和探针(组1、组2、和组3)对B群链球菌阳性对照(以下详述)和阴性对照(不含有B群链球菌核酸的体系，例如去离子水或样本保存液(商购))进行检测验证，从中筛选出特异性、灵敏度和重复性均较好的引物和探针组用于检测B群链球菌。
组1：
捕获探针：
CTAGCTTAGTTATCCCAAATCCCATATCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:1)
第一引物：
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTAAGGCTTCTACACGACT-3’(SEQ ID NO:2)；
第二引物：5’-CGGTTAATGAGGCTATTACTA-3’(SEQ ID NO:3)；
靶标检测探针：FAM 5’-GAGACAGUUUAUGAUUUGUCUC-3’Dabcyl(SEQ ID NO:4)；
其中在B群链球菌cfb基因RNA检测序列中第一引物和第二引物的扩增区域作为B群链球菌cfb基因RNA靶标序列，靶标检测探针与该靶标序列的扩增产物RNA拷贝特异性结合(下面组2、组3设计相同)。
组2：
捕获探针-1：
CCTTTTGTTCTAATGCCTTTACATCGTTAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:5)；
第一引物-1：
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATCACATCTGTTAAGGCTTCTACA-3’
(SEQ ID NO:6)；
第二引物-1：5’-AAAACCGGTTAATGAGGCTATT-3’(SEQ ID NO:7)；
靶标检测探针-1：FAM 5’-GGAGACAGUUUAUGAUUUGUCUCC-3’Dabcyl(SEQ ID NO:8)。
组3：
捕获探针-2：同组1的捕获探针(SEQ ID NO:1)；
第一引物-2：同组2的第一引物-1(SEQ ID NO:6)；
第二引物-2：同组2的第二引物-1(SEQ ID NO:7)；
靶标检测探针-2：同组2的靶标检测探针-1(SEQ ID NO:8)。
该实施例中阳性对照的制备方式包括以下步骤：
(1)从ATCC购买B群链球菌标准菌株(保藏编号ATCC BAA-1138)；
(2)用商品化脑心津液培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司，批号191016)对B群链球菌标准菌株进行扩大培养，培养后，通过梯度稀释涂布计算菌落数，作为阳性对照。
利用上述3组引物和探针(组1、组2、和组3)分别对通过阴性对照稀释阳性对照获得的系列阳性标准品(浓度分别为2.5×104CFU/mL、2.5×103CFU/mL、2.5×102CFU/mL、2.5×10CFU/mL)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测(具体检测方法如以下实施例2所述)。结果如图1-图3所示，其中图1为组1的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，图2为组2的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线，图3为组3的引物和探针的实时荧光核酸恒温扩增检测曲线。由图1-图3所示扩增检测曲线可知，组1的引物和探针组合可检出浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品，且具有较高的相对荧光强度，而组2和组3的引物和探针组合虽然也能检出浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品，但其检测的相对荧光强度较低，很容易受到阴性对照背景信号的干扰，而造成误判。
为了进一步评价上述3组引物和探针的组合对B群链球菌的检测灵敏度效果，还分别使用上述3组引物和探针组合对相同的10份样本(浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品)进行检测，检出率结果如下表1所示。可见组1的引物和探针组合的检出率为100％，2.5×10CFU/mL为其稳定检出浓度，而组2和组3的引物和探针组合的检出率均仅为80％，两者均不能稳定检出浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品。
表1：3组引物和探针组合对浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品的检出率结果
注：表中“+”表示检出，“-”表示未检出；
以上结果表明，只有组1中特定的引物探针组合才使得能够稳定且高灵敏度检测B群链球菌，可检测至浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品，因此确定组1所示的引物和探针用于对B群链球菌进行实时荧光核酸恒温扩增检测。
实施例2：实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌的方法
该实施例方法基于RNA恒温同步放大检测原理检测B群链球菌cfb基因RNA，其利用上述实施例2提供的试剂盒对样品中是否含有B群链球菌核酸进行检测，具体操作步骤为：
2.1、样品准备
分别取400μL B群链球菌阳性对照、400μL阴性对照和400μL待测样本分别置于样品处理管中备用；
2.2、核酸提取
(1)在各样品处理管中加入100μL-800μL GBS核酸提取液(HEPES 500mM、LLS 8％、捕获探针(SEQ ID NO:2)15μΜ、磁珠150mg/L、30pmol/mL的第一引物(SEQ ID NO:3))，混匀，60℃保温10分钟，室温放置5-10分钟；
(2)将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置2-5分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入600μL洗涤液(HEPES 25mM、NaCl150mM、1％SDS、EDTA 2.5mM)振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入600μL洗涤液和160μL矿物油，振荡均匀后静置2-5分钟，弃液体，保留磁珠；
(3)将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用。
2.3、SAT扩增检测
(1)向样品处理管中各加入40μL GBS扩增检测液(Tris 15mM、MgCl2 15mM、dNTP2.5mM、NTP 3mM、PVP40 1％、KCl 10mM、300pmol/mL的第二引物(SEQ ID NO:4)、200pmol/mL的第一引物(SEQ ID NO:3)、200pmol/mL的靶标检测探针(SEQ ID NO:5))，振荡重悬磁珠；
(2)取振荡混匀的上述40μL反应液加至洁净微量反应管，在42℃条件下放置5-10min。向微量反应管中加入13μL SAT酶液(含有M-MLV反转录酶60000U/mL、T7 RNA聚合酶40000U/mL、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mMzinc acetate(乙酸锌)、20mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)Triton X-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇))，42℃条件下反应5-10min，将反应管快速转至恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择FAM通道。
2.4、结果判定
根据SAT扩增结果得到的曲线，读取dt值(表示待测样本扩增曲线与阈值线交点对应的横坐标读数(循环数)，由软件自动读取判定)，判定结果。
结果判定标准为：
FAM通道dt≤35，则样品为阳性，即样品中含有B群链球菌；
FAM通道dt>35，则样品为阴性，即样品中不含有B群链球菌。
利用上述方法分别对10份B群链球菌拭子样本(生理盐水基质，下表2中拭子样本1-10，为阳性样本)和10份阴性样本(生理盐水，下表2中阴性样本1-10)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，并同步检测阳性对照和阴性对照。
结果如图4和下表2(其中dt值为软件自动判定)所示，图4中11条标准“S”型曲线分别对应10份拭子样本和阳性对照(曲线1所示)，曲线2表示阴性对照，10份阴性样本的曲线均大致处于曲线2位置(图4中未示出)。可见10例阳性样本检测结果均为阳性，10例阴性样本检测结果均为阴性，与样本的实际情况相吻合，阴阳性对照检测结果正常，证明本方法有效，可用于临床样本检测。
表2：10份阳性样本和10份阴性样本的实时荧光核酸恒温扩增检测结果
样本编号 dt值 样本编号 dt值
拭子样本1 20.0 阴性样本1 ＞40
拭子样本2 27.2 阴性样本2 ＞40
拭子样本3 24.2 阴性样本3 ＞40
拭子样本4 18.7 阴性样本4 ＞40
拭子样本5 21.3 阴性样本5 ＞40
拭子样本6 21.8 阴性样本6 ＞40
拭子样本7 20.2 阴性样本7 ＞40
拭子样本8 19.8 阴性样本8 ＞40
拭子样本9 21.2 阴性样本9 ＞40
拭子样本10 23.1 阴性样本10 ＞40
阳性对照 11.5 阴性对照 ＞40
参照本实施例，同样可以对其他临床诊断样本(如脑脊液、围产期妇女生殖道及直肠分泌物等)进行检测，还可以对非临床诊断样本，例如物体表面附着物等环境样本，以及血液制品、饮用水、食品(检测前先制成水样)、微生物培养物等样本中B群链球菌进行检测。
实施例3：等温扩增检测B群链球菌的方法的比较
在该实施例中，发明人还根据上述文献2公开的等温扩增检测B群链球菌的方法(RPA)和专利文献CN102888458A(以下称文献3)公开的LAMP方法对实施例1中制备的B群链球菌的阳性对照的10倍系列稀释样品进行检测，以与本发明实施例2确定的实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌的方法做比较，其中上述文献2公开的RPA方法，以及上述文献3公开的LAMP方法使用的引物如下表3所示。
表3：LAMP和RPA方法使用的引物信息
利用实施例1获得的B群链球菌的阳性对照模拟临床样本，使用生理盐水进行10倍倍比稀释，各浓度稀释物取1mL进行核酸提取，并分别采用上述表3所示的引物，以及实施例1中组1所示的引物探针组合(作为本发明方法)进行检测，其中LAMP和RPA方法按照上述文献3和文献2公开的操作进行，本发明方法按照上述实施例2的操作进行。检测结果如下表4所示。
表4：等温扩增检测B群链球菌的不同方法的检测结果
由上表4所示的结果可知，本发明的方法可检测至实施例1获得的B群链球菌的阳性对照的10000倍稀释度样品，而上述文献3和文献2公开的LAMP和RPA方法均只能检测至实施例1获得的B群链球菌的阳性对照的1000倍稀释度样品，表明相对于上述文献2和文献3公开的等温扩增检测B群链球菌的LAMP和RPA方法，本发明方法在检测B群链球菌时具有更高的检测灵敏度。
实施例4：实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌方法的特异性和敏感性
4.1、方法特异性
按照上述实施例2的方法分别对A群链球菌(化脓性链球菌，保藏号：ATCC 19615)、C群链球菌(BNCC 281388，马链球菌，购自北纳生物)、G群链球菌(BNCC 139853，停乳链球菌，购自北纳生物)(生理盐水基质，浓度均为1×106CFU/mL左右，每个链球菌样本重复3-4个样本，如下表5所示)进行检测，并同时检测上述实施例1获得的B群链球菌阳性对照和阴性对照，以评估本发明的实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌方法的特异性。
结果如图5和下表5(其中dt值为软件自动判定)所示，图5中曲线1表示阳性对照，曲线2表示阴性对照，另外的10条曲线分别对应A群链球菌、C群链球菌、和G群链球菌，均大致处于曲线2位置。可见对应A群链球菌、C群链球菌、G群链球菌的样本的检测结果均为阴性，与样本的实际情况相吻合，阴阳性对照检测结果正常，证明本方法在检测B群链球菌时具有良好的特异性。
表5：实时荧光核酸恒温扩增检测B群链球菌方法的特异性检测结果
4.2、方法敏感性
按照上述实施例2的方法实施例1制备的系列阳性标准品(浓度分别为2.5×104CFU/mL、2.5×103CFU/mL、2.5×102CFU/mL、2.5×10CFU/mL)和阴性对照进行实时荧光核酸恒温扩增检测，以评估本发明方法的敏感性。
结果如图1中A幅所示，可见使用本发明方法检测B群链球菌时可检测至浓度为2.5×10CFU/mL的阳性标准品，表明本发明方法针对B群链球菌的检测灵敏度可达2.5×10CFU/mL或以下，具有良好的敏感性。
实施例5：本发明方法对失活或未失活的B群链球菌的检测效果
该实施例5按照上述实施例2的方法分别对失活和未失活的B群链球菌样本进行检测，以评估本发明方法对失活或未失活的B群链球菌的检测效果，并与PCR方法针对失活和未失活的B群链球菌样本的检测效果做比较。其中本发明方法具体包括以下操作：
5.1、样品准备
分别取400μL B群链球菌阳性对照(实施例1制备)、400μL阴性对照和400μL待测样本(未经处理的B群链球菌样本梯度稀释液(未失活待测样本)和经过高温处理的B群链球菌样本梯度稀释液(失活待测样本)，浓度均分别为2.5×104CFU/mL、2.5×103CFU/mL、2.5×102CFU/mL、2.5×10CFU/mL)分别置于样品处理管中备用；
5.2、核酸提取、SAT扩增检测、结果判定：同实施例2中步骤2.2-2.4。
PCR方法则使用购自江苏硕世生物科技股份有限公司的B族链球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(货号为JB20112N)并按照其使用说明书对上述样本进行检测。
利用上述的本发明方法和PCR方法分别对未失活待测样本和失活待测样本的检测结果如图6-图9所示，其中图6表示本发明方法对未失活待测样本的扩增检测曲线，图7表示本发明方法对失活待测样本的扩增检测曲线，图8表示PCR方法对未失活待测样本的扩增检测曲线，图9表示PCR方法对失活待测样本的扩增检测曲线。可见，针对未失活待测样本，本发明方法可检测至浓度为2.5×10CFU/mL的样本，而无法检出经过高温处理失活的B群链球菌样本；而PCR方法均能检出未失活待测样本和失活待测样本，且最低均只能检测到浓度为2.5×102CFU/mL的样本。以上结果表明，相对于目前在检测GBS时常用的PCR方法，本发明方法有助于避免筛查结果的假阳性。
实施例6：B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒
该实施例提供的用于B群链球菌检测的试剂盒是基于RNA核酸恒温同步放大检测原理检测B群链球菌cfb基因RNA的试剂盒，具体包括以下组分：
(1)GBS核酸提取液：用于提取和纯化样本中的B群链球菌核酸，其可包含1-50μΜ捕获探针(SEQ ID NO:2)、和25-150pmol/mL第一引物(SEQ ID NO:3)；该GBS核酸提取液还可包含用于提取和纯化样本中的B群链球菌核酸的其他组分，例如250-800mM HEPES、4-10％十二烷基硫酸锂(LLS)、和50-500mg/L磁珠；
(2)GBS扩增检测液：其可包含250-750pmol/mL第二引物(SEQ ID NO:4)、143-857pmol/mL第一引物(SEQ ID NO:3)、和143-857pmol/mL靶标检测探针(SEQ ID NO:5)；该GBS扩增检测液还可包含用于扩增反应的其它组分，例如10-50mM Tris、5-40mM KCl、10-40mM MgCl2、1-20mM NTP、0.1-10mM dNTPs、1-10％PVP40；
(3)SAT酶液：其主要含16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶和8000-80000U/mL的RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)，具体含16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰基-L-半胱氨酸)、0.04-0.4mM zinc acetate(乙酸锌)、10-100mM trehalose(海藻糖)、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol(甘油)。
为了方便检测，该实施例提供的试剂盒还包含以下组分：
(4)阳性对照；可以为B群链球菌阳性培养物或其稀释物(实施例1中制备)；
(5)阴性对照：不含B群链球菌核酸的体系，例如去离子水或样本保存液(其含有高浓度去垢剂和生理盐水)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)GBS核酸提取液：其包含含有捕获探针的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；
(2)GBS扩增检测液：其包含第二引物、靶标检测探针和所述第一引物，其中所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列，所述靶标检测探针与靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；
(3)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；
其中：
所述捕获探针包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由其组成；
所述第一引物包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或由其组成；
所述第二引物包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或由其组成；
所述靶标检测探针包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或由其组成，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas，所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、MGB、DABCYL。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：
(4)阳性对照：含有B群链球菌核酸的体系；和/或
(5)阴性对照：不含有B群链球菌核酸的体系。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，
所述GBS核酸提取液的组分包括：1-50μΜ所述的捕获探针、和25-150pmol/mL所述的第一引物；
所述GBS扩增检测液的组分包括：250-750pmol/mL所述的第二引物、143-857pmol/mL所述的第一引物、和143-857pmol/mL所述的靶标检测探针；
所述SAT酶液的组分包括：16000-160000U/mL的M-MLV反转录酶、8000-80000U/mL的RNA聚合酶、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM乙酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)甘油。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为B群链球菌培养物或其稀释物。
6.一种B群链球菌cfb基因RNA实时荧光核酸恒温扩增检测的引物和探针组合，其包括：
核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的捕获探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的靶标检测探针，并在所述靶标检测探针的核苷酸序列两端分别携带有荧光报告基团和淬灭基团。
7.一种检测B群链球菌的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向试样中加入GBS核酸提取液进行核酸提取，获得分析检测样品；
2)向所述分析检测样品中加入GBS扩增检测液进行第一步反应，获得第一步反应液；
3)向所述第一步反应液中加入SAT酶液进行第二步反应，获得第二步反应液；同时进行实时荧光检测，获得实时荧光检测的dt值；
4)根据步骤3)获得的实时荧光检测的dt值进行结果判定；
若dt≤35，则试样中含有B群链球菌；若dt>35，则试样中不含有B群链球菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一步反应的条件为40℃-45℃保温3-15min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述第二步反应的条件为40℃-45℃反应30-60min。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述试样来源包括围产期妇女生殖道及直肠分泌物、物体表面附着物、饮用水、食品、血液制品、乳制品、唾液、微生物培养物。
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CN112654721A (zh) * 2018-06-13 2021-04-13 简·探针公司 用于检测b群链球菌核酸的组合物和方法

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