CN105219772B - 一组核苷酸序列及在沙门菌和志贺菌检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组用于MERT‑LAMP扩增的引物序列，其中包括分别针对沙门菌和志贺菌的引物F3、B3、EFIP、BIP、LF和LB，在每个EFIP引物的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。本发明还公开了上述引物在沙门菌和志贺菌检测中的应用。该应用实现了一步法多重恒温检测，操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快。
Description
技术领域
本发明涉及MERT-LAMP技术在细菌检测中的应用，特别是在沙门菌和志贺菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
背景技术
志贺菌(Shigella spp.)和沙门菌(Salmonella spp.)是两种重要的食源性疾病病原体，是广泛存在于环境中的革兰氏阴性菌。志贺菌和沙门菌常分离自食品样本及临床标本，引起食源性的肠热症，临床症状表现为发热、腹泻。据WHO数据统计，全球每年有180万病人死于腹泻，而绝大多数腹泻病例是由志贺菌和沙门菌导致，从而受到世界各国的高度关注，成为各国的重大公共卫生问题。在发展中国家，志贺菌是引起菌痢的最主要的病原体。然而，无论是在发展中国家还是发达国家，沙门菌是导致食源性疾病最重要的病原体。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗，开展食品监测以及志贺菌和沙门菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的检测方法，能够同时检测和鉴定志贺菌和沙门菌成为必要。
目前对于志贺菌和沙门菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定。该方法耗时大约5到7天，包括增菌，选择培养及后续的生化鉴定，其劣势是耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于志贺菌和沙门菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些检测技术诊断志贺菌和沙门菌的PCR方法和Real-time PCR方法，检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由Notomi等建立的一种新的核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件(60～65℃)下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forward inner primer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物为F3和B3。另外的两条环引物(Loop primes,LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量达到109个拷贝。
LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是直接在产物中加入SYBR Green Ⅰ染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。然而，这些方法都只能检测LAMP反应是否进行，不能识别针对某一靶序列的特异性扩增，导致LAMP技术只能检测单一目的序列，限制了LAMP技术的运用。
为了克服传统LAMP方法技术瓶颈，本发明人于2015年公开了一种新的MERT-LAMP(Multiple Endonuclease Restriction Real-Time Loop-Mediated IsothermalAmplification)扩增技术(CN104962607A)，即，多限制性内切酶实时环介导等温扩增技术。该专利文献公开的相关技术内容作为引用技术文献被并入到本申请的说明书内容之中。
MERT-LAMP扩增技术以LAMP反应为基础，结合限制性内切酶酶切和荧光检测原理，通过在LAMP扩增中的FIP和/或BIP引物5’端增加限制性酶切位点序列，并在其上标记荧光基团，以及在引物其它部分上标记猝灭基团，扩增产物能够被反应体系中的限制性内切酶特异性的识别、切割，该过程将荧光基团和猝灭基团分开，释放的荧光信号可以通过荧光检测器检测。不同的荧光信号代表了不同的靶序列，从而可以一次扩增完成单种或多种目的基因片段的检测。从而实现一步法多重恒温检测。该方法操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快，因此在诊断检测领域有广泛的应用前景。
本发明分别针对志贺菌的特异基因ipaH和沙门菌的特异基因invA基因设计了两套MERT-LAMP扩增引物，旨在建立针对志贺菌和沙门菌病原体的快速、敏感和特异的核酸检测体系。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一组用于MERT-LAMP扩增的引物序列，其特征在于，所述序列包括：SEQ ID NO：1所示的引物Sal-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Sal-B3，SEQID NO：4所示的引物Sal-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Sal-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Sal-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Sal-LB；和/或
SEQ ID NO：8所示的引物Shi-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Shi-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Shi-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Shi-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Shi-LB，
其中，在引物Sal-EFIP和引物Shi-EFIP的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。
优选地，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Sal-FIP，和/或SEQ ID NO：10所示的引物Shi-FIP，FIP的使用为了提供更多的EFIP结合位点，从而形成更多的酶切末端。
在一个优选的技术方案中，引物Sal-EFIP标记的荧光基团为HEX，所述Shi-EFIP标记的荧光基团为Cy5。
更为优选地，所述引物Sal-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-1，所述Shi-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-2。
最为优选地，所述引物Sal-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第16碱基，所述引物Shi--EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第21碱基。
本发明还提供了上述的序列在沙门菌和/或志贺菌检测中的应用，所述检测采用MERT-LAMP扩增技术。
优选地，所述MERT-LAMP扩增的反应温度为62-65℃。
在一个优选的技术方案中，所述应用采用单一样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Sal-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Sal-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Sal-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Sal-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Sal-LF，SEQID NO：7所示的引物Sal-LB；或
SEQ ID NO：8所示的引物Shi-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Shi-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Shi-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Shi-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Shi-LB。
优选地，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Sal-FIP，或SEQ ID NO：10所示的引物Shi-FIP。
在另一个优选的技术方案中，所述应用采用多重样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Sal-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Sal-B3，SEQ ID NO：4所示的引物Sal-EFIP，SEQ ID NO：5所示的引物Sal-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Sal-LF，SEQID NO：7所示的引物Sal-LB；和
SEQ ID NO：8所示的引物Shi-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Shi-B3，SEQ ID NO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Shi-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Shi-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Shi-LB。
优选地，所述序列还包括SEQ ID NO：3所示的引物Sal-FIP，和SEQ ID NO：10所示的引物Shi-FIP。
本发明应用上述引物通过MERT-LAMP能单独分别检测志贺菌或沙门菌，而且也能一步同时准确的检测和鉴别志贺菌和沙门菌，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快的优点。诊断志贺菌的检测下限为62.5fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。诊断沙门菌的检测下限为125fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。本发明应用上述引物通过MERT-LAMP能同时准确的检测和鉴别志贺菌和沙门菌，对19株志贺菌和14株沙门菌的检测均为阳性，20株非志贺菌，非沙门菌不出现阳性结果，显示了良好的特异性。
附图说明
图1.引物设计位置和方向示意图
图2.MERT-LAMP扩增荧光目视检测和电泳检测结果判定图谱；
图3.MERT-LAMP技术的最佳反应温度检测图谱；
图4.MERT-LAMP检测单一样本的灵敏度检测图谱；
图5.LAMP检测单一样本的灵敏度检测图谱；
图6.MERT-LAMP检测多重样本的灵敏度检测图谱；
图7.MERT-LAMP技术的特异性检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
根据志贺菌属(Shigella spp.)的特异性基因ipaH(Genbank accessionno.M32063)和沙门菌属(Salmonella spp.)的特异基因invA(Genbank accessionno.NC.003197)设计MERT-LAMP扩增引物，ipaH基因存在于所有的志贺菌中，其特异性好，可以将志贺菌与其他亲缘关系较近的菌种和菌属区分开。invA基因存在于所有的沙门菌中，其特异性好，可以将沙门菌与其他亲缘关系较近的菌种和菌属区分开。利用多序列比对软件ClustalX 1.83和引物设计软件Primer Premier 5.0设计交叉反应引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的两套MERT-LAMP扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，序列见表1。
表1引物信息
Sal,Salmonella，沙门菌；
Shi,Shigella，志贺菌；
F,forward，正向；
B,backward，反向；
FIP,forward inner primer，正向内引物；
EFIP,the novel forward inner primer，酶标的正向内引物；
BIP,backward inner primer，反向内引物；
LF,loop forward primer，正向环引物；
LB,loop backward primer，反向环引物；
Probe，探针。
其中，Sal-EFIP标记有荧光基团HEX(六氯-6-甲基荧光素)和淬灭基团BHQ-1(Blackhole quencher 1，荧光淬灭剂1)，具体标记位置为：
5'-HEX-TGCAATG-GCGCGGCAT(BHQ-1)CCGCATCAATAGGTAT GCCCGGTAAACAGAT-3'；
Shi-EFIP标记有荧光基团Cy5(Cy5荧光素)和淬灭基团BHQ-2(Blackholequencher 2，荧光淬灭剂2)，具体标记位置为：
5'-Cy5-TGCAATG-TCCGCAGAGGCACT(BHQ-2)GAGTTTTTCACG CAATACCTCCGGATTC-3'；
Sal-Probe标记有荧光基团FAM(6-羧基荧光素)和淬灭基团BHQ-1，具体标记位置为：
5'-FAM-TGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCT-BHQ1-3’；
Shi-Probe标记有荧光基团Cy5和淬灭基团BHQ-2，具体标记位置为：
5'-Cy5-CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-BHQ-2-3'。
本发明中所使用和涉及的试剂：
Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。qPCR反应体系混合物Premix(Takara Bio,Inc.,Otsu,Japan，dNTP和缓冲液)购于北京Takara生物科技有限公司。PCR反应体系混合物MIX(Taq DNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。DL50DNA Marker和DL50DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯产品。
本发明实验中使用和涉及的主要仪器：Loopamp实时浊度仪LA-320C(EikenChemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。实时荧光检测仪为Rotor-Gene Q Real-Time System(Qiagen),德国Qiagen产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；凝胶成像系统为Bio-Rad GelDox XR,美国Bio-Rad产品。
志贺菌，沙门菌及其他种类菌的基因组DNA的提取。
基因组提取：细菌基因组的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNAminikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，志贺菌和沙门菌基因组DNA用GE缓冲液连续稀释(从2.5ng，250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg，62.5fg到31.25fg)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
实施例1.MERT-LAMP标准反应体系，
LAMP的反应体系如下：引物EFIP和FIP的浓度各为20pmol，引物BIP的浓度为40pmol(为了获得更好的技术效果，也可以引入引物EBIP，即增加限制性酶切位点序列的引物BIP，这时，引物BIP、EBIP的浓度各为20pmol)，引物F3和B3的浓度为5pmol，引物LF和BF的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real Time System,Qiagen)中进行中进行，等温扩增63-65℃1h，80℃5min终止反应。
实施例2.MERT-LAMP多重反应体系，
MERT-LAMP的反应体系如下：引物Shi-EFIP和FIP的浓度各为10pmol，引物Shi-BIP的浓度为20pmol,引物Shi-LF和shi-LB的浓度为10pmol，引物Shi-F3和Shi-B3的浓度为10pmol；引物Sal-EFIP、Shi-FIP的浓度各为15pmol，引物Sal-BIP的浓度为30pmol，引物Sal-LF和Sal-LB的浓度为15pmol，引物Sal-F3和Sal-B3的浓度为10pmol；10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real Time System,Qiagen)中进行，等温扩增63-65℃1h，80℃5min终止反应。
实施例3.LAMP标准反应体系，
LAMP的反应体系如下：引物FIP的浓度各为40pmol，引物BIP的浓度为40pmol，引物F3和B3的浓度为5pmol，引物LF和BF的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，2.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，8U的链置换DNA聚合酶，15U的DNA限制性内切酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real TimeSystem,Qiagen)中进行，等温扩增63-65℃1h，80℃5min终止反应。
实施例4.Real-time RCR方法反应体系
其中，沙门菌的qPCR体系的上游引物序列为Sal-F SEQ ID NO:15，下游引物序列为Sal-R SEQ ID NO:16，探针序列为Sal-Probe SEQ ID NO:17。
志贺菌的上游引物序列为Shi-F SEQ ID NO:18，下游引物序列为Shi-R SEQ IDNO:19，探针序列为Shi-Probe SEQ ID NO:20。
在实时荧光定量PCR仪上扩增并测定结果：
在荧光检测仪(Rotor-Gene Q Real Time System,Qiagen)中进行Real-time反应，扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定该反应的Ct(cyclethreshold)值。
实施例5.普通RCR反应体系：
PCR反应条件：
其中，沙门菌的上游引物序列为Sal-F SEQ ID NO:15，下游引物序列为Sal-R SEQID NO:16。
志贺菌的上游引物序列为Shi-F SEQ ID NO:18，下游引物序列为Shi-R SEQ IDNO:19。
反应结束后，取10μl PCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并在凝胶成像系统上观察分析结果。
实施例6.MERT-LAMP的可行性验证
标准体系用于验证MERT-LAMP引物的可行性，在标准体系条件下，加入一套对应的MERT-LAMP引物和对应的DNA模板，通过可视颜色变化法、电泳检测法和荧光检测方法证实MERT-LAMP技术可行。
可视颜色变化法：MERT-LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图2A(志贺菌)和2B(沙门菌)。
电泳检测法：由于MERT-LAMP反应与LAMP反应相似，其产物也是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小片段区带组成的阶梯式图谱，可以根据片段大小进行判定，见图2C(志贺菌)和2D(沙门菌)。
实时荧光检测法：标准体系条件下，在反应管中加入一套引物和对应的模板，酶切后产生的荧光通过荧光检测器接收，得到稳定的荧光曲线。
实施例7.测定MERT-LAMP技术的最佳反应温度
在标准体系条件下，加入志贺菌、沙门菌的MERT-LAMP引物和志贺菌及沙门菌的DNA模板，其模板浓度为25pg/ul。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时荧光仪进行检测，在不同的温度下得到两组不同的动态曲线图，见图3A和3B。62-65℃被推荐作为MERT-LAMP技术的最佳反应温度。
实施例8.MERT-LAMP检测单一样本的灵敏度
在标准体系条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应体系中，通过实时荧光检测，得到稳定的荧光检测图形，见图4。MERT-LAMP检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为62.5fgDNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至62.5fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图4A。当产物进行电泳检测时，其检测下限也为62.5fg DNA/反应管，见图4B。
MERT-LAMP检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为125fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至125fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增，见图4C。当产物进行电泳检测时，其检测下限也为125fg DNA/反应管,见图4D。
实施例9.比较MERT-LAMP，LAMP，qPCR及PCR检测单一样本的灵敏度
在标准LAMP体系条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反应体系中，通过实时浊度检测，得到稳定的实时浊度检测图形，见图5。LAMP检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为62.5fg DNA/反应管，消耗的最短检测时间大约为16分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至62.5fg以下时，LAMP反应不出现阳性扩增,见图5A。当产物进行电泳检测时，其检测下限也为62.5fg DNA/反应管，见图5B。(图5A中，实时浊度曲线从左到右依次对应的DNA浓度为2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg和62.5fg/微升)；
LAMP检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为125fg DNA/反应管，消耗的最短检测时间大约为18分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约26分钟。当反应体系中基因组模板量降低至125fg以下时，LAMP反应不出现阳性扩增见图5C。当产物进行电泳检测时，其检测下限也为125fg DNA/反应管,见图5D。(图5C中，实时浊度曲线从左到右依次对应的DNA浓度为2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg和125fg/微升)；
在标准的qPCR反应条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反qPCR应体系中，通过实时荧光检测，得到稳定的实时荧光检测图形，见表2。qPCR检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为2.5pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，qPCR反应不出现阳性扩增,见表2。qPCR检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为2.5pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至2.5pg以下时，qPCR反应不出现阳性扩增,见表2。
在标准的PCR反应条件下，倍比稀释模板DNA(2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升)，1微升各浓度模板加入反qPCR应体系中，PCR检测单一靶序列，诊断志贺菌的检测下限为25pg DNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，PCR反应不出现阳性扩增,见表2。PCR检测单一靶序列，诊断沙门菌的检测下限为25pgDNA/反应管，当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，PCR反应不出现阳性扩增,见表2。
表2.MERT-LAMP，LAMP，qPCR及PCR检测单一样本的灵敏度比较
实施例10.验证MERT-LAMP的多重检测能力及灵敏度
为了得到稳定的多重荧光检测图形，对标准体系进行优化适应多重检测，建立多重检测体系。我们在多重反应混合物中同时加入两套引物及对应的模板(倍比稀释模板DNA至2.5ng,250pg,25pg,2.5pg,250fg,125fg，62.5fg和31.25fg/微升，1微升各浓度模板加入多重MERT-LAMP反应体系中)。通过荧光检测器检测，得到稳定的多重荧光检测图，见图6。MERT-LAMP反应体系能够同时进行两个靶序列的检测，证明了MERT-LAMP技术的多重检测能力，应用MERT-LAMP检测多个靶序列时，其检测时间和检测灵敏度与单序列检测没有质的变化，最短的检测时间为12分钟左右。
多重MERT-LAMP同时检测多个靶序列时，诊断志贺菌的检测下限为62.5fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至62.5fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图6A。诊断沙门菌的检测下限为125fg DNA/反应管，且消耗的最短检测时间大约为12分钟，检测最低检测限水平的DNA也仅仅消耗大约28分钟。当反应体系中基因组模板量降低至125fg以下时，MERT-LAMP反应不出现阳性扩增,见图6B。
实施例11.检测特异性评价
以常见的致病菌及条件致病菌DNA(志贺菌，沙门菌，霍乱弧菌，副溶血弧菌，创伤弧菌，单增李斯特菌，伊氏李斯特菌，蜡样芽胞杆菌，肠致病性大肠杆菌，肠产毒性大肠杆菌，肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价MERT-LAMP反应体系的特异性，菌株信息见表3。MERT-LAMP扩增技术能同时准确的检测和鉴别志贺菌和沙门菌，非志贺菌，非沙门菌不出现阳性结果，说明MERT-LAMP方法的特异性良好，见图7。
表3.菌株信息
注:U，未鉴定菌株；ATCC,美国菌种保藏中心；ICDC,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。
Claims (8)
1.一组用于MERT-LAMP扩增的引物序列，其特征在于，所述序列包括：SEQ ID NO：1所示的引物Sal-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Sal-B3， SEQ ID NO：3所示的引物Sal-FIP，SEQ IDNO：4所示的引物Sal-EFIP， SEQ ID NO：5 所示的引物Sal-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Sal-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Sal-LB；和/或
SEQ ID NO：8所示的引物Shi-F3， SEQ ID NO：9所示的引物Shi-B3，SEQ ID NO：10所示的引物Shi-FIP，SEQ ID NO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Shi-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Shi-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Shi-LB，
其中，在引物Sal-EFIP和引物Shi-EFIP的5’端各标记有一个彼此不同的荧光基团，并在所述引物的其它位置标记有一荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于，引物Sal-EFIP标记的荧光基团为HEX，所述Shi-EFIP标记的荧光基团为Cy5。
3.根据权利要求2所述的序列，其特征在于，所述引物Sal-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-1，所述Shi-EFIP标记的荧光猝灭基团为BHQ-2。
4.根据权利要求3所述的序列，其特征在于，所述引物Sal-EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第16 碱基，所述引物Shi--EFIP的荧光猝灭基团标记位置位于5’端第21碱基。
5.根据权利要求1-4中任一所述的序列在沙门菌和/或志贺菌检测中非诊断目的的应用，所述检测采用MERT-LAMP扩增技术。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述MERT-LAMP扩增的反应温度为62-65℃。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用采用单一样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Sal-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Sal-B3， SEQ ID NO：3所示的引物Sal-FIP，SEQ ID NO：4所示的引物Sal-EFIP， SEQ ID NO：5 所示的引物Sal-BIP，SEQ ID NO：6所示的引物Sal-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Sal-LB；或
SEQ ID NO：8所示的引物Shi-F3， SEQ ID NO：9所示的引物Shi-B3，SEQ ID NO：10所示的引物Shi-FIP，SEQ ID NO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Shi-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Shi-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Shi-LB。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用采用多重样本检测模式，所使用的引物为：
SEQ ID NO：1所示的引物Sal-F3，SEQ ID NO：2所示的引物Sal-B3，SEQ ID NO：3所示的引物Sal-FIP， SEQ ID NO：4所示的引物Sal-EFIP， SEQ ID NO：5 所示的引物Sal-BIP，SEQID NO：6所示的引物Sal-LF，SEQ ID NO：7所示的引物Sal-LB；和
SEQ ID NO：8所示的引物Shi-F3，SEQ ID NO：9所示的引物Shi-B3，SEQ ID NO：10所示的引物Shi-FIP ，SEQ ID NO：11所示的引物Shi-EFIP，SEQ ID NO：12所示的引物Shi-BIP，SEQ ID NO：13所示的引物Shi-LF，SEQ ID NO：14所示的引物Shi-LB。
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