CN101603071A

CN101603071A - 一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法

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Publication number: CN101603071A
Application number: CNA2008100479947A
Authority: CN
Inventors: 陈福生; 朱胜梅
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2009-12-16

Abstract

本发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行检测的环介导等温DNA扩增(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、Bst DNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴酚蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是配制反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速、无需特殊仪器试剂且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检测。

Description

一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法

技术领域

本发明涉及一种环介导等温DNA扩增方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)同时检测沙门菌和志贺菌的技术。

背景技术

根据国家食源性疾病监测网的统计资料显示：近十年间，我国由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门菌和志贺菌是最常见和最主要的病因物质。这两种病原细菌常常同时出现在肉制品、牛奶等食品中，因此快速检测它们对有效地控制其传播和预防食物中毒非常重要。

沙门菌(Salmonella spp.)是一类广泛分布于自然界，可使人和动物发病的具有极大危害的革兰阴性肠道致病菌，能引起人胃肠炎、伤寒、败血症等症状。目前全世界已分离出2000多个血清型，我国已发现216个。沙门菌常污染各种肉、鱼、蛋、乳类食品而引起食物中毒，其中以肉类占多数。沙门菌污染食品的主要原因有：(1)病畜或病禽的肉制品；(2)病畜或病禽的粪便污染食品；(3)带菌人在制作食品过程中污染食品；(4)生熟食品未分开造成的交叉污染。

志贺菌属(Shigella spp.)是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。志贺菌病常为食物爆发型或经水传播，志贺菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅和食堂等。食源性志贺菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，接触食品人员个人卫生差，已污染的食品存放在不适当的温度下等。

目前鉴定沙门菌和志贺菌的方法主要有细菌学检查和免疫学方法。前者作为我国国标检测方法，虽然结果可靠，但是操作烦琐、耗时，已经不能满足大量样品的检测需要，而后者虽然可以快速检测，但容易出现假阳性且重复性较差。

新兴的分子生物学的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、依耐核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)以及链置换技术(SDA)等，这些方法都能扩增靶核酸到相似的数量级，都有较高的检出限，但是它们仍然有一些缺陷不能克服。它们有的需要精密的仪器来扩增，有的因为对靶序列的选择特异性不高而需要精细的方法来检测扩增产物。尽管操作简单，但需要高精度的热循环仪使得PCR这一有力的技术没有被广泛的应用。另一方面，不使用热循环仪的NASBA和3SR，在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。SDA利用四种引物在等温条件下扩增很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄落的环节，必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。

综合以上原因，研究一种快速、准确、简便的方法来检测沙门菌和志贺菌是非常必要的。本发明选用沙门菌高度保守的invA基因，设计了6条能在60℃～65℃的温度条件下扩增沙门菌一段DNA序列的特异性引物。invA基因是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。选用志贺菌高度保守的ipaH基因，设计了6条能在60℃～65℃的温度条件下扩增志贺菌一段DNA序列的特异性引物。所有的志贺菌均携带一个侵袭性非结合型大质粒，该质粒编码多种侵袭性相关外膜蛋白。Venkatesan等发现侵袭性质粒抗原H(invasive plasmid，ipaH)同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不因传代而丢失。

该扩增反应利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的大片段，在64℃左右的温度条件下即可完成对靶基因的特异性扩增。由于分别其针对invA基因和ipaH基因的6个区段，所以特异性高；且不需要PCR仪，仅需一个水浴锅即可完成；另外，在反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生一种焦磷酸镁的沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，无需进行凝胶电泳。

实验证明，通过该法检测食品中污染的沙门菌和志贺菌，其特异性良好，操作简单，无需昂贵仪器和试剂，且灵敏度比常规PCR高。

主要参考文献

[1]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H.，et al.，Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res，2000，28(12)：e63

[2]Mori Y，Kitao M，Tomita N，et al.，Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifyingtemplate DNA.Biochem.Biophys.Methods，2004，59：145～157

[3]Mori Y，Nagamine K，Notomi T，et al.，Detection of Loop-Mediated Isothermal AmplicationReaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation.Biochem.Biophys.Res.Commun，2001，289：150～154

[4]Nagamine K，Kuzuhara Y，Notomi T，Biochem.Biophys.Res.Commun，2002，290(4)：1195～1198

[5]Mori Y，Hirano T，Notomi T，Sequence specific visual detection of LAMP reactions byaddition of cationic polymers.BMC Biotechnology.2006，6：3

[6]王茂起，刘秀梅，王竹天等.中国食品污染监测体系的研究.中国食品卫生杂志，2006，18(6)：491～497

[7]刘华伟，郭蔼光，马立农等.PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用动物.医学进展，2004，25(6)：55～58

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种简单方便的快速同时检测沙门菌和志贺菌的方法。

(二)技术方案

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

1.样品DNA的提取

样品按照GB4789.5-2003处理，经增菌培养后，取培养物1mL于12000r/min离心5min；沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为提取的DNA模板。

2.LAMP反应体系

反应体系中分别加入以下物质：10×LAMP bufffer 2.5μL，10mmol/L Mg²⁺4.0～6.0μL，10mmol/LdNTP 1.5～2.5μL，10mmol/L betaine 1.5～2.5μL，0.5μmol/L的invA-FIP、invA-BIP、ipaH-FIP和ipaH-BIP各2μL，0.25μmol/L的invA-F3、invA-B3、ipaH-F3和ipaH-B3各0.5μL，1μmol/L环引物invA-LB、invA-LF、ipaH-LB和ipaH-LB各0.5μL，样品中提取的DNA模板2.0～5.0μL，Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL；超纯水补至25μL。

3.反应条件

63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min。

(三)有益效果

本发明以沙门菌高度保守的invA基因和志贺菌ipaH基因为靶基因，设计了两套用于扩增这两个基因部分序列的特异性引物，研究了反应体系和反应条件，能检出10fg/反应的混合DNA，克服了目前所用细菌培养法繁琐费时和免疫检测法易出现假阳性及一些分子生物学方法需要特殊仪器和试剂等缺点。

具体实施方式

1.引物的设计

沙门菌引物如下：

invA-F3：5′-GCGATAATATGGGGCGGAAT；

invA-B3：5′-CGCCTTTGCTGGTTTTAGGT；

invA-FIP：5′-TCCCGGCAGAGTTCCCATTGAAATCATGACGCAGCTGTTGAA；

invA-BIP：5′-TTCCCGCTGCCGGTATTTGTTGCTACGTTTTGCTTCACGGA；

invA-LB：5′-GCCGTAACAACCAATACAAATGG；

invA-LF：5′-TATTCGGTGGTTTTAAGCGTACTC。

志贺菌引物如下：

ipaH-F3：5′-GCCTTTCCGATACCGTCTCT；

ipaH-B3：5′-TGATGGACCAGGAGGGTT；

ipaH-FIP：5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACCTCCGGATFC；

ipaH-BIP：5′-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA；

ipaH-LB：5′-TGCAGCGACCTGTTCACG；

ipaH-LB：5′-CTGCTGATGCCACTGAGAGC。

2.样品的处理

样品处理后，经增菌培养，取培养物1mL于12000r/min离心5min；沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为提取的DNA模板。

3.LAMP反应体系

在反应体系中分别加入以下物质：10×LAMPbufffer 2.5μL；10mmol/L Mg²⁺4.0～6.0μL；10mmol/LdNTP 1.5μL～2.5μL；10mmol/L betaine 1.5μL～2.5μL；0.5μmol/L的FIP和BIP各2μL；0.25μmol/L的F3和B3各0.5μL；0.5μmol/L的LF和LB各1μL；超纯水2.5μL；样品中提取的DNA模板5.0μL；Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL，补水至25μL。

4.反应条件

63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min。

5.检测结果

直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀，则为阳性结果，如果未出现上述现象，则为阴性结果。

另一种检测结果的方法：取反应后的混合液2μL，加入0.5μL溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于紫外检测系统检测电泳条带。如果出现梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。

Claims

1.一种同时检测沙门菌和志贺菌的环介导等温DNA扩增方法，包括设计沙门菌invA基因和志贺菌ipaH基因特异性引物，其特征在于，其中沙门菌引物如下：

invA-F3：5′-GCGATAATATGGGGCGGAAT；

invA-B3：5′-CGCCTTTGCTGGT TTTAGGT；

invA-FIP：5′-TCCCGGCAGAGTTCCCATTGAAATCATGACGCAGCTGTTGAA；

invA-BIP：5′-TTCCCGCTGCCGGTATTTGTTGCTACGTTTTGCTTCACGGA；

invA-LB：5′-GCCGTAACAACCAATACAAATGG；

invA-LF：5′-TATTCGGTGGTTTTAAGCGTACTC；

志贺菌引物为：

ipaH-F3：5′-GCCTTTCCGATACCGTCTCT；

ipaH-B3：5′-TGATGGACCAGGAGGGTT；

ipaH-FIP：5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTTTTTCACGCAATACCTCCGGATTC；

ipaH-BIP：5′-TCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTCCGGAGATTGTTCCATGTGA；

ipaH-LB：5′-TGCAGCGACCTGTTCACG；

ipaH-LB：5′-CTGCTGATGCCACTGAGAGC。

2.根据权利要求1所述的沙门菌和志贺菌的环介导等温DNA扩增检测方法，其特征在于，包括样品DNA的提取：细菌培养物1mL于12000r/min离心5min；沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板。

3.根据权利要求2所述的沙门菌和志贺菌的环介导等温DNA扩增检测方法，其特征在于，扩增反应体系包括10×LAMP bufffer 2.5μL，10mmol/L Mg²⁺4.0～6.0μL，10mmol/LdNTP1.5～2.5μL，10mmol/L betaine 1.5～2.5μL，0.5μmol/L的invA-FIP、invA-BIP、ipaH-FIP和ipaH-BIP各2μL，0.25μmol/L的invA-F3、invA-B3、ipaH-F3和ipaH-B3各0.5μL，1μmol/L环引物invA-LB、invA-LF、ipaH-LB和ipaH-LB各0.5μL，样品中提取的DNA模板2.0～5.0μL，Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL。

4.根据权利要求3所述的沙门菌和志贺菌的环介导等温DNA扩增检测方法，其特征在于，扩增反应条件为63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min～10min终止反应。

5.根据权利要求4所述的沙门菌和志贺菌的环介导等温DNA扩增检测方法，其特征在于，扩增结果的检测可以直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀(浑浊)，则为阳性结果，如果未出现上述现象，则为阴性结果。

6.根据权利要求5所述的沙门菌和志贺菌的环介导等温DNA扩增检测方法，其特征在于，另一种检测结果的方法是取反应后的混合液2μL，加入0.5μL溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，在0.5μg/mL溴化乙锭溶液中浸泡20min，置于凝胶成像系统照相，如果出现梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。