CN101497923A - 一种快速检测沙门菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BstDNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴氛蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速、无需特殊仪器试剂且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及种特异性引物在环介导等温DNA扩增反应检测沙门菌中的用途。这些引物可用于检测食品中沙门菌的污染。
背景技术
沙门菌是(Salmonella spp.)是一类广泛分布于自然界，可使人和动物发病的具有极大危害的革兰氏阴性肠道致病菌，能引起人胃肠炎、伤寒、败血症等症状。目前全世界已分离出2000多个血清型，我国已发现216个。根据国家食源性疾病监测网的统计资料显示，食品中污染的微生物是引起食源性疾病的主要因素之一。近十年来，在我国由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门菌始终是最常见和最主要的病原因子，尤其在生肉及熟食制品中。因此，检测沙门菌对有效控制其传播和预防食物中毒非常重要。
目前鉴定沙门菌主要有细菌学检查和免疫学方法。前者作为我国国标检测沙门菌的方法，虽然结果可靠，但是操作烦琐、耗时，已经不能满足大量样品的检测需要，而后者虽然可以快速检测，但容易出现假阳性。
新兴的分子生物学的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、依耐核酸序列的扩增(NASBA)，自主序列复制(3SR)以及链置换技术(SDA)等，每种扩增技术都有自己的创新处来启始的DNA合成。例如，PCR利用双链DNA的热变性来促进下一轮的DNA的合成。3SR和NASBA利用一系列的转录和反转录反应消除热变性来扩增靶序列。同样的，SDA利用一组限制酶酶切来消除热变性步骤，用修饰的核酸作为底物来进行链置换DNA合成。这些方法都能扩增靶核酸到相似的数量级，都有较高的检出限以及都在一个小时左右，但是它们仍然有一些缺陷不能克服。它们有的需要精密的仪器来扩增，有的因为对靶序列的选择特异性不高而需要精细的方法来检测扩增产物。尽管操作简单，但需要高精度的热循环仪使得PCR这一有力的技术没有被广泛的应用。另一方面，不使用热循环仪的NASBA和3SR，在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40℃来进行扩增。SDA利用四种引物在等温条件下扩增很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄落的环节：必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。
综合以上原因，研究一种快速、准确、简便的方法来检测沙门菌是非常必要的。
本发明选用沙门菌高度保守的invA基因，设计了4条能在60℃～65℃的温度条件下扩增沙门菌一段DNA序列的特异性引物。invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。该扩增反应依赖于一组针对靶基因的引物，包括一组内引物FIP和BIP，以及一组外引物F3和B3，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的大片段，在64℃左右的恒温条件下即可完成对靶基因的特异性扩增。由于其针对invA基因的6个区段，所以特异性高；且其反应温度恒定，不需要PCR仪，仅需一个水浴锅即可完成；另外，在反应过程中，从dNTPs中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子结合，能产生一种焦磷酸镁的沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就可判定扩增结果，无需进行凝胶电泳。
实验证明，通过该法检测食品中污染的沙门菌，其特异性良好，操作简单，无需昂贵仪器和试剂，且灵敏度比常规PCR高。
主要参考文献
[1]Notomi T.，Okayama H.，Masubuchi H.，et al.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA.Nucleic Acids Res，2000，28(12)：e63.
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[7]王茂起，刘秀梅，王竹天，等.中国食品污染监测体系的研究，中国食品卫生杂志，2006，18(6)：491～497.
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种简单方便的快速检测沙门菌的方法。
(二)技术方案
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
1.样品DNA的提取：样品按照GB-20031525处理，经增菌培养后，取培养物1mL于12000r/min离心5min；沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为提取的DNA模板。
2.LAMP反应体系为：
在25μL反应体系中分别加入以下物质：
10×LAMP bufffer 2.5μL
10mmol/L Mg2+ 5.0μL
10mmol/LdNTP 2.0μL
10mmol/L betaine 2.0μL
0.5μmol/L的FIP和BIP各2μL
0.25μmol/L的F3和B3各0.5μL
超纯水2.5μL
样品中提取的DNA模板5.0μL
Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL
3.反应条件：63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2～10min。
(三)有益效果
本发明以沙门菌invA基因为靶基因，设计了一组用于扩增该基因部分序列的特异性引物，研究了反应体系和反应条件，能检出10fg/反应的DNA，克服了目前所用细菌培养法和免疫检测法繁琐费时、易出现假阳性及一些分子生物学方法需要特殊仪器和试剂等缺点。
具体实施方式
实施步骤
1.引物的设计
外引物F3(forward outer primer)：TGTTACGGCTATTTTGACCA
外引物B3(forward outer primer)：TCGAGATCGCCAATCAGT
内引物FIP(backward inner primer)：
AGAGTACGCTTAAAACCACCGA-TTTCAATGGGAACTCTGCC
内引物BIP(backward inner primer)：
TAGCGCCGCCAAACCTAAAA-CCTAACGACGACCCTTCT
2..样品的处理
样品按照GB/T4789.4-2003处理，经增菌培养后，取培养物1mL于12 000r/min离心5min；沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/LEDTA，pH8.0)洗涤，12 000r/min离心5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12 000r/min离心5min，上清液即为提取的DNA模板。
3.LAMP反应体系
在25μL反应体系中分别加入以下物质：
10×LAMP bufffer 2.5μL
10mmol/L Mg2+ 5.0μL
10mmol/LdNTP 2.0μL
10mmol/L betaine 2.0μL
0.5μmol/L的FIP和BIP各2μL
0.25μmol/L的F3和B3各0.5μL
超纯水2.5μL
样品中提取的DNA模板5.0μL
Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL
4.反应条件：63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min。
5.检测结果：直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀，则为阳性结果，如果未出现上述现象，则为阴性结果。
另一种检测结果的方法：取反应后的混合液2μL，加入0.5μL溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，置于紫外检测系统检测电泳条带。如果出现梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。
Claims (6)
1.一种沙门菌核酸环介导等温扩增检测方法，包括设计沙门菌invA特异性引物，其特征在于，其中外引物F3(forward outer primer)为：TGTTACGGCTATTTTGACCA；外引物B3为(forward outer primer)：TCGAGATCGCCAATCAGT；内引物FIP(backward inner primer)为：AGAGTACGCTTAAAACCACCGA-TTTCAATGGGAACTCTGCC；内引物BIP(backwardinner primer)为：TAGCGCCGCCAAACCTAAAA-CCTAACGACGACCCTTCT。
2.根据权利要求1所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括样品DNA的提取：细菌培养物1mL于12000r/min离心5min；沉淀用0.8mL1×TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤，12000r/min离心5min，沉淀加入100μL无菌水，混匀后，于100℃沸水浴15min，立即冰浴5min，12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板。
3.根据权利要求2所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，25μL扩增反应体系包括10×LAMP bufffer 2.5μL，10mmol/L Mg2+4.0-6.0μL，10mmol/LdNTP 1.5-2.5μL，10mmol/L betaine 1.5-2.5μL，0.5μmol/L的FIP和BIP各2μL，0.25μmol/L的F3和B3各0.5μL，样品中提取的DNA模板2.0-5.0μL，Bst DNA聚合酶8U/μL 1μL，不足部分用超纯水补足。
4.根据权利要求3所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，扩增反应条件为63℃～65℃水浴锅温浴60min，80℃加热2min-10min终止反应。
5.根据权利要求4所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，扩增结果的检测可以直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀。如果出现白色沉淀，则为阳性结果，如果未出现上述现象，则为阴性结果。
6.根据权利要求5所述的沙门菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，另一种检测结果的方法是取反应后的混合液2μL，加入0.5μL溴酚蓝上样缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，在0.5μg/mL溴化乙锭溶液中浸泡20min，置于凝胶成像系统照相，如果出现梯度条带，则为阳性结果，如未出现，则结果为阴性。
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| CN104059906A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-09-24 | 南京工业大学 | 一种食源性致病菌dna的阶段控温快速提取方法 |
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2008
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| CN111057775B (zh) * | 2019-12-30 | 2022-06-14 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法 |
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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Open date: 20090805 |