CN110878367A

CN110878367A - 一种可检测snp的新型cpa方法、引物组和试剂盒

Info

Publication number: CN110878367A
Application number: CN201911236426.6A
Authority: CN
Inventors: 张建民; 温俊平; 廖明; 张红霞
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2020-03-13

Abstract

本发明公开了一种可检测SNP的新型CPA方法，包括以下步骤：(1)提取DNA为待检测模板；(2)设计交叉引物组，交叉引物上设计与该DNA突变位点相结合的RNA碱基；(3)建立反应体系，反应体系中包含RnaseHⅡ酶，将待检测模板加入到反应体系中进行扩增，当交叉引物与DNA突变位点相结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使扩增反应继续进行，当交叉引物与DNA突变位点不能结合时，扩增反应无法进行；(4)判断反应物中是否具有目标DNA。相应的，本发明还公开了基于上述方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒。本发明的检测方法具有特异性强和灵敏度高的优点。

Description

一种可检测SNP的新型CPA方法、引物组和试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种可检测SNP的新型CPA方法、引物组和试剂盒

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即DNA序列中单个碱基的差别。在自然界中，SNP广泛存在，对于SNP的检测分析在药物研制、临床检验和基因突变诊断等方面具有重要意义。

目前主流的SNP检测技术包括PCR-高通量测序技术、毛细管电泳技术，流式荧光杂交、变性高效液相色谱检测、等位基因特异寡核苷酸片段分析，PCR-焦磷酸测序技术、ARMS-PCR技术和HRM技术等，这些方法在SNP检测中或流程冗杂、或灵敏度低、或特异性差、或成本高，或易污染，因此亟需发明一种更好地检测SNP的新方法。

交叉引物恒温扩增(CPA)通过对靶基因设计五条特异性引物，在55～65℃恒温下可对靶基因实现指数级扩增，目前可用于疾病诊断和病原体的检测。与环介导等温扩增技术主要由两条内引物介导相比，CPA的循环扩增反应主要在一条交叉引物介导下完成，然而两者目前都只能用于扩增一定的基因片段而无法实现对SNP的检测。

鸡白痢病(PD)是由鸡白痢沙门菌引起的系统性疾病，主要造成幼龄小鸡死亡，母鸡产蛋量下降，该病能垂直传播，往往造成养殖场的重大损失。国务院提出2020年全国所有种鸡场的鸡白痢沙门菌病达到净化标准，但目前部分场净化效果还不太理想。鸡白痢沙门菌的早期快速检测鉴别是该病防控和净化的基础。鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌和肠炎沙门菌在临床症状上往往相似难以分辨。传统的分离鉴定方法流程冗长，如玻片凝集试验容易发生非特异性反应并且缺乏敏感性，因为三者都属于D血清群，在抗原表达式上非常接近，纯粹依据抗原式容易误判，目前临床用于特异性区分鸡白痢沙门菌与其他不同血清型沙门菌的方法非常有限，在目前国内养殖场提倡净化鸡白痢的大环境下，发明一种方便快速、敏感特异的鸡白痢沙门菌检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种可检测SNP的新型CPA方法，具有特异性强，敏感性高的特点。

本发明的目的在于提出一种基于上述方法检测检测鸡白痢沙门菌的引物组和试剂盒，具有准确快速检测出鸡白痢沙门菌的特点。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种可检测SNP的新型CPA方法，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

(2)设计交叉引物组，交叉引物上设计与该DNA突变位点相结合的RNA碱基；

(3)建立反应体系，反应体系中包含RnaseHⅡ酶，将待检测模板加入到反应体系中进行扩增，当交叉引物与DNA突变位点相结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使扩增反应继续进行，当交叉引物与DNA突变位点不能结合时，扩增反应无法进行；

(4)判断反应物中是否具有目标DNA。

进一步的，步骤(4)中，以显色法检测反应物中是否具有目标DNA。

进一步的，交叉引物组包括引物：LoopB、B3、F3、B2和BIP。

进一步的，反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、LoopB、B3、F3、B2和BIP。

进一步的，反应体系的反应温度为61℃。

基于权利上述方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，包括：

LoopB：5′-GCAATATTCTTATGCCTATCAGAGT-3′；

B3：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

F3：5′-ACTATTGCTTGCTATGGAAGAC-3′；

B2：5′-TAACGAACCTGCAACAGCTTTAAT-3′；

BIP：

5′-TGCAACAGCTTTAATACTGCATCAAGTGATGAGATAGAC(RNA碱基)TCTAC-C3 spacer-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

基于上述方法的检测鸡白痢沙门菌的试剂盒，包括反应液，反应液包括LoopB、B3、F3、B2和BIP；

LoopB：5′-GCAATATTCTTATGCCTATCAGAGT-3′；

B3：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

F3：5′-ACTATTGCTTGCTATGGAAGAC-3′；

B2：5′-TAACGAACCTGCAACAGCTTTAAT-3′；

BIP：

5′-TGCAACAGCTTTAATACTGCATCAAGTGATGAGATAGAC(RNA碱基)TCTAC-C3 spacer-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

进一步的，反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP 2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、LoopB+B2 1μl、B3+F3 0.5μl、和BIP 3μl。

本发明的有益效果为：

1、本发明创新性地发明了基于单核苷酸互补激活酶切割的交叉引物恒温扩增引物组和实验方法用于SNP的检测。其原理是靶向含有SNP的待检基因，结合交叉引物扩增法则，在交叉引物上设计与该DNA突变位点相结合的RNA碱基，当两者互补结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，阻断失效，扩增反应继续进行。当两者不互补时，阻断仍然有效，交叉引物介导的扩增无法继续完成。因本方法对于待检基因的循环扩增主要由一条交叉引物所介导，成功排除了因其他引物结合而产生的非特异性扩增，大大提高了对SNP检测的准确度，具有较好的敏感性，能应用于基层实验室实现对SNP的快速特异检测。

2、本发明的可检测SNP的新型CPA方法，具有反应效率高的特点，60min内即可完成检出。

3、本发明的可检测SNP的新型CPA方法特异性强，能很好的从22种沙门菌和9种其他致病菌中准确检出，检测下限为2100个拷贝数(μL)，敏感性强，优于PCR方法检测结果。

4、本发明的检测方法中将采用可视化比色法进行结果判断，具有实现SNP现场可视化快速检测的应用前景。

5、鸡白痢沙门菌rfbs基因是一个具有单核苷酸多态性(SNP)的特定DNA序列。在第237位点鸡白痢沙门菌为鸟嘌呤，而鸡伤寒沙门菌和鸡肠炎沙门菌等为腺嘌呤，别的一些血清型和别的种类的菌株不含有该基因或者变化较大。本发明根据鸡白痢沙门菌在第237位点的单核苷酸多态性，设计了基于单核苷酸互补激活酶切割的交叉引物恒温扩增引物组和实验方法。其原理是靶向鸡白痢rfbs基因，在交叉引物上设计与第237位点互补的RNA碱基，当两者互补结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，阻断失效，扩增反应继续进行。当两者不互补时，阻断发挥作用，交叉引物介导的扩增无法继续完成，从而实现特异性检测鸡白痢沙门菌的目的。因其循环扩增主要由一条交叉引物所介导，排除了因其他引物结合而产生的非特异性扩增，大大提高了对SNP检测的准确度，适合基层实验室用于对鸡白痢的检测。同时结合甲酚红作为指示剂的新型可视化比色法，使其具有应用于生产一线的前景。

附图说明

图1是本发明可检测SNP的新型CPA方法的原理图；

图2是基础反应体系扩增结果图；

图3是特异性评价实验结果图；

图4是敏感性评价实验结果图；

图5是临床分离样本鉴定的结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

实施例1一种可检测SNP的新型CPA方法

本实施例可检测SNP的新型CPA方法，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

(4)以显色法检测反应物中是否具有目标DNA。显色试剂采用甲酚红。

交叉引物组包括引物：LoopB、B3、F3、B2和BIP。反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、LoopB、B3、F3、B2和BIP。反应体系的反应温度为61℃。

实施例2基于实施例1中方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组

本实施例的引物组，包括：

LoopB：5′-GCAATATTCTTATGCCTATCAGAGT-3′；

B3：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

F3：5′-ACTATTGCTTGCTATGGAAGAC-3′；

B2：5′-TAACGAACCTGCAACAGCTTTAAT-3′；

BIP：

5′-TGCAACAGCTTTAATACTGCATCAAGTGATGAGATAGAC(RNA碱基)TCTAC-C3 spacer-3′；其中，C3 spacer表示修饰的阻断。

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

实施例3基于实施例1中方法的用于检测鸡白痢沙门菌的试剂盒

本实施例的试剂盒，包括反应液，反应液包括LoopB、B3、F3、B2和BIP；

LoopB：5′-GCAATATTCTTATGCCTATCAGAGT-3′；

B3：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

F3：5′-ACTATTGCTTGCTATGGAAGAC-3′；

B2：5′-TAACGAACCTGCAACAGCTTTAAT-3′；

BIP：

5′-TGCAACAGCTTTAATACTGCATCAAGTGATGAGATAGAC(RNA碱基)TCTAC-C3 spacer-3′；

引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP 2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、LoopB+B2 1μl、B3+F3 0.5μl、和BIP 3μl。

以检测鸡白痢沙门菌为例，验证本发明可检测SNP的新型CPA方法的可靠性。

1、材料和方法

1.1菌株

鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、科瓦利斯沙门菌、德比沙门菌、罗森沙门菌、伦敦沙门菌、韦太夫雷登沙门菌、鼠伤寒沙门菌、阿尔巴尼沙门菌、巴拿马沙门菌、塞罗沙门菌、肯塔基沙门菌、哈瓦那沙门菌、姆班达卡沙门菌、婴儿沙门菌、黄金海岸沙门菌、火鸡沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、圣保罗沙门菌、猪霍乱沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绵羊李斯特菌、志贺菌、鸭疫里莫氏杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌等，包括标准菌和由华南农业大学兽医学院人兽共患病防治重点实验室鉴定保存菌株。

1.2主要试剂

LB肉汤、LB琼脂、XLT4琼脂基础、缓冲蛋白胨水溶液(BPW)、四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB)、脑心浸出液肉汤(BHI)等购自广东环凯微生物科技有限公司；Bst酶、硫酸镁、Buffer等(新英格兰生物实验室公司)；RnaseHⅡ酶(Integrated DNA Technologies)；dNTP(北京全式金生物技术有限公司)；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；超纯水由Elix100纯净水装置制备(美国Millipore公司)；甲酚红、KOH(Sigma-Aldrich)。

1.3实验

1.3.1提取细菌基因组DNA

采用热裂解法制备各细菌基因组DNA模板，用于下述的特异性评价实验和敏感度实验评价。

DNA模板包括鸡白痢沙门菌(2株)、鸡伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、科瓦利斯沙门菌、德比沙门菌、罗森沙门菌、伦敦沙门菌、韦太夫雷登沙门菌、鼠伤寒沙门菌、阿尔巴尼沙门菌、巴拿马沙门菌、塞罗沙门菌、肯塔基沙门菌、哈瓦那沙门菌、姆班达卡沙门菌、婴儿沙门菌、黄金海岸沙门菌、火鸡沙门菌、阿贡纳沙门菌、印第安纳沙门菌、圣保罗沙门菌、猪霍乱沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、绵羊李斯特菌、志贺菌、鸭疫里莫氏杆菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌共32株。

1.3.2构建标准质粒

根据鸡白痢沙门菌rfbs基因登录号：GenBank:LK931482.1，鸡伤寒沙门菌rfbs基因登录号：AF442573，在两种菌的rfbs基因两侧设计PCR引物。rfbs F:AATATCACCATGTACAAACTCAAAG，rfbs R:ATCGTGTAGTGGGTGAGT。用PCR方法扩增出鸡白痢沙门菌和及鸡伤寒沙门菌rfbS基因的全长。

扩增出的产物经电泳实验验证后采用商业化试剂盒(品牌Omega)进行胶回收，过夜连接T载体，将连接产物转化入DH5α感受态细胞，将该感受态细胞进行扩大培养，提取DNA进行电泳测试和进行测序验证，同时按商业化试剂盒说明提取质粒。用分光光度计测定质粒浓度并换算成拷贝数，然后-20℃保存待用。

1.3.3引物设计

针对鸡白痢沙门菌rfbs基因，设计反应引物如下：

1.3.4建立基础反应体系

使用构建好的鸡白痢沙门菌标准质粒，鸡伤寒沙门菌标准质粒，设置荧光采集为1循环/min，共60个循环，调整试剂各组分比例，建立基础反应体系和优化反应温度。同时在相同反应条件下引入甲酚红作为指示剂，建立新型可视化监测的反应体系，阴性为红色，阳性为黄色。

基础反应体系为25μl体系，反应体系中具有：缓冲液(Buffer)：2.5μl，硫酸镁：2.0μl，dNTP：2μl，Bst酶(DNA聚合酶)：1.0μl，RnaseHⅡ酶(核酸内切酶)：0.1μl，BIP：3μl，F3+B3：0.5μl，LoopB+B2：1μl，Evagreen(荧光染料)：1μl，菌模板2.5μl，超纯水补齐。

基础反应体系扩增结果如图2所示，只有鸡白痢沙门菌标准质粒的荧光曲线发生明显扩增，而鸡伤寒沙门菌标准质粒不发生扩增，这是由于交叉引物上错配的存在无法激活RNase HⅡ酶对RNA碱基进行有效切割，从而反应被阻断无法进行循环扩增。实验结果验证方法可行，基础反应体系成功建立。同时使用甲酚红指示的新型可视化监测方法结果符合预期，鸡白痢沙门菌标准质粒完成扩增为黄色，图2中，A和C的指示液显示为红色，B的指示液显示为黄色。本发明具有实现SNP现场可视化快速检测的应用前景

1.3.5特异性评价实验

使用1.3.1提取的32株细菌基因组DNA模板，采用1.3.4建立的反应体系和反应温度，进行特异性评价实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和反应温度。结果如图3所示，其中，Ⅰ线和Ⅱ线是鸡白痢沙门菌的荧光检出结果，Ⅲ是其他血清型沙门菌和其他种细菌、阴性对照的荧光检出结果。由图3可知，本发明的可检测SNP的新型CPA方法能特异性的检出鸡白痢沙门菌。

1.3.6敏感性评价实验

经计算，1.3.2构建的鸡白痢沙门菌质粒原液拷贝数为2.1×10¹⁰拷贝，采用10^-4—10^-10稀释度质粒用于扩增实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和反应温度。敏感性评价的结果如图4所示。图4中，Ⅰ线为2.1×10⁶拷贝数扩增曲线，Ⅱ线为2.1×10⁵拷贝数扩增曲线，Ⅲ线为2.10×10⁴拷贝数扩增曲线，Ⅳ线为2100拷贝数扩增曲线，Ⅴ线为210拷贝数和阴性对照扩增曲线。

1.3.7临床分离样本鉴定

临床分离出27株鸡白痢沙门菌，分别提取DNA模板，用于扩增实验，实验条件采用1.3.4建立基础反应体系和反应温度，结果如图5所示，显示27株鸡白痢沙门菌在60min内全部被快速检出。

以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种可检测SNP的新型CPA方法、引物组和试剂盒

<160> 5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaatattct tatgcctatc agagt 25

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcagtgatg ttccacaat 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actattgctt gctatggaag ac 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taacgaacct gcaacagctt taat 24

<210> 5

<211>44

<212> DNA

<213>

tgcaacagct ttaatactgc atcaagtgat gagatagact ctac 44

Claims

1.一种可检测SNP的新型CPA方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取DNA为待检测模板；

(2)设计交叉引物组，所述交叉引物上设计与该DNA突变位点相结合的RNA碱基；

(3)建立反应体系，所述反应体系中包含RnaseHⅡ酶，将待检测模板加入到反应体系中进行扩增，当交叉引物与DNA突变位点相结合时，激活RnaseHⅡ酶发生切割，使扩增反应继续进行，当交叉引物与DNA突变位点不能结合时，扩增反应无法进行；

(4)判断反应物中是否具有目标DNA。

2.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型CPA方法，其特征在于，所述步骤(4)中，以显色法检测反应物中是否具有目标DNA。

3.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型CPA方法，其特征在于，所述交叉引物组包括引物：LoopB、B3、F3、B2和BIP。

4.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型CPA方法，其特征在于，所述反应体系包括缓冲液、硫酸镁、dNTP、Bst酶、RnaseHⅡ酶、LoopB、B3、F3、B2和BIP。

5.根据权利要求1所述的可检测SNP的新型CPA方法，其特征在于，所述反应体系的反应温度为61℃。

6.基于权利要求1所述的可检测SNP的新型CPA方法的用于检测鸡白痢沙门菌的引物组，其特征在于，包括：

LoopB：5′-GCAATATTCTTATGCCTATCAGAGT-3′；

B3：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

F3：5′-ACTATTGCTTGCTATGGAAGAC-3′；

B2：5′-TAACGAACCTGCAACAGCTTTAAT-3′；

BIP：

5′-TGCAACAGCTTTAATACTGCATCAAGTGATGAGATAGAC(RNA碱基)TCTAC-C3 spacer-3′；

所述引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

7.基于权利要求1所述的可检测SNP的新型CPA方法的检测鸡白痢沙门菌的试剂盒，其特征在于，包括反应液，所述反应液包括LoopB、B3、F3、B2和BIP；

LoopB：5′-GCAATATTCTTATGCCTATCAGAGT-3′；

B3：5′-GGCAGTGATGTTCCACAAT-3′；

F3：5′-ACTATTGCTTGCTATGGAAGAC-3′；

B2：5′-TAACGAACCTGCAACAGCTTTAAT-3′；

BIP：

5′-TGCAACAGCTTTAAT-ACTGCATCAAGTGATGAGATAGAC(RNA碱基)TCTAC-C3 spacer-3′；

所述引物组针对鸡白痢沙门菌rfbs基因。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括缓冲液2.5μl、硫酸镁2.0μl、dNTP 2μl、Bst酶1.0μl、RnaseHⅡ酶0.1μl、LoopB+B2 1μl、B3+F3 0.5μl和BIP 3μl。