CN105648054A - 霍乱弧菌荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中霍乱弧菌01型和0139型核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。利用本发明的试剂盒，可快速检测样品中是否存在霍乱弧菌01和0139型核酸。该试剂盒对霍乱弧菌核酸的检测限为10拷贝每反应体系，整个反应可在3-4小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

Description

霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中霍乱弧菌（O1群和O139群）核酸的试剂盒，属于霍乱弧菌的体外诊断领域。

背景技术

霍乱弧菌（Vibriocholerae）是革兰氏阴性菌，菌体如弧状，一端有鞭毛；霍乱弧菌有耐热的O抗原，根据O抗原的不同，分成139个血清型，其中O1群和O139型能引起霍乱流行。

霍乱主要为小肠疾患，人是霍乱弧菌的唯一易感者，经口感染，通过胃到达小肠，借助鞭毛的运动穿透粘膜层，依靠菌毛等黏附因子黏附于黏膜细胞表面，在此繁殖并产生霍乱肠毒素。

霍乱肠毒素致病机理如下：毒素由A和B两个亚单位组成，A亚单位又分为A1和A2两个肽链，两者依靠二硫键连接；A亚单位为毒性单位，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用；B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体；1个毒素分子由一个A亚单位和4-6个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A亚单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内cAMP浓度增高，导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测特异性和敏感性的基础。

本发明分别针对霍乱弧菌O1群和O139群基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-timePCR的方法，用来快速检测样品中是否存在霍乱弧菌O1群和O139群的核酸。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在霍乱弧菌（O1群和O139群），提供一种特异性检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种特异性检测样品中霍乱弧菌核酸的试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含O1和O139群霍乱弧菌特异性扩增位点的重组质粒。

PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1-1和P1-2为针对霍乱弧菌O1群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物，P2-1和P2-2为针对霍乱弧菌O139群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1、2，Probe1为针对霍乱弧菌O1群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，Probe2为针对霍乱弧菌O139群基因组特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中Probe1荧光报告基团X₁为FAM，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，Probe2荧光报告基团X₂为CY5，荧光淬灭基团Y₂为BHQ（见表1）。

表1检测霍乱弧菌的引物和探针序列

本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测霍乱弧菌的应用方法，包括：

试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA2μl，加灭菌水至终体系20μl。

试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。

结果判读：

阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。

样本要求：临床样本类型包括患者腹泻标本和分离培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否则，应将DNA分装后-80℃～-20℃保存。

本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以用于霍乱弧菌的定性检测，同时可以区分O1和O139血清群，但不能检出非霍乱弧菌病原体的核酸；对霍乱弧菌核酸O1群和O139群的检测下限均为100拷贝每反应体系；只需2小时即可完成检测，可为霍乱弧菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。

附图说明

图1和图2分别为单重实时荧光PCR检测霍乱弧菌O1群和O139群阳性标准品的扩增曲线图。从左至右的每组曲线对应浓度依次为2×10⁷-2×10³copies/μl，试剂盒对霍乱弧菌的检测限均为100拷贝每反应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。

图3为双重实时荧光PCR检测体系检测10种细菌基因组DNA的扩增曲线图。10种细菌包括：霍乱弧菌和9种阴性对照微生物。霍乱弧菌出现S型扩增曲线，而其他9种病原微生物未出现S型扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。

引物和TaqMan探针的设计与合成

利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的霍乱弧菌O1和O139血清群基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列。霍乱弧菌O1群检测靶序列为酰基辅酶A还原酶基因，霍乱弧菌O139群检测靶序列为ORF71x8基因；并针对检测靶序列设计和合成引物和探针（见表1）。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，霍乱弧菌O1群的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团；霍乱弧菌O139群的检测探针5’端标记CY5荧光基团，3’端标记BHQ荧光淬灭基团。

检测菌种的准备

本实施例中所使用的霍乱弧菌以及其他阴性对照菌株（副溶血弧菌，鼠疫耶尔森菌，小肠结肠炎耶尔森菌，痢疾志贺菌，福氏志贺菌，大肠杆菌，大肠埃希菌，沙门氏菌，鲍氏志贺菌菌）均购买于中国药品生物制品检定所。

菌株DNA的抽提

选用Qiagen公司QIAampDNAMiniKit（货号：51306）提取菌株DNA。具体步骤参考试剂盒操作说明书。

引物和探针的筛选

采用设计的引物和探针检测提取的霍乱弧菌和阴性对照菌株的基因组DNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。（见序列表，霍乱弧菌O1群(正向引物P1-1、反向引物P1-2和探针Probe1），霍乱弧菌O139群(正向引物P2-1、反向引物P2-2和探针Probe2）)。

标准品的构建与制备

分别利用P1和P2引物扩增霍乱弧菌O1和O139群基因组DNA，将PCR产物克隆至pMD-18T载体，转化DH5a大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算质粒浓度与纯度。然后10倍梯度稀释至2000拷贝每微升，制备霍乱弧菌的阳性标准品。

反应条件优化

对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、Takara聚合酶混合物0.4μl、模板2ul，加灭菌水至终体系20μl。

根据扩增片段长短、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定的循环参数为：94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，40个循环，每个循环在退火阶段采集荧光信号。

在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。

检测限的评价

以上述5中的阳性标准品评价本发明的提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为：2×10⁷copies/μl、2×10⁶copies/μl、2×10⁵copies/μl、2×10⁴copies/μl、2×10³copies/μl，本发明提供的试剂盒对霍乱弧菌O1和O139群核酸的检测下限均为100拷贝每反应体系。

检测特异性的评价

以上述菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对霍乱弧菌O1和O139群基因组DNA进行检测时均可见明确扩增曲线，对上述9种其他咽部常见病原微生物DNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他菌株之间不存在交叉反应。

尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光报告基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBRGreenI等不饱和染料与LCGreen等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测霍乱弧菌的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。

序列表

<110>江苏和创生物科技有限公司

丁,小静

<120>霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(24)

<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测

<400>1

atattgatccgacaagcccaaatg24

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(22)

<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测

<400>2

cgatgttgaggcgaagtttagg22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(24)

<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测

<400>3

tgatgttgtgggataagcaatctt24

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(20)

<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测

<400>4

ctcagcaatgcggtggtcta20

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<222>(1)..(23)

<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测

<400>5

cgccgcaatacgagccccaaggt23

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(26)

<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测

<400>6

aacccgcccttctaatgaacacgcca26

Claims (2)

1.一种用于特异性检测样品中霍乱弧菌核酸的试剂盒，同时用于定性区分O1和O139群，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品；PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：

P1-1：5`-atattgatccgacaagcccaaatg-3`，

P1-2：5`-cgatgttgaggcgaagtttagg-3`，

P2-1：5`-tgatgttgtgggataagcaatctt-3`，

P2-2：5`-ctcagcaatgcggtggtcta-3`，

PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-cgccgcaatacgagccccaaggt-Y<sub>1</sub>-3`，

Probe2：5`-X<sub>2</sub>-aacccgcccttctaatgaacacgcca-Y<sub>2</sub>-3`，

Probe1荧光报告基团X₁为FAM，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse，

Probe2荧光报告基团X₂为CY5，荧光淬灭基团Y₂为BHQ。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA2μl，加灭菌水至终体系20μl。