CN101768633A - O139群霍乱弧菌检测用组合物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种O139群霍乱弧菌检测用组合物、试剂盒和检测方法。该组合物中包含针对产毒型O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb-O139和分泌霍乱毒素的致病毒素基因ctxA的特异性引物。本发明的组合物和试剂盒能够灵敏地检测出样品存在的产毒型O139群霍乱弧菌，其检测下限为1.0×10²拷贝每反应体系。对其基因组DNA的检测敏感度为1.0×10⁰pg每反应体系。

Description

O139群霍乱弧菌检测用组合物、试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及霍乱弧菌的特异性检测用组合物、试剂盒和检测方法，特别涉及O139群霍乱弧菌的特异性检测用组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio chlorae)引起的烈性肠道传染疾病，患者的临床症状常表现为大量米汤状排泄，造成迅速脱水。如不及时治疗，可导致低血容量休克、酸中毒，甚至致人死亡。霍乱弧菌按照血清型可分为多个群，但是并不是所有的群都能引起疾病的流行。其中，能够引起霍乱流行的主要有两种血清型：O1群和O139群(Kaper JB，Morris JG，Levine MM.Cholera.Clin.Microbiol.Rev，1995，8：48-86)。因此在霍乱弧菌的检测中，其血清型分型是有效检测的重要组成部分。

就其致病性检测指标来说，早期研究发现，霍乱的强致病作用主要是因为霍乱弧菌分泌的霍乱毒素导致的腹泻所致。因此在O139群霍乱弧菌引发的霍乱出现之前，一直使用霍乱毒素(cholera toxin，CT)作为检测其病原性的标准。历史上的前7次霍乱流行都由O1群霍乱弧菌引发。在1992年末，在印度出现了由O139群引发的霍乱，并迅速传至周围国家。自从O139群霍乱弧菌引发霍乱爆发以后，并且随着对O139群和O1群霍乱弧菌研究的深入，发现有一些非O139群也非O1群的霍乱弧菌也表达霍乱毒素CT，但是并不会引发霍乱的爆发。同时，在偶然情况下O1和O139群霍乱弧菌由于缺失ctx基因而不表达霍乱毒素，同时也不会引发霍乱的爆发。所以，要准确检测致病性霍乱弧菌的存在需要同时检测两个指标：霍乱毒素CT和血清型指标(Chakraborty S，Mukhopadhyay AK，Bhadra RK，et al.Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae.Appl.Environ.Microbiol，2000，66：4022-4028)。

鉴于霍乱流行的危害性较大，使霍乱弧菌的检测尤为重要。但是传统的弧菌检测法需要先用碱性蛋白胨培养液培养增菌，培养分离出菌株之后才能检测，由于其对菌株培养的需要，使这种传统检测方法并不总是适用。因为霍乱弧菌在严苛的生存条件下，例如抗生素、营养素缺乏、气候寒冷等，就会进入一种可存活但不可培养的状态，不适于基于菌株培养的传统检测方法(Lyon WJ.TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1，O139，non-O1， and non-O139 in pure cultures，raw oysters，and synthetic seawater.Appl.Environ.Microbiol，2001，67：4685-4693)。并且，传统弧菌检测方法耗时较长，不利于对样品的迅速检测处理。由于传统的霍乱弧菌检测方法费时费力，不利于快速检测，并且涉及菌的培养，对于操作人员来说具备一定的危险性，近年来针对霍乱及霍乱毒素的PCR反应快速检测技术开始出现。对于PCR检测来说，引物的选择至关重要，直接影响检测的特异性。如果引物特异性不够，则可能导致检测的假阳性结果或者假阴性结果的出现。另外，对于产毒型霍乱弧菌的检测，单独检测一个基因，往往不足以判断其致病性。2003年Fukushima等利用SYBR荧光染料建立了多重荧光实时PCR检测体系(Hiroshi F，Yoshie T，Ryotaro S.Duplex real-time SYBR Green PCR assays fordetectionof17speciesof foodorwaterbornepathogensinstools. J.Clin.Microbiol，2003，41：5134-5146)，虽然缩短了检测时间和工作量，但是由于采用非毒素基因的单一靶位点检测，用于检测致病菌时，其检测结果存在一定的假阳性率。

对于食品等样品中霍乱弧菌的检测是预防与监测霍乱的重要步骤。并且霍乱弧菌的检测对于患者疾病的确诊与菌株的分型也有重要意义。

发明内容

为了更加准确地特异性检测样品O139群霍乱弧菌的存在，本发明提供一种特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的组合物。该组合物包括下列引物：

上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′(序列号：1)；

下游引物：5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′(序列号：2)。该引物为针对O139群霍乱弧菌基因组O抗原编码基因rfb-O139设计并经预实验筛选出的特异性引物，利用该组合物，可以使用PCR方法特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的存在。

其中，可进一步包括探针：5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA(序列号：3)-荧光淬灭基团-3′。从而使该组合物可适用于荧光实时定量PCR(real time PCR)检测方法，其中所述荧光基团可以是Tet，其荧光淬灭基团可以是ECLIPSE。本领域普通技术人员均知，也可以使用本领域已知的其他荧光基团和荧光淬灭基团标记上述探针。

更进一步地，为了满足既能有效地检测O139群致病性霍乱弧菌、又能同时判断该霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的能力，本发明的一个实施方式提供一种特异性检测样品中产毒型O139群霍乱弧菌的组合物。该组合物中包括下列两对引物：

第一对引物：

上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′；

下游引物：5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′；

第二对引物：

上游引物：5′-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3′(序列号：4)，

下游引物：5′-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3′(序列号：5)。其中第一对引物为针对基因组O抗原编码基因rfb-O139的引物，第二对引物为针对霍乱毒素基因ctxA的引物。使用该组合物，既检测了其基因组O抗原编码基因rfb-O139，又特异性检测了霍乱毒素基因ctxA，所以利用该组合物可以通过PCR方法检测样品中产毒型O139群霍乱弧菌的存在。

并且，上述组合物中可进一步包括探针：5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-荧光淬灭基团-3′和5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT(序列号：6)-荧光淬灭基团-3′。从而使得该组合物和试剂盒可由于通过荧光实时定量PCR检测产毒型O139群霍乱弧菌的存在。其中所述荧光基团和荧光淬灭基团可为Tet和ECLIPSE，或FAM和ECLIPSE。并且，在一个反应体系的不同探针中，使用不同的荧光基团。本领域普通技术人员可根据本领域知识自行选择合适的荧光基团和荧光淬灭基团。

本发明的又一个实施方式提供一种特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的PCR检测试剂盒，其中包括PCR反应体系和上述组合物中的任意一种。优选所述PCR反应体系为实时定量PCR反应体系。其中优选使用TaqMan探针体系进行标记和检测。

本发明进一步提供一种检测样品中O139群霍乱弧菌的方法，使用上述组合物中的任意一种，或上述试剂盒中的任意一种，该方法包括：提取样品中的细菌基因组DNA；使用上述组合物中的任意一种作为反应采用的引物和/或探针，或使用上述试剂盒中的任意一种，用PCR法检测其中目的片段的存在，从而判断样品中O139群霍乱弧菌的存在。可采用本领域技术人员可知的PCR反应条件，优选为：95±2℃预变性超过1min，95±2℃变性超过5s，60±2℃延伸超过10s，共反应超过30个循环，最后可选地在72±2℃下延伸超过2min。当上述PCR法为普通PCR法时，其反应条件进一步优选为：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃延伸1min，共反应40个循环，最后72℃延伸7min。当上述PCR法为实时定量PCR法时，其反应条件进一步优选为：94℃预变性2min，94℃变性10s，60℃延伸30s，共反应45个循环。

上述PCR法中优选使用荧光实时定量PCR法检测。在上述荧光实时定量PCR中，优选使用TaqMan探针法。

本检测体系所检测标本无需活菌，在样品处理的第一步DNA提取的裂解过程中就可使霍乱弧菌迅速死亡，减少了对操作人员的生物危害。本方法无需增菌，整个反应在2小时内完成，大大节省了人力与时间，可用于快速检测。

并且，利用本发明的一些优选实施方式，例如，如上所述同时使用第一对和第二对引物进行PCR时，可以特异性检测样品中的产毒型O139群霍乱弧菌的存在，即，不仅仅能够对样品中的霍乱弧菌分型，而且能够判断其产生霍乱毒素的能力，特异性区分致病性霍乱弧菌和非致病性霍乱弧菌。

在更加优选的实施方式中，采用本发明所述的特异性探针，利用TaqMan实时荧光PCR技术进行检测，该方法由于自动化程度高，无需开盖检测产物，还减少了产物污染的机会。

利用本发明的组合物、试剂盒和/或方法对O139群霍乱弧菌检测时，同时使用针对两个基因(rfb-0139和ctxA)的上述两对引物的普通双重PCR体系的实施方式的检测敏感性达到10²拷贝每反应体系；除了使用上述两对引物，还使用了TaqMan技术，加入上述两个特异性探针的实时荧光双重PCR检测体系的实施方式的检测范围为1×10²至1×10⁹拷贝；采用上述两对引物的普通双重PCR实施方式对O 139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感性达1×10¹pg每反应体系，而实时荧光双重PCR实施方式对O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感性可达1×10⁰pg每反应体系，并且该检测快速简便，整个反应在2小时内完成。

附图说明

图1为普通双重PCR检测敏感度的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为分子量标准，“-”为阴性对照，泳道10⁰～10¹⁰为每个PCR反应所加质粒DNA模板拷贝数分别为10⁰～10¹⁰拷贝每反应体系。

图2为双重实时荧光PCR检测敏感度的扩增曲线图，标识“*”曲线为ctxA荧光检测信号，平滑线为rfb-O139荧光检测信号，由左到右每PCR反应的模板量分别为10⁹～10¹拷贝质粒DNA；水平信号线为阴性对照。

图3为普通双重PCR及实时荧光双重PCR检测体系对O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测图，其中：

(A)M为分子标准，泳道N为阴性对照，泳道1-8为每个PCR反应所加基因组DNA模板数分别为1×10^-2pg至1×10⁵pg每反应体系。(B)标识“*”曲线为ctxA荧光检测信号，平滑线为rfb-O139荧光检测信号；由左到右每PCR反应的模板量分别为10⁹拷贝质粒阳性对照和1×10⁵pg至1×10^-2pg基因组DNA；水平信号线为阴性对照。

图4为说明实时荧光双重PCR检测体系对检测O 139群霍乱弧菌基因组DNA的特异性的图，其中标识“*”曲线为ctxA荧光检测信号，平滑线为rfb-O139荧光检测信号，“+”为1×10⁹拷贝质粒阳性对照每反应体系；“O139”为O139群霍乱弧菌基因组DNA 1×10³pg每反应体系；水平信号线为阴性对照和19种阴性对照菌基因组DNA。

具体实施方式

为了特异性检测O139群霍乱弧菌，发明人选择了O139群霍乱弧菌的基因组O抗原编码基因rfb-O139作为靶标序列，针对该基因设计了特异性引物，并经预实验选择了最具有特异性的一对引物(rfbO139-F和rfbO139-R，见下表1)用于本发明中。

在本发明的一个实施方式中，选择rfbO139-F和rfbO139-R作为特异性引物，用PCR方法检测样品中O139群霍乱弧菌的存在。使用该方法，可特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的基因组O抗原编码基因rfb-O139，进而特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的存在，并且在检测初期就通过裂解使霍乱弧菌死亡，不会对实验操作人员造成威胁。优选使用荧光实时PCR法检测，省去了普通PCR的凝胶电泳等时间，使其检测和分析更加简便，缩短了检测的时间。更优选使用TaqMan技术标记的荧光实时PCR法，使用TaqMan技术时，其探针优选为rfbO139-探针：5′-荧光基团-CgCCgCAATACgAgCCCCAAggT-荧光淬灭基团-3′，该探针为针对该靶标序列特异性探针，增强了检测的特异性。其荧光基团和荧光淬灭基团可以分别是Tet和ECLIPSE。

同时，为了特异性检测产毒型的O 139群霍乱弧菌，发明人又将主要导致霍乱的严重症状一一腹泻的霍乱毒素的基因ctxA作为PCR检测的靶标序列，针对该基因设计了特异性引物。同样，经过预实验筛选，选择出最具有特异性的一对引物(ctxA-F和ctxA-R，见下表1)用于本发明中。

在本发明的另一个实施方式中，同时采用引物rfbO139-F和rfbO139-R，以及引物ctxA-F和ctxA-R，用双重PCR的方法检测样品中产毒型O139群霍乱弧菌的存在。使用该方法，在一次检测中既可以检测O139群霍乱弧菌，又能够判断该菌产生霍乱毒素的能力，可以更准确地特异性检测致病的产毒型O139群霍乱弧菌。优选采用荧光双重实时PCR法检测，更优选采用TaqMan技术标记，所使用的探针为：rfbO139-探针：5′-荧光基团-CgCCgCAATACgAg CCCCAAggT-荧光淬灭基团-3′，和ctxA-探针：5′-荧光基团-TCgTgCCTAAC AAATCCCgTCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′，其中两个探针中使用不同的荧光基团。使用该方法，不仅可以准确地检测致病的产毒型O139群霍乱弧菌，而且其操作更加简便，在加入所需试剂开始反应后，不需再次开盖加样和取样，避免了污染的发生。并且其结果可以直接读出，而不需要后续的诸如凝胶电泳之类的操作，大大节省了检测的时间。而且，这两个探针均为针对相应基因设计的特异性探针，更加增强了其检测的特异性。其中所述荧光基团和荧光淬灭基团对可以是：Tet和ECLIPSE，以及FAM和ECLIPSE。但是并不限于这两对荧光基团和荧光淬灭基团，本领域技术人员可以根据需要选择合适的荧光基团及其对应的荧光淬灭基团。

下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。

引物和TaqMan探针的设计与合成

利用Genbank的Blast工具对O139群霍乱弧菌的ctxA基因与rfb-O139基因序列进行分析，选择其稳定的保守区域作为检测靶标序列，并针对这两个检测靶标序列设计引物和探针(见表1)。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中ctxA基因的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记ELIPSE荧光淬灭基团，rfb-O139基因的检测探针5’端标记Tet荧光基团，3’端标记ECLIPSE荧光淬灭基团。

表1  引物及探针序列

检测菌种的准备

本实施例中所使用的O139群霍乱弧菌灭活疫苗由国家生物制品检定所惠赠。19种其他肠道致病菌或医院感染中常见的致病菌：致病性大肠杆菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、痢疾志贺氏菌、宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、肠炎耶尔森菌、类志贺邻单胞菌、脑膜炎黄杆菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、洋葱伯克霍德菌、绿脓杆菌、伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌由卫生部临床检验中心微生物实验室提供。

实施例1  采用普通PCR法的检测

细菌基因组DNA的抽提

抽提各细菌基因组DNA(TAKARA公司的MiniBEST试剂盒)。利用紫外分光光度计测定各细菌基因组DNA的纯度和浓度，O139群霍乱弧菌基因组DNA用TE缓冲液稀释至1×10⁵pg/μl到1×10^-3pg/μl的梯度标准品，其余19种其他肠道致病菌或医院感染中常见的致病菌的基因组DNA用TE缓冲液稀释至5×10⁴pg/μl，各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。

质粒标准品的构建与制备

采用TA克隆技术构建目的质粒。在经过电泳确认扩增片段分子量后，将rfb-O139和ctxA特异性序列的PCR产物连至pMD18-T载体(日本TaKaRa公司)上，重组阳性克隆培养后抽提质粒(Omega质粒提取试剂盒)，采用pMD18-T载体的RVM引物进行测序(美国Beckman Coulter公司试剂盒)，利用CEQ8000软件进行序列分析，并与原目的序列进行比对。序列完全正确的目的质粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度计)后，用1×TE(pH8.0)TE缓冲液稀释到10¹⁰拷贝/μl作为储存液，-20℃保存备用，使用时连续10倍稀释至浓度在1.0×10^-1拷贝/μl～1.0×10¹⁰拷贝/μl之间，取10μl标准品作为实时定量PCR的模板，使参加每个PCR反应的质粒数形成1个拷贝到10¹⁰拷贝的梯度分布。

普通双重PCR反应条件

普通双重PCR反应体系为25μl，取10×含镁的缓冲液2.5μl，dNTPs(各2.5mmol/L)2μl，25μmol/L引物各0.5μl(终浓度为500nM)，模板DNA 10.0μl，Blend Taq plus DNA聚合酶1.0U，加灭菌水至终体系25μl。PCR循环参数：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃延伸1min，共反应40个循环，最后72℃延伸7min。扩增后取5ul PCR产物在3％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳后用溴化乙锭(EB)染色，并在凝胶成像系统上观察分析，结果见图1和图3A。

实施例2  采用荧光实时定量PCR反应法检测

采用与实施例相同的细菌基因组DNA和质粒标准品，其区别在于所采用的PCR方法为荧光实时定量PCR，并且使用了上述设计并合成的探针。

实时荧光双重PCR反应条件

反应体系为25μl，取10×PCR缓冲液2.5μl、2.5mmol/L各dNTP 2.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、5μmol/L探针各0.5μl、Blend Taq plus DNA聚合酶1U、模板DNA 10ul，加灭菌水至终体系25μl。PCR循环参数：94℃预变性2min，94℃变性10s，60℃延伸30s，共反应45个循环。在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。

实施例1和2的检测体系的检测敏感度的评价

取质粒标准品每反应体系10⁰拷贝至10¹⁰拷贝，或以1×10^-2pg/μl到1×10⁵pg/μl梯度浓度的O139群霍乱弧菌细菌基因组DNA为模板，评价了普通双重PCR与实时双重荧光TaqMan PCR检测体系的检测敏感性，结果参见图1～4。

实施例1中对质粒标准品的检测敏感度

双质粒梯度稀释模板进行普通双重PCR扩增后电泳检测显示，当每反应体系中ctxA基因和rfb-O139基因的质粒DNA模板数降低至1.0×10¹及以下拷贝时，普通PCR反应后电泳图上未出现目的条带，阴性对照也未见扩增条带(图1)。

实施例2中对质粒标准品的检测敏感度

双质粒梯度稀释模板进行实时荧光PCR检测时显示，当反应体系ctxA基因和rfb-O139基因的质粒DNA模板数为10²拷贝以上时，其荧光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)，其检测范围是1.0×10²～1.0×10⁹拷贝每反应体系(图2)。两个靶基因扩增反应的Ct值和模板之间均存在良好的相关性，rfb-O139相关性为0.998，扩增效率达到1.04，ctxA相关性为0.999，扩增效率为0.97。

实施例1中对细菌基因组DNA的检测敏感度

将O139群霍乱弧菌基因组DNA梯度稀释到1×10⁵pg至1×10^-2pg每反应体系时普通双重PCR扩增后电泳检测显示，当基因组DNA梯度稀释至每反应体系1×10⁰pg时普通双重PCR反应后电泳图上未出现ctxA和rfb-O139目的扩增条带(图3A)。

实施例2中对细菌基因组DNA的检测敏感度

用与实施例1相同梯度浓度的基因组DNA进行荧光实时PCR检测时显示，在1.0×10⁰pg及以上时，其荧光信号强度ΔRn高于检测域值(ΔRn＝30)，该结果显示实时荧光双重PCR对O139群霍乱弧菌基因组DNA的检测敏感度比普通双重PCR的检测敏感度高10倍(图3B)。该双重检测体系中，两个靶基因扩增反应的Ct值和模板之间有良好的相关性，ctxA相关性为0.997，扩增效率为1.02，rfb-O139相关性为0.999，扩增效率达到0.97。

检测特异性的评价

以上述19种其他肠道致病菌或医院感染中常见的致病菌的基因组DNA为模板评价了双重TaqMan实时荧光PCR反应体系的特异性。

利用实施例2中所述的体系对O139群霍乱弧菌灭活疫苗基因组DNA的1×10³pg每反应体系进行检测时可见明确的扩增曲线，对上述19种非霍乱弧菌的病原菌基因组DNA的5×10⁵pg每反应体系进行检测时均未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的19种阴性对照菌之间不存在交叉反应。用已知浓度(1.0×10⁹/每反应体系)阳性质粒标准品和阴性对照进行盲检测，未出现假阳性和假阴性结果(图4)。

尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Cy5、HEX、TAMRA、ROX、BHQ、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不饱和染料与LC Green等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测O139群霍乱弧菌的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。

序列表

<110>蔡剑平

<120>O139群霍乱弧菌的特异性检测用组合物和试剂盒

<130>DF10-081416

<160>6

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>tgatgttgtg ggataagcaa tctt 24

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>ctcagcaatg cggtggtcta 20

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>aacccgccct tctaatgaac acgcca 26

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>atgccaagag gacagagtga gt 22

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>tcaaactaat tgaggtggaa acatatcc 28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>霍乱弧菌(Vibrio chlorae)

<400>tcgtgcctaa caaatcccgt ctgagttcct 30

Claims (10)

1.一种用于特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的组合物，其中包括下列引物：上游引物：5′-TgATgTTgTgggATAAgCAATCTT-3′，

下游引物：5′-CTCAgCAATgCggTggTCTA-3′。

2.如权利要求1所述的组合物，其中进一步包括探针：

5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-荧光淬灭基团-3′。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述荧光基团为Tet，所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。

4.如权利要求1所述的组合物，其中进一步包括另一对引物：

上游引物：5′-ATgCCAAgAggACAgAgTgAgT-3′，

下游引物：5′-TCAAACTAATTgAggTggAAACATATCC-3′。

5.如权利要求4所述的组合物，其中进一步包括探针：

5′-荧光基团-AACCCgCCCTTCTAATgAACACgCCA-荧光淬灭基团-3′，和

5′-荧光基团-TCgTgCCTAACAAATCCCgTCTgAgTTCCT-荧光淬灭基团-3′，并且在两个探针中分别使用不同的荧光基团。

6.如权利要求5所述的组合物，其中所述的两对荧光基团和荧光淬灭基团为：Tet和ECLIPSE，以及FAM和ECLIPSE。

7.一种用于特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的试剂盒，其中包括PCR反应体系，和权利要求1～6中任一项所述的组合物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述PCR反应体系为实时定量PCR反应体系。

9.一种特异性检测样品中O139群霍乱弧菌的方法，包括：

提取样品中的细菌基因组DNA；

使用权利要求1～6中任一项所述的组合物，或使用权利要求7或8所述的试剂盒，用PCR法扩增所述细菌基因组DNA；

对PCR反应的结果进行分析。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述PCR法的反应条件为：

95±2℃预变性超过1min，95±2℃变性超过5s，60±2℃延伸超过10s，共反应超过30个循环，最后在72±2℃下延伸超过2min；或

95±2℃预变性超过1min，95±2℃变性超过5s，60±2℃延伸超过10s，共反应超过30个循环。

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