CN103952472B - 用于海豚链球菌lamp-lfd可视化检测的引物和探针及引物和探针的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测的引物和探针及引物和探针的应用，特点是包括三对LAMP的引物gyrB-F3、gyrB-B3；gyrB-FIP，gyrB-BIP；gyrB-LF、gyrB-LB和一条探针gyrB-HP，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1-？EQ？ID？NO.7所示，利用上述的引物和探针，通过LAMP反应体系扩增步骤，探针杂交LAMP反应产物步骤，使用LFD检测步骤实现海豚链球菌的可视化检测并进一步用于试剂盒的制备，优点是具有更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于海豚链球菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测海豚链球菌的引物和探针，尤其是涉及用于海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测的引物和探针及引物和探针的应用。
背景技术
海豚链球菌(Streptococcusiniae)隶属于芽孢杆菌纲(Bacilli)，乳杆菌目(Lactobacillales)，链球菌科(Streptococcaceae)，链球菌属(Streptococcus)。该菌为圆形或近圆形，呈链状或双排列的革兰氏阳性菌，无鞭毛，不形成芽孢，可感染淡水和海水在内的多种野生或人工养殖鱼类，如淡水豚、罗非鱼、海鲈和虹鳟等，也可感染如斑马鱼、非洲丽鱼等观赏鱼类。鱼类感染该菌后，主要表现为脑膜脑炎，该病已成为养殖鱼患病和死亡的重要原因。20世纪90年代以来，该菌在全世界水产养殖产业中的危害逐渐凸显，已成为全球重要鱼类病原菌之一。1997年，全球范围内由该菌造成的损失达1亿美元，而到2001年，全球的经济损失已超过10亿美元。同时，该菌也是一种重要的人兽共患病原菌，人感染后导致菌血症、蜂窝织炎、脑膜炎和关节炎等症状，尤其患有心脏病、肾病、糖尿病和关节炎的病人更易感染。海豚链球菌不仅危害着渔业生产，而且对食品安全和人类健康也构成了严重威胁。因此，需要建立快捷、高效、灵敏的检测技术用于基层检测。
海豚链球菌的检测主要有以生理生化鉴定为主的传统方法、免疫学方法和PCR方法。传统方法操作复杂，费时费力，已远不适于疾病的快速检测。以酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)为代表的免疫学检测技术是目前检测海豚链球菌较常用的手段，但仍具有灵敏度不高的缺陷。灵敏度更高的PCR技术也已成为海豚链球菌的常规检测手段，但由于实验设备要求高，工作环境严格，该方法也仅限于实验室诊断，且容易出现非特异性反应。日本学者Notomi等研发的环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)摆脱了对昂贵仪器的依赖，具有适用于疾病现场检测的重大潜力。其中，使用琼脂糖凝胶电泳法检测LAMP产物的成本较低，但需接触EB等有毒试剂，利用浊度或荧光检测不仅增加了检测成本，而且易产生假阳性，在一定程度上限制了该技术的推广。LAMP-LFD是基于LAMP扩增原理，通过由异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，在横向流动试纸条(lateralflowdipstick，LFD)上完成显色和结果判断，该方法不需要电泳装置和凝胶成像系统，无需EB等有毒试剂，用肉眼即可观察到反应结果。
目前，该技术已成功运用于桃拉病毒(Taurasyndromevirus，TSV)、对虾白斑症病毒(Whitespotsyndromevirus，WSSV)、传染性肌肉坏死病毒(Infectiousmyonecrosisvirus，IMNV)、传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)、鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)，而国内外对于该技术的应用于海豚链球菌的诊断和检测中未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测的引物和探针序列及引物和探针的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、一种用于海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测的引物和探针，根据海豚链球菌gyrB基因序列(GenBank登录号：KC560771.1)设计LAMP-LFD的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：
gyrB-F3：5’-GAAGATGATTCCATTACCGTTG-3’，
gyrB-B3：5’-CTAAATCTTCTCCTACCACACC-3’，
gyrB-FIP：5’-TGAAACCTTATAACCGCCTCCGttttCTGCTGTTGAAACAGTCTTTAC-3’，
gyrB-BIP：5’-GGTCTGCATGGGGTTGGTTttttAACCCGGACATCTAACTGT-3’，
gyrB-LF：5’-TACCTCCAGCATGGAGAACT-3’，
gyrB-LB：5’-TCAGTTGTTAATGCCCTCTCAA-3’，
探针gyrB-HP：5’-GTTTCAGGTGGTCTGCATG-3’，
其中gyrB-FIP的5’端为生物素标记，探针gyrB-HP5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2、一种海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测方法，具体检测方法步骤如下：
(1)根据海豚链球菌gyrB基因序列(GenBank登录号：KC560771.1)进行设计LAMP-LFD方法检测海豚链球菌的引物和探针，其中，引物序列如序列表中SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示，探针序列如序列表中SEQIDNO.7所示；
(2)配置引物工作的LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：gyrB-F3和gyrB-B3各0.2μmol/L，gyrB-FIP和gyrB-BIP各1.6μmol/L，gyrB-LF和gyrB-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1％，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl；
(3)LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61℃-65℃，扩增反应时间为10-90min；
(4)探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的gyrB-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取5μL杂交液加入100μL缓冲液中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的缓冲液中显色，判断LAMP的扩增情况。
上述步骤2中所述的最适反应温度为65℃，最适反应时间为30min。
3、一种海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒，该试剂盒包括LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为gyrB-F3和gyrB-B3各0.2μmol/L，gyrB-FIP和gyrB-BIP各1.6μmol/L，gyrB-LF和gyrB-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1％，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl；以及与所述的LAMP反应体系配合使用的20pmol的gyrB-HP探针，其中，引物序列如序列表中SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示，探针序列如序列表中SEQIDNO.7所示。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.灵敏度高，对海豚链球菌纯培养物的检测灵敏度为8.70×101cfu·mL-1或1.74cfu/反应。
2.特异性强，所用的特异性引物根据海豚链球菌的外膜蛋白基因中的八个不同区域设计，并且还有DNA的特异性探针，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的假阳性问题。
3.检测时间短，扩增反应只需30min，从样品基因组DNA的提取到完成结果判断，整个检测流程仅需70min，比常规PCR检测技术缩短约2h。
4.仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一个水浴锅即可完成检测。
5.操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断。
6.对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。
综上所述，使用本发明的引物和探针采用LAMP-LFD方法对海豚链球菌进行检测，具有更高的便捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于海豚链球菌的早期诊断和检测，可满足基层检测机构和现场疫源地检测的需要。
附图说明
图1为LAMP特异性实验结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2：以海豚链球菌ATCC29178的基因组DNA为模板；3～11：分别以鰤鱼诺卡氏菌ATCC43993、铜绿假单胞菌ATCC9027、溶藻弧菌ATCC33787、单增李斯特菌ATCC19115、鳗弧菌香鱼分离株、金黄色葡萄球菌ATCC6538、嗜水气单胞菌ATCC7966、哈维氏弧菌ATCC33866、恶臭假单胞菌MCCC1A01082的基因组DNA为模板。
图2为LAMP-LFD特异性实验结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2：以海豚链球菌ATCC29178的基因组DNA为模板；3～11：分别以鰤鱼诺卡氏菌ATCC43993、铜绿假单胞菌ATCC9027、溶藻弧菌ATCC33787、单增李斯特菌ATCC19115、鳗弧菌香鱼分离株、金黄色葡萄球菌ATCC6538、嗜水气单胞菌ATCC7966、哈维氏弧菌ATCC33866、恶臭假单胞菌MCCC1A01082的基因组DNA为模板。
图3为LAMP检测的灵敏度结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2～11：浓度依次为8.70×108,8.70×107,8.70×106,8.70×105,8.70×104,8.70×103,8.70×102,8.70×101,8.70×100,8.70×10-1cfu·mL-1的海豚链球菌ATCC29178菌液提取的基因组DNA作为模板。
图4为LAMP-LFD检测的灵敏度结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2～11：浓度依次为8.70×108,8.70×107,8.70×106,8.70×105,8.70×104,8.70×103,8.70×102,8.70×101,8.70×100,8.70×10-1cfu·mL-1的海豚链球菌ATCC29178菌液提取的基因组DNA作为模板。
图5为PCR检测的灵敏度结果。M：100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国)；1：以无菌去离子水作为模板；2～11：浓度依次为8.70×108,8.70×107,8.70×106,8.70×105,8.70×104,8.70×103,8.70×102,8.70×101,8.70×100,8.70×10-1cfu·mL-1的海豚链球菌ATCC29178菌液提取的基因组DNA作为模板。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
LAMP-LFD可视化检测海豚链球菌方法的建立
1.引物设计：根据NCBI中已经公布的海豚链球菌gyrB基因序列(GenBank登录号：KC560771.1)进行设计LAMP-LFD的三对引物序列和一条探针序列，其中引物序列具体如下：
gyrB-F3：5’-GAAGATGATTCCATTACCGTTG-3’，
gyrB-B3：5’-CTAAATCTTCTCCTACCACACC-3’，
gyrB-FIP：5’-TGAAACCTTATAACCGCCTCCGttttCTGCTGTTGAAACAGTCTTTAC-3’，
gyrB-BIP：5’-GGTCTGCATGGGGTTGGTTttttAACCCGGACATCTAACTGT-3’，
gyrB-LF：5’-TACCTCCAGCATGGAGAACT-3’，
gyrB-LB：5’-TCAGTTGTTAATGCCCTCTCAA-3’，gyrB-FIP的5’端为生物素标记；
同时，设计一套探针，能够特异性结合LAMP扩增产物，用于LFD检测，序列如下:
gyrB-HP：5’-GTTTCAGGTGGTCTGCATG-3’，5’端为异硫氰酸荧光素标记。
2.样品DNA制备：采用商品化的试剂盒提取。将海豚链球菌划线接种于BHI固体培养基，30℃培养24～48h，挑取单克隆于BHI液体培养基中，30℃，165r/min培养36h。经平板计数法获得起始菌液的浓度约为8.70×108cfu·mL-1。取上述浓度的菌液1mL按照细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)的步骤提取细菌基因组DNA，溶解于50μL的ddH2O中，作为LAMP和PCR扩增模板。
3.海豚链球菌LAMP反应。
利用步骤1设计的特异性引物，以海豚链球菌基因组DNA为模板进行LAMP扩增。
3.1LAMP反应体系，各成分的终浓度分别为：gyrB-F3和gyrB-B3各0.2μmol/L，gyrB-FIP和gyrB-BIP各1.6μmol/L，gyrB-LF和gyrB-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1％，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl。
3.2LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为61℃-65℃，扩增反应时间为10-90min；其中最适扩增反应温度为65℃，最适扩增反应时间为30min。
4.探针杂交和LFD检测：扩增后将20pmol的gyrB-HP探针加入反应体系中，63℃温育5min，进行杂交，取5μL杂交液加入100μL缓冲液(缓冲液来自MileniaGenLineHybridetect试剂盒，试剂盒品牌：德国MileniaBiotec，产地：德国)中混匀，然后将LFD试纸条浸入加入杂交液的buffer中显色，判断LAMP的扩增情况。如果质控线和检测线位置均出现条带，证明检测结果阳性；如果仅有质控线位置出现条带，证明结果阴性；如果质控线和检测线位置均未出现条带，证明检测失败。同时，上述模板利用常规PCR技术检测，并与本发明LAMP-LFD检测结果比较。
实施例2
上述用于海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测的引物和探针在制备海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒中的应用。该海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测试剂盒包括LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为gyrB-F3和gyrB-B3各0.2μmol/L，gyrB-FIP和gyrB-BIP各1.6μmol/L，gyrB-LF和gyrB-LB各0.4μmol/L，dNTPs1.4mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L，KCl10mmol/L，MgSO46.5mmol/L，(NH4)2SO410mmol/L，TritonX-1000.1％，8UBstDNA聚合酶大片段(NewEnglandBiolabs)和2μL样品模版，加双蒸水使反应体系总体积为25μl；以及与上述LAMP反应体系配合使用的20pmol的gyrB-HP探针，其中引物序列如序列表中SEQIDNO.1-SEQIDNO.6所示，探针序列如序列表中SEQIDNO.7所示。
实施例3
使用本发明的引物和探针进行LAMP-LFD可视化检测的特异性测定
利用所设计的特异性引物和探针，分别以海豚链球菌ATCC29178、鰤鱼诺卡氏菌ATCC43993、铜绿假单胞菌ATCC9027、溶藻弧菌ATCC33787、单增李斯特菌ATCC19115、鳗弧菌香鱼分离株、金黄色葡萄球菌ATCC6538、嗜水气单胞菌ATCC7966、哈维氏弧菌ATCC33866，以及恶臭假单胞菌MCCC1A01082等的基因组DNA为模版，按上述实施例1的步骤3和4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的特异性，双蒸水作为阴性对照。结果如图1和图2所示，利用电泳法(图1)和LFD(图2)都只能从海豚链球菌的基因组DNA样品中扩增获得目的条带，其它样品无扩增条带，说明使用本发明提供的引物和探针进行LAMP-LFD检测，具有良好的特异性。
实施例4
使用本发明的引物和探针进行LAMP-LFD可视化检测的灵敏度测定
采用上述实施例1的步骤2的方法培养细菌，将该原始菌液进行连续10倍浓度梯度稀释，获得8.70×108cfu·mL-1、8.70×107cfu·mL-1、8.70×106cfu·mL-1、8.70×105cfu·mL-1、8.70×104cfu·mL-1、8.70×103cfu·mL-1、8.70×102cfu·mL-1、8.70×101cfu·mL-1、8.70×100,8.70×10-1cfu·mL-1等10个稀释浓度。采用上述实施例1的步骤2的水煮法提取海豚链球菌的基因组DNA，分别作为模板，按上述实施例1的步骤3和4进行LAMP-LFD反应，验证引物和探针的灵敏度，双蒸水作为阴性对照。结果如图3、图4和图5所示，使用本发明提供的引物和探针进行的LAMP-LFD检测的灵敏度为8.70×101cfu·mL-1或1.74cfu/反应(图4)，是LAMP扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测的灵敏度的10倍(图3)，是gyrB-F3和gyrB-B3作为引物建立的常规PCR检测方法的100倍(图5)。
实施例5
用本发明的LAMP-LFD可视化检测人工污染花鲈组织中的海豚链球菌
1.海豚链球菌人工污染及待检测样品基因组DNA提取
取1mL新鲜培养的海豚链球菌ATCC29178菌液(约8.70×108cfu·mL-1)进行10倍浓度梯度稀释至108倍。取健康花鲈的肝脏组织100mg加入1mL无菌水，充分匀浆。分别取浓度为8.70×105、8.70×104、8.70×103、8.70×102、8.70×101cfu·mL-1的菌液各1mL与等体积的肝组织匀浆液混匀。每个浓度平行制备三个样品。取1mL细菌污染的组织样品按实施例1步骤2所述方法提取基因组DNA。各取1μL用于LAMP-LFD和PCR扩增。同时取新培养的哈维氏弧菌菌液(相当于1×105cfu·mL-1)1mL与等体积的肝脏匀浆液混匀，平行制备三个样品，按上述方法提取基因组DNA作为LAMP-LFD和PCR扩增的模板，作为实验对照。健康花鲈的肝脏组织匀浆液作阴性对照。
2.LAMP反应体系配制及反应条件，按照实施例1步骤3进行。
3.LFD显色，检测结果判断，按照实施例1步骤4进行。
结果显示在花鲈组织中等体积污染不同浓度的海豚链球菌后，LAMP-LFD可以从用8.70×103cfu·mL-1污染的肝脏组织中稳定检测到病原，检测灵敏度为4.35×103cfu·mL-1。PCR只能从用8.70×105cfu·mL-1污染的肝脏组织中稳定检测到病原；LAMP-LFD对哈维氏弧菌污染健康花鲈肝脏组织的检测结果为阴性(表1)，特异性良好。
表1利用海豚链球菌和哈维氏弧菌人工污染花鲈组织样品后本发明LAMP-LFD检测和PCR检测结果
注：“+”表示检测结果阳性；“-”表示检测结果阴性。
实施例6
用本发明的LAMP-LFD可视化检测花鲈实际样本中的海豚链球菌
1.花鲈实际样本基因组DNA提取
收集游动缓慢，眼球突出等具明显临床症状的花鲈15条，首先利用传统的细菌分离培养的方法对病原进行分离、鉴定。同时取适量肝脏组织，经试剂盒方法提取DNA。
2.LAMP反应体系配制及反应条件，按照实施例1步骤3进行。
3.LFD显色，检测结果判断，按照实施例1步骤4进行。
结果表明，传统的细菌分离培养方法检测发现15条病鱼样品中有1条感染了海豚链球菌。利用LAMP-LFD和PCR均能从该条感染海豚链球菌的病鱼肝组织中均获得阳性扩增，对其他14条病鱼肝组织的检测结果皆为阴性，检测结果与传统的细菌分离培养方法结果一致。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种用于海豚链球菌LAMP-LFD可视化检测的引物和探针，其特征在于：根据GenBank登录号为KC560771.1的海豚链球菌gyrB基因序列设计LAMP-LFD的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：
gyrB-F3：5’-GAAGATGATTCCATTACCGTTG-3’，
gyrB-B3：5’-CTAAATCTTCTCCTACCACACC-3’，
gyrB-FIP：
5’-TGAAACCTTATAACCGCCTCCGttttCTGCTGTTGAAACAGTCTTTAC-3’，
gyrB-BIP：5’-GGTCTGCATGGGGTTGGTTttttAACCCGGACATCTAACTGT-3’，
gyrB-LF：5’-TACCTCCAGCATGGAGAACT-3’，
gyrB-LB：5’-TCAGTTGTTAATGCCCTCTCAA-3’，
探针gyrB-HP：5’-GTTTCAGGTGGTCTGCATG-3’，
其中gyrB-FIP的5’端为生物素标记，探针gyrB-HP5’端为异硫氰酸荧光素标记。
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Application publication date: 20140730 Assignee: Ningbo Boao Bioengineering Co., Ltd. Assignor: Ningbo Univ. Contract record no.: 2017990000004 Denomination of invention: Primers and probe for streptococcus iniae LAMP-LFD visual detection, and application of primers and probe Granted publication date: 20160608 License type: Common License Record date: 20170106 |
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