CN103276061B - 一种检测布鲁菌的lamp核酸试纸条试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：首先配制LAMP反应体系，包含1倍反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜碱、MgSO₄、FIP引物、BIP引物、LoopF引物、LoopB引物、F3引物、B3引物以及待测样品DNA；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

一种检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒及其应用。

背景技术

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella spp.）引起的一种严重威胁人类健康的全球性重要的人畜共患传染病。布鲁菌可感染人、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状和病理损伤，主要表现为发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，给畜牧业发展和人类健康造成了极大的危害。

迄今，布鲁菌病已波及到世界五大洲，200多个国家中已有170多个国家和地区有人、畜布鲁菌病的存在和流行，约占全世界1/5～1/6的人受布鲁菌病的威胁，每年新发病人约有50万。我国33个省（市区）（包括香港、澳门）中有25个省（市、区）的人、畜有布鲁菌病存在和流行。

布鲁菌是一种革兰氏染色阴性的胞内寄生的细小的杆菌，根据培养特性、氧化代谢和抗原特征、噬菌体裂解特点以及主要宿主等不同，典型的布鲁菌包括6个种（species）20个生物型（biovar），即流产布鲁菌（B.abortus）生物1-9型、马尔他布鲁菌（B.melitensis）生物1-3型、猪布鲁菌（B.suis）生物1-5型、绵羊附睾布鲁菌（B.ovis）、沙林鼠布鲁菌（B.neotomae）、犬布鲁菌（B.canis）。近年来在海洋哺乳动物上还发现了两个新的种，即在海豚和鲸中发现的鲸型海洋种（B.cetaceae）及在海豹中发现的鳍型海洋种（B.pinnipediae）。在田鼠中也发现了新的布鲁菌种，即田鼠布鲁菌（Brucella microti）。

布鲁菌病的快速诊断对于布鲁菌病的防控至关重要，目前我国对布鲁菌病的检疫和监控主要采用的是抗体检测技术，包括虎红平板凝集试验（RBRT）、试管凝集试验（SAT）和补体结合试验（CFT）等。平板凝集和试管凝集试验虽然操作简便、耗时短，但存在假阳性反应，OIE已取消其作为检测布鲁菌抗体的方法；补体结合试验操作繁琐，实验条件和技术水平要求高,难以开展，均不能适应现代快速检验检疫需求。在实际中，对布鲁菌病的最后确诊仍采用布鲁菌常规培养鉴定辅以抗体检测技术，即布鲁菌分离培养、生化鉴定、动物接种、抗体检测方法。但由于常规方法需花费7～10天时间才能完成对布鲁菌的培养与鉴定，检出率低，重复性差，况且还需要严格的培养条件以及实验室操作存在潜在的危险性，加之检测方法繁琐、费时费力，己成为检疫部门的一项沉重负担，越来越不能满足日益发展的贸易的需要。因此。迫切需要建立布鲁菌的新型、快捷、可靠、简便、适合临床应用的检测技术。

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。Hong TC等人（Development and evaluation of a novel loop-mediatedisothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratorysyndrome coronavirus.Clin Microbiol,2004May；42(5):1956-61）于2004年根据LAMP原理设计了实时定量RT-LAMP方法，以快速检测SARS-Cov，结果RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人（Rapid diagnosis ofH5N1avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.VirolMethods.2007May;141(2):173-80.）于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。由于LAMP的扩增产物是白色焦磷酸镁沉淀，用肉眼难以观察，日本已研制出专门对LAMP产物进行实时监控的浊度仪。但是浊度仪的使用不但增加了费用，而且不方便携带；有学者利用往反应后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但是这样观察又必需开盖处理，LAMP扩增的高效性及高敏感性使得产物中含有大量目的片段，开盖添加染料极其容易污染环境。后来，有研究对LAMP方法作进一步改进，在原有LAMP反应试剂的基础上添加钙黄绿素和氯化锰后，可以衍生出另外一种更为简便的可视化LAMP，一步即可完成LAMP扩增及结果判定，LAMP产物无需开盖分析即可用肉眼观察结果。但这种方法因存在假阳性率过高、弱阳性结果的判别不够准确、且钙黄绿素与锰离子的浓度配比体系不稳定等缺点而使该方法的应用推广受到限制。

发明内容

本发明首要目的是提供一具有高灵敏度、高特异性、可视化的、操作方法简单的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，包含引物组和核酸试纸条；

所述的引物组如下所示：

F3：5’-AAGTCTCTCGTAATCGTCTCGG-3’；

P3：5’-CCAGCCTTCCAATCGTCAG-3’；

FIP：5’-Biotin-TACTGGGGAGCTACTTCAACCGGATCTCTGCGACCGCTTTTGC-3’；

BIP：5’-Fitc-GCTGGGCTGGTGGCTATACCGTGATGCTGCCAACGGTGCT-3’；

LoopF：5’-TGTTCCTGGATGGCGTCGG-3’；

LoopB：5’-TGGCTACGGCTGGAACAAGG-3’；

所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；

所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒优选包含上述引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；

所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品；该检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到；

所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，还包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）、甜菜碱（Betaine）溶液；

所述的试剂盒更优选为包含10×反应缓冲液（10×ThermoPol ReactionBuffer）、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的引物LoopF和浓度为10μmol/L的引物LoopB；

所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

（1）配制LAMP反应体系，按终浓度计算，10×反应缓冲液（10×ThermoPolReaction Buffer）为1×/L、链置换DNA聚合酶0.32U/L、dNTP混合物为0.5mmol/L、甜菜碱为1mol/L、MgSO₄为2mmol/L、FIP引物为1.2μmol/L、BIP引物组为1.2μmol/L、F3引物为0.2μmol/L、B3引物为0.2μmol/L、LoopF引物为0.6μmol/L、LoopB引物为0.6μmol/L；待测样品DNA为1.2ng/μL；

（2）反应：将步骤（1）的LAMP反应体系恒温反应，得到的产物用核酸检测试纸条检测，10min后观察结果；

（3）结果判读：直接肉眼判读，

①阴性（－）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现，证明所检测的样本没有布鲁菌感染；

②阳性（＋）：出现两条红色条带，一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内，证明所检测的样本为布鲁菌感染；

③无效：质控区（C）和检测区（T）内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

步骤（2）中所述的恒温反应的时间优选为20～50min；

步骤（2）中所述的恒温反应的温度优选为63℃。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

（1）由于LAMP核酸试纸条检测方法成本低廉，利用Bst DNA polymerase在63℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此，本发明提供的试剂盒使用成本低。

（2）本发明所提供的试剂盒反应迅速，可以在50min内完成反应，最快可以在20min内完成。

（3）本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，无需进行复杂操作。虽然LAMP在DNA扩增过程中产生大量焦磷酸镁沉淀使反应液呈现浑浊，在反应结束后无需琼脂糖凝胶电泳即可直接肉眼观察反应管中浑浊来判断阳性与否，但弱阳性结果仍给判别带来较大困难，如果在引物5’端进行特异性生物标记，然后再用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置对产物进行检测，既可以准确对结果进行直观、快速的判读，又可以防止污染。

（4）本发明提供的试剂盒特异性好，对军团菌、枯草杆菌等都呈阴性反应；灵敏度高，最低可以检测到1pg的DNA模板，与LAMP琼脂糖凝胶电泳方法的检测限一致，比钙黄绿素可视化LAMP检测方法检测限高10倍，而比PCR方法检测限高100倍。即使是几个菌体，也能被快速准确的检测出来。

（5）本发明所述的布鲁菌LAMP核酸试纸条试剂盒可快速、灵敏地检测布鲁菌，无需昂贵仪器，只需一个恒温水浴锅即可完成反应。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

附图说明

图1为LAMP反应体系优化结果图，其中：

A为不同dNTP浓度与电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应dNTP浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM得到的反应产物；

B为不同Betaine浓度与电泳亮度关系图，泳道M为100bp DNA LadderMarker，泳道1～6依次对应Betaine浓度分别为0M、0.5M、1.0M、1.5M、2.0M和2.5M得到的反应产物；

C为不同MgSO₄浓度与电泳亮度关系图，泳道M为100bp DNA LadderMarker，泳道1～8依次对应MgSO₄浓度分别为0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM和6mM得到的反应产物；

D为内外引物浓度不同比例及不同浓度外引物与电泳亮度关系图，泳道M为100bp DNA Ladder Marker，泳道1～6依次对应内引物（BIP+FIP）和外引物（B3+F3）按浓度比为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1和4:1得到的反应产物，其中，泳道1～5外引物浓度为0.2μmol/L，泳道6的外引物浓度为0.4μmol/L；

E为环引物与外引物不同浓度比例与电泳亮度关系图，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～6依次对应环引物（LoopF+LoopB）和外引物（B3+F3）按浓度比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1和6:1得到的反应产物，外引物浓度为0.2μmol/L。

图2为LAMP反应条件优化结果图，其中：

A为不同温度下反应的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～8依次对应反应温度为59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃和66℃的产物；

B为不同反应时间下的电泳亮度关系图，泳道M为DNA Marker DL2000，泳道1～6依次对应反应时间为10min、20min、30min、40min、50min和60min的产物。

图3为本发明提供的LAMP核酸试纸条试剂盒特异性实验中的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中：

M为DNA Marker DL2000；1是以牛布鲁菌S19株基因组为模板的LAMP反应产物；2是以猪布鲁菌S2株基因组为模板的LAMP反应产物；3是以羊布鲁菌M5株基因组为模板的LAMP反应产物；4是以军团菌基因组为模板的LAMP反应产物；5是以枯草杆菌基因组为模板的LAMP反应产物；6是以大肠杆菌基因组为模板的LAMP反应产物；7是以沙门菌基因组为模板的LAMP反应产物；8是以巴氏杆菌基因组为模板的LAMP反应产物；9是以金黄色葡萄球菌基因组为模板的LAMP反应产物；10为阴性对照。

图4为LAMP和PCR的灵敏度检测结果图，其中：

A为紫外条件下钙黄绿素法对本发明提供的LAMP产物检测的结果图；

B为利用本发明提供的LAMP核酸试纸条试剂盒得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的结果图；

C为利用PCR方法得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳得到的图；

图中均为：1的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10倍稀释；2的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10²倍稀释；3的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10³倍稀释；4的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10⁴倍稀释；5的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10⁵倍稀释；6的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10⁶倍稀释；7的模板为牛布鲁菌S19株10ng DNA进行10⁷倍稀释；8为阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所涉及的材料：

①引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Bst DNA聚合酶大片段购自New England公司；甜菜碱（Betaine）和MgSO₄购自Sigma公司；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置购自杭州优思达生物技术有限公司（货号：20120420-32）。胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）购自青岛海博生物技术有限公司。

②牛布鲁氏菌（Brucella abortus）S19株、猪布鲁菌S2株、羊布鲁菌M5株购于中国兽药监察所；

③以下生物材料均已在文献“潘文等,牛布鲁菌与牛分枝杆菌双重PCR方法的建立及应用.华南农业大学学报,2010(4):第100-103+107页.”中公开：军团菌、枯草杆菌、大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌。

实施例1

一、引物设计

根据LAMP引物设计原则，针对布鲁菌omp25基因的保守区域序列，用primer5.0设计一套引物（如表1所示），同时应用Larsergene7.0生物软件的PrimerSelect工具对引物进行初步筛选，保证各引物对之间产生的二聚体较少。通过初步筛选得到理论值最优的一套引物，如表1所示（此时，LoopF和LoopB未进行Biotin和FITC标记），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成10pmol/μL溶液，-20℃避光保存。包括1对外部引物（F3和B3，B3为B3c的互补序列）、1对内部引物（FIP和BIP）和1对环引物（LoopF和LoopB，LoopF为LoopFc的互补序列）。FIP由F1c（F1的互补序列）和F2序列组成；BIP由B1c和B2（B2c的互补序）列组成。由上海生工生物工程技术服务有限公司分别对第一套引物中的FIP引物和LoopF引物的5’端进行Biotin（生物素）标记，再分别对BIP引物和LoopB引物的5’端进行FITC（异硫氰酸荧光素）标记。对FIP和BIP引物标记组和LoopF和LoopB引物标记组分别进行LAMP的空白样品试验，产物用核酸试纸条进行检测。结果发现LoopF和LoopB引物标记组的空白样品核酸试纸条检测呈阳性，而FIP和BIP引物标记组的空白样品呈阴性，所以选用FIP和BIP引物的5’端分别进行Biotin（生物素）和FITC（异硫氰酸荧光素）标记为最佳标记方式（如表1所示）。

表1布鲁菌LAMP核酸试纸条的引物

二、LAMP反应

1、布鲁菌DNA的抽提：

（1）取冻干保存的牛布鲁菌S19株弱毒疫苗株，PBS（pH值为7.4、0.15M磷酸盐缓冲液：KH₂PO₄0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O2.9g、NaCl8g、KCl0.2g）溶解，取50μL接种于5mL TSB培养基中，37℃振荡培养24h。

（2）接种环取一环，在TSB琼脂培养基平板上划线，37℃，5%CO₂条件下培养72h。

（3）挑取单个菌落，接种于5mL TSB液体培养基中，37℃振荡培养48h。

（4）取1mL细菌培养物，4000r/min离心5min收集菌体。

（5）用500μL灭菌超纯水洗涤3次。

（6）以200μL灭菌超纯水重悬沉淀，95℃煮沸5min，12000r/min离心10min,上清即为DNA模板，-20℃保存备用。

2、LAMP检测体系的建立：

参照Notomi等（Notomi，T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28:E63）提供的方法构建25μL LAMP反应体系，依次对dNTP、Betaine、MgSO₄、内引物、外引物、环引物浓度比例进行优化，得到的结果进行琼脂糖凝胶（质量体积比2%）电泳检测。

通过设置不同终浓度的dNTP：0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1A所示）；不同终浓度的Betaine：0M、0.5M、1.0M、1.5M、2.0M、2.5M，其他成分的用量如表2所示（结果如图1B所示）；不同终浓度的MgSO₄：0mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1C所示）；不同终浓度的内引物（FIP+BIP）和外引物（F3+B3）浓度比例及外引物（F3+B3）浓度：2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、4:1，此时具体的引物浓度比为：0.4μM:0.2μM、0.8μM:0.2μM、1.2μM:0.2μM、1.6μM:0.2μM、2.0μM:0.2μM、1.6μM:0.4μM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1D所示）；不同终浓度的环引物（LoopF+LoopB）和外引物（F3+B3）浓度比例：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1，此时具体的引物浓度比为：0.2μM:0.2μM、0.4μM:0.2μM、0.6μM:0.2μM、0.8μM:0.2μM、1.0μM:0.2μM、1.2μM:0.2μM，其他成分的用量如表2所示（结果如图1E所示）。检测条件为63℃恒温50min。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系（25μL）如表2所示。

表2优化的检测体系

3、LAMP检测条件的优化

为了得到最优化的反应温度，将LAMP反应分别置于59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，反应时间是60min，反应体系如表2所示。从多次重复试验中确定最佳反应温度，通过质量体积比2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2A所示，说明最佳反应温度为63℃。

以最佳反应温度（63℃），将反应时间按10min、20min、30min、40min、50min、60min递增，反应体系如表2所示，从多次重复试验中确定最佳反应时间（结果如图2B所示），图2B的结果说明最佳反应时间是50min。优化后的检测条件为63℃恒温50min。

4、检测体系特异性、灵敏性分析

使用牛布鲁菌S19株、猪布鲁菌S2株、羊布鲁菌M5株、军团菌、枯草杆菌、大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板检测体系的特异性，同时以水替代核酸模板设置阴性对照。反应体系如表2所示，反应条件为步骤3确定的优化条件，使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置以及浓度为质量体积比2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测（10min后看结果），得到的结果为：以牛布鲁菌S19株、猪布鲁菌S2株、羊布鲁菌M5株基因组DNA为模板的LAMP反应产物出现两条红色条带，一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内；以军团菌、枯草杆菌、大肠杆菌、沙门菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的基因组和水分别为模板得到LAMP反应产物，仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现。使用琼脂糖凝胶电泳（需时40min）的检测结果（图3）如下：只有以牛布鲁菌S19株、猪布鲁菌S2株、羊布鲁菌M5株基因组DNA为模板LAMP反应产物有目的基因条带。结果显示检测体系的特异性良好，可特异地检测到不同种的布鲁菌，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、省时。

从1mL牛布鲁菌S19株TSB液体培养物中煮沸法提取DNA，在紫外分光光度计上测定其DNA含量（10ng/μL），将DNA进行10倍梯度稀释，将稀释后的样品分别进行LAMP（反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件）、钙黄绿素法可视化LAMP（在表2的反应体系中再加入钙黄绿素（Calcein）（250μmol/L Calcein）和MnCl₂（25mmol/L MnCl₂），各自的终浓度分别为25μmol/L和0.5mmol/L，模板有变化；反应条件为步骤3确定的优化条件）、PCR所使用的引物是：

P1：5′-AAGTCTCTCGTAATCGTCTCGG-3′；

P2：5′-CCAGCCTTCCAATCGTCAG-3′；

取10倍梯度稀释的DNA溶液3μL，以P1和P2为引物进行PCR，具体体系如表3所示：

表3

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTPs(2.5mmol/L)	2μL
P1(10μmol/L)	0.75μL
		P2(10μmol/L)	0.75μL
Ex-Taq(5U/μL)	0.15μL
		cDNA模板（100ng/μL）	3μL
ddH2O补至	25μL

PCR程序如下：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min为一个循环，运行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

比较LAMP核酸试纸条检测试剂盒、钙黄绿素法可视化LAMP、LAMP琼脂糖凝胶电泳、PCR琼脂糖凝胶电泳四种检测方法的灵敏度。结果如图4所示，LAMP核酸试纸条检测试剂盒与LAMP琼脂糖凝胶电泳对布鲁菌基因组DNA的检测限一致，比钙黄绿素法可视化LAMP方法的检测限高10倍，但比PCR琼脂糖凝胶电泳方法高100倍，最低可以检测到1pg的布鲁菌DNA。可见，本发明提供的LAMP核酸试纸条试剂盒灵敏度高，操作更加简单，而且用时更短，结果比较直观，易于检测，无需电泳。

4、检测体系的结果鉴定

①阴性（－）：仅在质控区（C）出现一条红色条带，在检测区（T）内无红色条带出现。证明所检测的样本没有布鲁菌感染；

②阳性（＋）：出现两条红色条带。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。证明所检测的样本为布鲁菌感染。

③无效：质控区（C）和检测区（T）内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含引物组和核酸试纸条；

所述的引物组如下所示：

F3：5’-AAGTCTCTCGTAATCGTCTCGG-3’；

P3：5’-CCAGCCTTCCAATCGTCAG-3’；

FIP：5’-Biotin-TACTGGGGAGCTACTTCAACCGGATCTCTGCGACCGCTTTTGC-3’；

BIP：5’-Fitc-GCTGGGCTGGTGGCTATACCGTGATGCTGCCAACGGTGCT-3’；

LoopF：5’-TGTTCCTGGATGGCGTCGG-3’；

LoopB：5’-TGGCTACGGCTGGAACAAGG-3’。

2.根据权利要求1所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

3.根据权利要求2所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置和权利要求1所述的引物组；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

4.根据权利要求1所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：还包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反应缓冲液、链置换DNA聚合酶、甜菜碱溶液。

5.根据权利要求4所述的检测布鲁菌的LAMP核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含10×反应缓冲液、浓度为8U/L的链置换DNA聚合酶、浓度为2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、浓度为10mol/L的甜菜碱溶液、浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液、浓度为10μmol/L的引物FIP、浓度为10μmol/L的引物BIP、浓度为10μmol/L的引物F3、浓度为10μmol/L的引物B3、浓度为10μmol/L的引物LoopF和浓度为10μmol/L的引物LoopB。