CN103436623A - 一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法，本发明对环介导等温扩增方法进行了改进，能快速检测食品中沙门氏菌活菌，与PCR检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法提高了检测特异性、灵敏度和准确性。与传统LAMP检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法可以区分试样中的活菌和死菌，检测结果更准确，极大降低了假阳性结果的产生，同时传统LAMP检测方法其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，而本发明对传统LAMP检测方法进行了创新，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异性引物，使得检测特异性、灵敏度和准确性有较大的提高。

Description

一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒，还涉及一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒的使用方法，该试剂盒适用于各类食品和食物中毒样品中沙门氏菌的检测。本发明适用于食品生产企业、食品加工企业、超市、农贸市场、水产品批发市场的快速检测及国家相关职能检测机构实验室检测。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella sp.)，革兰氏阴性杆菌，目前已发现2600多种血清型，我国已有200多种，具有内毒素和侵袭能力。由沙门氏菌引起的疾病为常见的人畜共患病人体食入一定数量的活菌会导致食物中毒。在我国细菌性食物中毒中，有70%-80%是由沙门氏菌引起的，而在引起沙门氏菌中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品。2012年8月美国曾爆发因食用了被污染鸡蛋而感染沙门氏菌的食品安全事件。

目前我国国标对于沙门氏菌的检测仍采用传统的先增菌再选择培养最后进行生化鉴定的定性方式。该方法的不足之处在于耗时长、步骤繁琐和无法定量检测。传统方法检测全过程一般需要至少5-7d，才能得到明确的诊断结果。这大大降低了检测效率，严重影响了对沙门氏菌监测的时效性。因此社会对于快速准确沙门氏菌检测方法的需求仍十分迫切。

近年来，有大量研究是基于PCR检测方法，PCR检测方法在操作时间，检测的特异性和灵敏度方面较常规方法均有较大提高，但PCR检测方法需要精密的PCR仪，它的检测时间也较长(2～4h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地快速检测的需求。另外还有一些检测方法，比如免疫色谱法、DNA杂交法，虽然检测灵敏度高，但是所需设备和操作过程比较复杂，也不能满足实地快速检测的需求。

环介导等温扩增法(LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(60～65℃)保温30～60min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

现有技术中已经有沙门氏菌检测试剂盒和检测方法，但在实际使用过程中存在着无法区分沙门氏菌活体菌与死菌，对检测结果影响很大。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种食品中沙门氏菌（Salmonella）活菌的检测试剂盒，能快速检测食品中沙门氏菌活菌，与PCR检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法提高了检测特异性、灵敏度和准确性。与传统LAMP检测方法相比较，PMA-LAMP检测方法可以区分试样中的活菌和死菌，只检测试样中存在的沙门氏菌活菌，结果更准确，极大的降低了假阳性结果产生。同时传统LAMP检测方法其特点是针对靶基因的6个区域设计2对特异性引物，而本发明对传统LAMP检测方法进行了创新，其特点是针对靶基因的6个区域设计3对特异性引物，使得检测特异性、灵敏度和准确性有较大的提高。

本发明的另一个目的是在于提供了一种食品中沙门氏菌活菌的检测试剂盒的使用方法，方法易行，操作简便。通过该方法，可快速、灵敏的检测食品中沙门氏菌活体菌，该方法在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种沙门氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括以下成分：10×反应缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；MgSO₄；引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R；1000×SYBR Green I荧光染料；阳性对照。

10×反应缓冲液配方：200mM Tris-HCl、100mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1.0%(质量

体积比)Tritonx-100。

引物F3：5'CGGCCCGATTTTCTCTGC3'

引物B3：5'CGGCAATAGCGTCACCTT3'

引物FIP：5'GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT3'

引物BIP：5'GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC3'

引物Loop-F：5'GGCCTTCAAATCGGCATCAAT3'

引物Loop-R：5'GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG3'；

阳性对照为：沙门氏菌标准株。一种食品中沙门氏菌活菌的检测试剂盒的使用方法，其步骤是：

（1）冻肉、蛋品、乳品及其他加工均应经过前增菌。以无菌操作取25g(25mL)，加在装有缓冲蛋白胨的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，于36℃±1℃培养4h(干蛋品培养12h～18h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养12h～18h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。

（2）取1mL过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭（PMA）至终浓度为150μg/mL，暗处放置10-15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下4-6min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。

（3）采取DNA快速提取法提取样品中的DNA，即将叠氮溴化丙锭（PMA）处理过的菌液煮沸8-12min，短暂离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增法(LAMP)反应的模板DNA。此方法提取DNA较简单，适用于现场采样检测，无需特殊设备。

沙门氏菌的环介导等温扩增，具体步骤在装有23μL的LAMP反应试剂的200μL PCR管中加入2μL待检DNA，于60-65℃恒温水浴箱放置60min;

扩增结果的检测方法为以下三种之一，方法1：2%（质量体积比）的琼脂糖电泳检测是否产生连续的DNA扩增；方法2：采用浊度仪检测管内浊度变化，可进行实时定量检测；

方法3：反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明解决了现有技术检测沙门氏菌所需周期长、灵敏度低、现有沙门氏菌检测试剂盒无法区分检测样本中沙门氏菌是否是活菌的不足，本专利提供一套快速检测食品中沙门氏菌活体菌的LAMP法检测试剂盒，具有快速、高效、准确性高、灵敏度高、现场应用方便等特点，可广泛适用于食品，卫生，出入境等检测领域。

附图说明

图1为一种沙门氏菌PCR和PMA-LAMP检测结果示意图。

PCR与PMA-LAMP扩增在2%琼脂糖电泳结果。泳道1～9分别以2×10⁹、2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10CFU/mL菌悬液为模板的PCR扩增产物；泳道10为Marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道11～19分别以2×10⁹、2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10CFU/mL菌悬液为模板的LAMP扩增产物。

图2为一种PMA-LAMP特异性检测结果示意图。

PMA-LAMP扩增在2%琼脂糖电泳结果。泳道1为Marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道2～7分别以4株不同血清型沙门氏菌菌悬液（2×10³CFU/mL）为模板的LAMP扩增产物；泳道8～12分别以5株非沙门氏菌的菌悬液（2×10³CFU/mL）为模板的LAMP扩增产物;泳道13为阴性对照。

图3为一种热致死细胞、活细胞的PMA-LAMP扩增示意图。

PMA-LAMP扩增在2%琼脂糖电泳结果。图3A(左):泳道1为Marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道2～5分别为未经过PMA处理的死菌菌悬液（2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL）为模板的LAMP扩增产物。泳道6～9分别为经PMA处理的死菌菌悬液（2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL）为模板的LAMP扩增产物。图3B(右):泳道1为marker(DNA片段大小依次为100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500bp)；泳道2～5分别为未经PMA处理的活菌菌悬液（2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL）为模板的LAMP扩增产物。泳道6～9分别为经PMA处理的活菌菌悬液（2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL）为模板的LAMP扩增产物。

具体实施方式

如未特别说明，本发明实施例中所用的生物手段为本领域人员所熟知的常规生物技术，试剂在常规生化商店购买。

实施例1：

一种沙门氏菌PMA-LAMP检测试剂盒：

该试剂盒包括以下成分：10×反应缓冲液(200mM Tris-HCl、100mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、1.0%（质量体积比）Tritonx-100，pH8.8)、Bst DNA聚合酶(New England BiolabsLTD)、10mM dNTPs(New England Biolabs LTD)、100mM MgSO₄(New England Biolabs LTD)、引物（引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP、引物Loop-F、引物Loop-R）、1.0～2.0mg/mLPMA（Sigma公司），1000×SYBR Green I荧光染料，阳性对照为菌株ATCC14028冻干粉。

表1引物序列表

以上引物有上海生工生物工程有限公司合成。

实施例2：

PMA-LAMP检测试剂盒的使用方法，其步骤如下：

一种食品中沙门氏菌活菌的检测方法，检测方法分为两种情况，第一种情况是现场快速检测，第二种情况是实验室检测。适用于现场快速检测主要步骤分为PMA处理样品，DNA模板快速提取，EAM-LAMP扩增反应。适用于实验室检测主要步骤分为样品富集培养，PMA处理样品，DNA模板快速提取，具体步骤如下：

样品富集培养：冻肉、蛋品、乳品及其他加工均应经过前增菌。以无菌操作取25g(25mL)，加在装有缓冲蛋白胨的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～10000r/min打碎1min，于36℃±1℃培养4h(干蛋品培养18h～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养10h或12或14或16或18h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检测样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。

PMA处理样品：取1mL过夜培养菌液，加入叠氮溴化乙锭（PMA）至终浓度为100～200μM，暗处放置10或12或14或15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下4或5或6min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。

样品DNA模板快速提取：将叠氮溴化丙锭（PMA）处理过的菌液煮沸8或9或10或11或12min，短暂离心，取离心后的上清液为环介导等温扩增法(PMA-LAMP)反应的模板DNA。此方法提取DNA较简单，适用于现场采样检测，无需特殊设备。

沙门氏菌环介导等温扩增，具体步骤如下：PMA-LAMP反应体系（25μL）：在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物（引物FIP和BIP终浓度为1.8μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为1.0μM），DNA模板（检测样本或阳性菌株特征DNA片段质粒）和无RNA酶去离子水。在60～65℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。

PMA-LAMP反应体系包括：

扩增结果的检测方法主要有以下3种，方法1：2%（质量体积比）的琼脂糖电泳检测是否产生连续的DNA扩增；方法2：采用浊度仪检测管内浊度变化，可进行实时定量检测；方法3：反应产物中加入SYBR Green I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。本发明采用方法1和方法3进行检测结果的判定。

方法1适用于实验室检测，方法3适用于现场快速检测。方法1具体步骤如下：待63℃水浴中反应60min后，将反应管放入85℃水浴中温浴10min，使Bst DNA聚合酶失活。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。方法3具体步骤如下：待60～65℃水浴中反应60min后，将反应管放入85℃水浴中温浴10min，使Bst DNA聚合酶失活。向反应管中加入1000×SYBR Green I荧光染料，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。

实施例3：

沙门氏菌环介导等温扩增最佳反应体系：

在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物（引物FIP和BIP终浓度为1.8μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为1.0μM），DNA模板和无RNA酶去离子水。在62℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。

实施例4：

沙门氏菌的PCR检测体系：

根据GenBank公布的沙门氏菌invA基因序列（Accession number:ATCC14028），应用Primer5设计特异性引物。上游引物为F1:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；下游引物F2为：TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，扩增片段长度约为300bp。20μL的扩增体系包括：2μL10×反应液，1μL DNA模板，上下游引物各1μL(0.2μM)，2μL dNTP mixture，1μL Taq酶，1μL25mM MgSO₄，11μL无菌水。PCR反应体系：94℃预变性5min，30个循环，每个循环94℃30s、55℃30s、72℃30s，72℃5min。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。

实施例5：

沙门氏菌LAMP法检测灵敏度试验

挑取沙门氏菌ATCC14028（购于广州省微生物研究所）的单菌落，接种于富集培养基（氯化镁孔雀绿增菌液）中，36℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后的菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取一定量0.1mL菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度为2×10⁹CFU/mL，依次稀释为2×10⁹、2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10CFU/mL的菌悬液，在100℃沸水中煮沸10min，8000r/min离心2min，取上清液作为DNA模板备用。

以上述各稀释浓度的菌悬液上清为DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物（引物FIP和BIP终浓度为1.8μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为1.0μM），DNA模板和无RNA酶去离子水。在62℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。结果验证：当反应体系中存在沙门氏菌DNA时，LAMP法扩增反应会产生大量的、大小不等的DNA重复序列，凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。检测结果如图1所示。由图1可知，LAMP检测沙门氏菌ATCC14028的最低限为2×10CFU/mL。

同时将上述各稀释浓度的菌悬液上清为DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入2μL10×反应液，1μL DNA模板，上下游引物各1μL(0.2μM)，2μL dNTP mixture,1μL Taq酶，1μL25mM MgSO₄,11μL无菌水。PCR反应体系：94℃预变性5min，30个循环，每个循环94℃30s、54℃30s、72℃30s，72℃5min。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。

结果验证：当反应体系中存在沙门氏菌DNA时，PCR法扩增反应会产生特异大小条带，即凝胶上呈现典型的特异电泳条带。检测结果如图1所示。由图1可知，PCR检测沙门氏菌ATCC14028的最低限为2×10³CFU/mL。

实施例6：

沙门氏菌LAMP法检测特异性试验

将4株不同血清型沙门氏菌单菌落，接种于氯化镁孔雀绿增菌液中，36℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后的菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取0.1mL菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度为2×10³CFU/mL。同时将大肠埃希氏菌ATCC8739（购于广州省微生物研究所）、单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115（购于广州省微生物研究所）、副溶血性弧菌ATCC17802（购于广州省微生物研究所）、金黄色葡萄球菌ATCC6538（购于广州省微生物研究所）、铜绿假单胞杆菌ATCC9027（购于广州省微生物研究所）落接种于LB液体培养基（胰化蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。121℃高压（0.115兆帕），灭菌15分钟备用。）中，37℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取一定量菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度为1×10³CFU/mL。分别取上述调整后的菌悬液1mL，加入PMA至终浓度为100～200μg/mL，暗处放置15min，随后将整个EP管暴露在500W卤素灯下5min，卤素灯离样品约15cm。整个光激发过程在冰上进行，以防止温度的升高。将PMA处理过的菌液短暂离心，取上清液为LAMP反应的模板DNA。以上述菌悬液上清为DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物（引物FIP和BIP终浓度为1.8μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为1.0μM），DNA模板和无RNA酶去离子水。在63℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。

结果验证：4株不同血清型不同沙门氏菌在凝胶上呈现典型的梯型电泳条带，5株非沙门氏菌在凝胶上无均无扩增条带，去离子水作为阴性对照，也无扩增条带。上述试验结果表明，4株沙门氏菌均呈阳性反应结果，其他5株非沙门氏菌均为呈阴性反应结果（图2）。

实施例7：

PMA-LAMP鉴别样品中活细胞

挑取沙门氏菌ATCC14028的单菌落，接种于氯化镁孔雀绿增菌液中，36℃、200r/min条件下过夜培养，将过夜培养后的菌体于4000r/min离心5min。菌体沉淀用无菌水洗涤两次，悬浮于无菌水中。取一定量菌悬液做梯度稀释进行平板计数，调整菌悬液浓度依次为2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL，依次取0.5mL菌悬液于1.5mL离心管中，高温（121℃）高压（0.115兆帕）处理15min，将经高压（0.115兆帕）高温（121℃）处理的菌悬液（0.1mL）室温放置冷却至室温（20－25℃）后涂布于弧菌显色培养基平板，36℃培养24h检测是否仍有活菌存在。经过高温高压灭菌后检测后无沙门氏菌ATCC14028活菌存在。将PMA(40mM)依次加入装有0.5mL经过上述热致死沙门氏菌ATCC14028菌悬液(2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL)离心管中，使PMA终浓度为200uM；不加PMA的作为对照。同时将PMA(400μM)依次加入装有0.5mL沙门氏菌活菌(2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL)离心管中，使PMA终浓度为200μM。不加PMA的作为对照。将经PMA处理的菌悬液在暗室中室温放置15min，然后将离心管开盖放置冰上，卤钨灯（500W）约15cm，曝光时间为5min。以试验组1和试验组2处理的菌悬液上清为PMA-LAMP反应的DNA模板，在0.2mL PCR管中依次加入10×ThermopolReaction Buffer2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物（引物FIP和BIP终浓度为1.8μM；引物F3和B3终浓度为0.2μM；引物LF和LB终浓度为1.0μM），DNA模板和无RNA酶去离子水。在62℃水浴中反应60min，在85℃水浴中温浴10min使酶失活。扩增产物在2%（质量体积比）琼脂糖凝胶上120V电泳分离50min，加样量为5μL/上样孔。

结果验证：试验组1试验结果如图3A所示。由图3A可知，热致死细胞的菌悬液经质量浓度为40mM PMA处理后，热致死细胞的DNA的LAMP扩增被完全抑制。而对照组未经PMA处理的细胞DNA的LAMP扩增没有受到影响。试验组2试验结果如图3B所示。由图3B可知，活细胞的菌悬液经浓度为200μM PMA处理后LAMP扩增没有受到影响，在凝胶上呈现典型的梯型电泳条带。

实施例8：

人工污染食品中沙门氏菌检测

挑取沙门氏菌标准菌株ATCC14028至营养肉汤中增菌，36℃±1℃，300r/min摇床培养16-18h，用生理盐水制成菌悬液，依次再用无菌生理盐水10倍梯度稀释至2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²CFU/mL。将检测无沙门氏菌污染的鸡蛋样品按GB/T4789.4-2008方法制成1︰10稀释液。吸取制备好的2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10CFU/mL菌悬液依次加入每一组1︰10稀释液中，混匀，菌悬液浓度依次为2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10CFU/mL，36℃±1℃培养12h～16h后分别按照国家标准方法、PCR检测方法及PMA-LAMP检测方法的检测。按照国家标准方法、PCR检测方法及PMA-LAMP检测方法的检测（表1）。由表1可知，国家标准方法与PMA-LAMP检测方法的检测结果一致。PMA-LAMP检测方法的最低检出限优于国家标准方法和PCR检测方法。

表1人工污染鸡蛋样品中沙门氏菌检测结果

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  湖北省农业科学院质量标准与检测技术研究所

 

<120>  一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法

 

<130>  一种食品中沙门氏菌活菌的快速检测试剂盒及使用方法

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cggcccgatt ttctctgc                                                   18

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cggcaatagc gtcacctt                                                   18

 

 

<210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gcgcggcatc cgcatcaata tgcccggtaa acagatgagt                           40

 

 

<210>  4

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gcgaacggcg aagcgtactg tcgcaccgtc aaaggaac                             38

 

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggccttcaaa tcggcatcaa t                                               21

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gaaagggaaa gccagcttta cg                                              22

 

 

Claims (2)

1.一种沙门氏菌PMA-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

10×反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、10 mM dNTPs、100 mM MgSO₄、40 mM PMA，1000×SYBR Green I 荧光染料和阳性对照沙门氏菌标准株；

引物F3：5^，CGGCCCGATTTTCTCTGC 3^，；

引物B3：5^，CGGCAATAGCGTCACCTT 3^，；

引物FIP：5^，GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT 3^，；

引物BIP：5^，GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC 3^，；

引物Loop-F：5^，GGCCTTCAAATCGGCATCAAT 3^，；

引物Loop-R：5^，GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG 3^，；

所述的10×反应缓冲液配方：200 mM Tris-HCl、100 mM KCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、1.0% m/v Tritonx-100。

2.权利要求1所述沙门氏菌PMA-LAMP检测试剂盒的使用方法，其步骤是：

PMA-LAMP反应体系：在0.2 mL PCR管中依次加入10×Thermopol Reaction Buffer 2.5μL，Bst聚合酶1μL，引物FIP和BIP终浓度为1.8 μM；引物F3和B3终浓度为0.2 μM；引物LF和LB终浓度为1.0 μM，DNA模板和无RNA酶去离子水至25 μL，在60～65℃水浴中反应60 min，在85℃水浴中温浴10 min使酶失活；

引物F3：5^，CGGCCCGATTTTCTCTGC 3^，；

引物B3：5^，CGGCAATAGCGTCACCTT 3^，；

引物FIP：5^，GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACAGATGAGT 3^，；

引物BIP：5^，GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC 3^，；

引物Loop-F：5^，GGCCTTCAAATCGGCATCAAT 3^，；

引物Loop-R：5^，GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG 3^，；

所述的10×反应缓冲液配方：200 mM Tris-HCl、100 mM KCl、10 mM (NH₄)₂SO₄、1.0% m/v Tritonx-100。

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